一种可用于检测创伤弧菌、霍乱弧菌的显色培养基及其制备方法与流程

0.2～5mg/l和多粘菌素e1.0
×
104～1.0
×
106iu/l。上述浓度为显色培养基中各成分的终浓度。
7.所述的基础培养基进一步还含有蛋白胨5～20g/l、牛肉浸粉3～15g/l、异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)0.01～0.2g/l、乳糖0.1～0.3g/l、琼脂10～20g/l。
8.优选，所述β-半乳糖苷酶显色底物为吲哚酚基β-半乳糖苷。
9.优选，所述的吲哚酚基β-半乳糖苷为5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-d-吡喃半乳糖苷或者5-溴-6-氯-3-吲哚基-β-d-吡喃半乳糖苷。
10.优选，所述酸碱指示剂为甲酚红、苯酚红、中性红、溴百里香酚蓝、百里香酚蓝之中的一种或两种之混合物。
11.优选，所述β-半乳糖苷酶显色底物与酸碱指示剂组合方式为：5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-d-吡喃半乳糖苷与甲酚红、苯酚红或中性红，或者5-溴-6-氯-3-吲哚基-β-d-吡喃半乳糖苷与溴百里香酚蓝、百里香酚蓝。
12.优选，所述亚碲酸盐为亚碲酸钾。
13.优选，所述的用于检测创伤弧菌、霍乱弧菌的显色培养基，其基础培养基为蛋白胨10g/l、牛肉浸粉5g/l、氯化钠15g/l、kcl 1.0g/l、mgcl2·
6h2o 1.0g/l、d-纤维二糖10g/l、乳酸链球菌素(nisin)z型0.8g/l、乳糖0.1g/l、异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)0.05g/l、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-d-吡喃半乳糖苷0.07g/l、酸碱指示剂、琼脂15g/l；其添加剂为亚碲酸钾0.5mg/l、万古霉素6mg/l、两性霉素b 2mg/l、多粘菌素e 4.0
×
105iu/l，所述的酸碱指示剂是甲酚红0.07g/l、苯酚红0.02g/l或溴百里香酚蓝0.06g/l。
14.本发明的第二个目的是提供用于检测创伤弧菌、霍乱弧菌的显色培养基的制备方法为：将基础培养基用热浴连续加热或重复间歇式短暂煮沸，并搅拌或摇动，直至完全溶解即可，待其冷却至45～50℃后，加入无菌添加剂，摇匀制得
15.优选，所述的将基础培养基用热浴连续加热或重复间歇式短暂煮沸是将基础培养基用100℃热浴连续加热，或重复间歇式短暂煮沸，沸腾时间合计不超过1min。
16.与现有培养基技术相比，本发明的优势在于：
17.本发明显色培养基具有更高的生长选择性，抑制革兰氏阳性菌生长作用好，也能较好地抑制真菌生长，对创伤弧菌、霍乱弧菌的检测灵敏且特异性更高。并且，本发明显色培养基在制备上无需高压灭菌，易于制备，避免了高含量组分纤维二糖需要制成无菌添加剂后再使用而产生的麻烦。
具体实施方式
18.以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
19.实施例1：
20.一种用于检测创伤弧菌、霍乱弧菌的显色培养基，其基础培养基含有蛋白胨10g/l、牛肉浸粉5g/l、氯化钠15g/l、kcl 1.0g/l、mgcl2·
6h2o 1.0g/l、d-纤维二糖10g/l、乳酸链球菌素(nisin)z型0.8g/l、乳糖0.1g/l、异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)0.05g/l、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-d-吡喃半乳糖苷0.07g/l、甲酚红0.07g/l、琼脂15g/l；其添加剂包括亚碲酸钾0.5mg/l、万古霉素6mg/l、两性霉素b 2mg/l、多粘菌素e 4.0
×
105iu/l，溶剂为水。
21.制备方法是：将蛋白胨10g、牛肉浸粉5g、氯化钠15g、kcl 1.0g、mgcl2·
6h2o 1.0g、d-纤维二糖10g、乳酸链球菌素(nisin)z型0.8g、乳糖0.1g、异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)0.05g、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-d-吡喃半乳糖苷0.07g、甲酚红0.07g、琼脂15g加入到水中，然后定容1l，制得基础培养基，将基础培养基用100℃热浴连续加热或重复间歇式短暂煮沸(沸腾时间合计不超过1min)，并搅拌或摇动，直至完全溶解即可，待其冷却至45～50℃后，加入无菌添加剂亚碲酸钾0.5mg、万古霉素6mg、两性霉素b 2mg、多粘菌素e 4.0
×
105iu，摇匀后倒入无菌平皿，待培养基充分凝固后即可。
22.实施例2：
23.一种用于检测创伤弧菌、霍乱弧菌的显色培养基，其基础培养基含有蛋白胨10g/l、牛肉浸粉5g/l、氯化钠15g/l、kcl 1.0g/l、mgcl2·
6h2o 1.0g/l、d-纤维二糖10g/l、乳酸链球菌素(nisin)z型0.8g/l、乳糖0.1g/l、异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)0.05g/l、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-d-吡喃半乳糖苷0.07g/l、苯酚红0.02g/l、琼脂15g/l；其添加剂包括亚碲酸钾0.5mg/l、万古霉素6mg/l、两性霉素b 2mg/l、多粘菌素e 4.0
×
105iu/l。在制备显色培养基平皿时，将基础培养基用100℃热浴加热或间歇式短暂煮沸(沸腾时间合计不超过1min)，并搅拌或摇动溶解，待其冷却至45～50℃后，加入无菌添加剂，摇匀后倒入无菌平皿，待培养基充分凝固后即可。
24.制备方法是：将蛋白胨10g、牛肉浸粉5g、氯化钠15g、kcl 1.0g、mgcl2·
6h2o 1.0g、d-纤维二糖10g、乳酸链球菌素(nisin)z型0.8g、乳糖0.1g、异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)0.05g、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-d-吡喃半乳糖苷0.07g、苯酚红0.02g、琼脂15g加入到水中，然后定容1l，制得基础培养基，将基础培养基用100℃热浴连续加热或重复间歇式短暂煮沸(沸腾时间合计不超过1min)，并搅拌或摇动，直至完全溶解即可，待其冷却至45～50℃后，加入无菌添加剂亚碲酸钾0.5mg、万古霉素6mg、两性霉素b 2mg、多粘菌素e 4.0
×
105iu，摇匀后倒入无菌平皿，待培养基充分凝固后即可。
25.实施例3：
26.一种用于检测创伤弧菌、霍乱弧菌的显色培养基，其基础培养基含有蛋白胨10g/l、牛肉浸粉5g/l、氯化钠15g/l、kcl 1.0g/l、mgcl2·
6h2o 1.0g/l、d-纤维二糖10g/l、乳酸链球菌素(nisin)z型0.8g/l、乳糖0.1g/l、异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)0.05g/l、5-溴-6-氯-3-吲哚基-β-d-吡喃半乳糖苷0.07g/l、溴百里香酚蓝0.06g/l、琼脂15g/l；其添加剂包括亚碲酸钾0.5mg/l、万古霉素6mg/l、两性霉素b 2mg/l、多粘菌素e 4.0
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105iu/l。在制备显色培养基平皿时，将基础培养基加热煮沸并搅拌或摇动溶解，待其冷却至45～50℃后，加入无菌添加剂，摇匀后倒入无菌平皿，待培养基充分凝固后即可。
27.制备方法是：将蛋白胨10g、牛肉浸粉5g、氯化钠15g、kcl 1.0g、mgcl2·
6h2o 1.0g、d-纤维二糖10g、乳酸链球菌素(nisin)z型0.8g、乳糖0.1g、异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)0.05g、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-d-吡喃半乳糖苷0.07g、溴百里香酚蓝0.06g、琼脂15g加入到水中，然后定容1l，制得基础培养基，将基础培养基用100℃热浴连续加热或重复间歇式短暂煮沸(沸腾时间合计不超过1min)，并搅拌或摇动，直至完全溶解即可，待其冷却至45～50℃后，加入无菌添加剂亚碲酸钾0.5mg、万古霉素6mg、两性霉素b 2mg、多粘菌素e 4.0
×
105iu，摇匀后倒入无菌平皿，待培养基充分凝固后即可。
28.实施例4：不同培养基对细菌、真菌的检测效果对比(见表1和表2)
29.表1.不同培养基对细菌的检测效果对比
[0030][0031][0032]
注：将在碱性蛋白胨水中37℃有氧下培养15-18h的各弧菌菌株和在tsb肉汤中37℃有氧下培养15-18h的各非弧菌细菌划线接种至各培养基后，均于37℃有氧下培养24h；所用mcpc、cc、tcbs培养基为国产市售的并按照其说明配制；“++++++”表示生长良好，1～6个“+”则表示生长受到不同程度的抑制，“+/－”表示生长稀疏或者几乎不生长，“－”表示不生长”。
[0033]
表2.不同培养基对真菌的检测效果对比
[0034][0035][0036]
注：将生长于mea培养基上的各真菌菌苔划线接种至各培养基后，均于28℃有氧下培养5d；所用mcpc、cc、tcbs培养基为国产市售的并按照其说明配制；“+”表示显著生长或者生长成片状，“+/－”表示生长稀疏或者几乎不生长，“－”表示不生长”。
[0037]
从表1结果上看，与已有常用于检测弧菌的tcbs培养基和常用于检测创伤弧菌的mcpc、cc培养基相比，本发明显色培养基显示出对非创伤弧菌、非霍乱弧菌的细菌具有更高的选择性抑制作用，尤其是对革兰氏阳性菌生长抑制作用好，而且对创伤弧菌、霍乱弧菌均具有更高的检测特异性。
[0038]
从表2结果上看，与已有常用于检测弧菌的tcbs培养基和常用于检测创伤弧菌的mcpc、cc培养基相比，本发明显色培养基也显示出对酵母菌、霉菌等真菌具有较好的生长抑制作用。
[0039]
实施例5：不同培养基对创伤弧菌、霍乱弧菌的检测灵敏度对比(见表3)
[0040]
表3.不同培养基对创伤弧菌、霍乱弧菌的检测灵敏度对比
[0041]
[0042][0043]
注：将在碱性蛋白胨水中37℃有氧下培养15-18h的各弧菌菌株，用无菌生理盐水稀释至所需浓度，然后各取0.25ml涂布接种至各培养基后，均于37℃有氧下培养24h；“+”表示有目标菌生长，“－”表示无目标菌生长”。
[0044]
从表3结果上看，对于101～102cfu/ml创伤弧菌atcc 27562，从菌有无生长角度上看本发明的显色培养基在检测灵敏度上与cc培养基相当，这二者均比mcpc、tcbs培养基更优。对于101～102cfu/ml霍乱弧菌，从菌有无生长角度上看本发明显色培养基在检测灵敏度上与cc、tcbs培养基相当，这三者均比mcpc培养基更优。
[0045]
实施例6：应用本发明的显色培养基与国标法对天然样品中创伤弧菌的检测对照(见表4)
[0046]
表4.应用本发明显色培养基与国标法对天然样品中创伤弧菌的检测对照
[0047][0048]
注：从市场上采购海水鱼类(秋刀鱼、三文鱼、大黄鱼、鞍带石斑鱼、多宝鱼)、海水虾类(基围虾、海麻虾、竹节虾、琵琶虾、对虾)和海鲜养殖水样品各5份，应用本发明显色培养基检测创伤弧菌(具体方法参照gb 4789.44-2020，只是培养基为本发明的显色培养基)，按照gb 4789.44-2020国标法分别检测创伤弧菌以作对照，鉴定方法采用maldi-tof-ms。
[0049]
从表4结果上看，对于所采的天然实际样本，应用本发明显色培养基与国标法检测创伤弧菌，检出结果均是一致的。

技术特征：
1.一种用于检测创伤弧菌、霍乱弧菌的显色培养基，其特征在于，包括基础培养基和添加剂；所述基础培养基为：氯化钠10～20g/l、氯化钾0.5～5g/l、氯化镁0.1～6g/l、d-纤维二糖5～25g/l、β-半乳糖苷酶显色底物0.01～0.3g/l、酸碱指示剂0.01～0.1g/l、乳酸链球菌素0.05～2g/l；所述添加剂为亚碲酸盐0.1～3mg/l、万古霉素1～30mg/l、两性霉素b 0.2～5mg/l和多粘菌素e1.0
×
104～1.0
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106iu/l。2.根据权利要求1所述的显色培养基，其特征在于，所述的基础培养基还含有蛋白胨5～20g/l、牛肉浸粉3～15g/l、异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)0.01～0.2g/l、乳糖0.1～0.3g/l、琼脂10～20g/l。3.根据权利要求1或2所述的显色培养基，其特征在于，所述β-半乳糖苷酶显色底物为吲哚酚基β-半乳糖苷。4.根据权利要求3所述的显色培养基，其特征在于，所述的吲哚酚基β-半乳糖苷为5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-d-吡喃半乳糖苷或者5-溴-6-氯-3-吲哚基-β-d-吡喃半乳糖苷。5.根据权利要求1或2所述的显色培养基，其特征在于，所述酸碱指示剂为甲酚红、苯酚红、中性红、溴百里香酚蓝、百里香酚蓝之中的一种或两种之混合物。6.根据权利要求1所述的显色培养基，其特征在于，所述β-半乳糖苷酶显色底物与酸碱指示剂组合方式为：5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-d-吡喃半乳糖苷与甲酚红、苯酚红或中性红，或者5-溴-6-氯-3-吲哚基-β-d-吡喃半乳糖苷与溴百里香酚蓝、百里香酚蓝。7.根据权利要求1所述的显色培养基，其特征在于，所述的亚碲酸盐为亚碲酸钾。8.根据权利要求1所述的显色培养基，其特征在于，所述的用于检测创伤弧菌、霍乱弧菌的显色培养基，其基础培养基为蛋白胨10g/l、牛肉浸粉5g/l、氯化钠15g/l、kcl 1.0g/l、mgcl2·
6h2o 1.0g/l、d-纤维二糖10g/l、乳酸链球菌素(nisin)z型0.8g/l、乳糖0.1g/l、异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)0.05g/l、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-d-吡喃半乳糖苷0.07g/l、酸碱指示剂、琼脂15g/l；其添加剂为亚碲酸钾0.5mg/l、万古霉素6mg/l、两性霉素b 2mg/l、多粘菌素e 4.0
×
105iu/l，所述的酸碱指示剂是甲酚红0.07g/l、苯酚红0.02g/l或溴百里香酚蓝0.06g/l。9.一种权利要求1所述的用于检测创伤弧菌、霍乱弧菌的显色培养基的制备方法，其特征在于，将基础培养基各成分混合后用热浴连续加热或重复间歇式短暂煮沸，并搅拌或摇动，直至完全溶解即可，待其冷却至45～50℃后，加入无菌添加剂，摇匀制得。10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述的将基础培养基用热浴连续加热或重复间歇式短暂煮沸是将基础培养基用100℃热浴连续加热，或重复间歇式短暂煮沸，沸腾时间合计不超过1min。

技术总结
本发明公开了一种用于检测创伤弧菌、霍乱弧菌的显色培养基。包括基础培养基和添加剂；所述基础培养基为：氯化钠10～20g/L、氯化钾0.5～5g/L、氯化镁0.1～6g/L、D-纤维二糖5～25g/L、β-半乳糖苷酶显色底物0.01～0.3g/L、酸碱指示剂0.01～0.1g/L、乳酸链球菌素0.05～2g/L；所述添加剂为亚碲酸盐0.1～3mg/L、万古霉素1～30mg/L、两性霉素B 0.2～5mg/L和多粘菌素E 1.0


技术研发人员：韦献虎 吴清平 叶青华 冯颖 陈谋通 徐环 卢勉飞 张菊梅 杨小鹃 吴诗 张淑红 张友雄 李琦 丁郁 王涓 万强
受保护的技术使用者：广东环凯生物科技有限公司
技术研发日：2023.03.17
技术公布日：2023/7/13