一种鼠源性成分RPA核酸等温扩增引物探针组、试剂盒及其检测方法和应用与流程

一种鼠源性成分rpa核酸等温扩增引物探针组、试剂盒及其检测方法和应用
技术领域
1.本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种鼠源性成分rpa核酸等温扩增引物探针组、试剂盒及其检测方法和应用。


背景技术：

2.食品安全问题是指生物和化学性等因素从原材料到成品各个环节对食品所带来的潜在影响和人类健康造成的危害。食品安全影响因素主要包括食源性致病微生物、掺假造假、农兽药滥用等。然而肉类制品通常经过加工处理后，以肉类形态学为主的传统鉴别手段已无法准确识别肉类制品种类。
3.dna技术可通过检测肉类制品中残留的dna进行动物源性成分分析，判断食品掺假。近年来国家先后发布《gb/t 35917-2018常见动物源性成分快速测定-膜芯片法》、《gb/t 35918-2018动物制品中动物源性检测基因条码技术sanger测序法》、《gb/t 38164-2019常见畜禽动物源性成分检测方法实施荧光pcr法》，对常见动物源性成分的定性检测提供了方法。然而，这些方法，是基于专业设备如膜芯片识读仪、sanger测序仪、实时荧光pcr仪建立的，且检测时间较长，不适合现场快速检测。目前国内外使用rpa核酸等温扩增技术进行鼠源性成分定性检测鲜有报道。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种鼠源性成分rpa核酸等温扩增引物探针组及其检测方法，对鼠cytb基因中高保守特异核酸序列进行扩增，可准确判断样本中是否含鼠源性成分，具有检测时间短、准确可靠的特点。
5.本发明提供了一种鼠源性成分rpa核酸等温扩增引物探针组，包括核苷酸序列如seq id no:1所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no:2所示的反向引物和核苷酸序列如seq id no:3所示的探针。
6.优选的，所述探针的两末端分别修饰有荧光基团和c3 spacer；
7.所述下游引物的一端修饰有生物素。
8.本发明提供了一种基于rpa核酸等温扩增技术鼠源性成分检测试剂盒，包括所述鼠源性成分rpa核酸等温扩增引物探针组和rpa反应液。
9.优选的，还包括样本稀释液和/或侧流层析免疫试纸条。
10.优选的，所述样本稀释液包括ph 8.0、0.05μm tris-hcl的缓冲液或pbs缓冲液。
11.本发明提供了所述鼠源性成分rpa核酸等温扩增引物探针组或所述检测试剂盒在检测鼠源性成分中的应用。
12.本发明提供了一种检测鼠源性成分的方法，包括以下以下步骤：
13.提取待测样本的dna；
14.以提取的dna为模板，采用所述鼠源性成分rpa核酸等温扩增引物探针组进行rpa
核酸等温扩增，得到rpa扩增产物；
15.根据所述rpa扩增产物中有无目标片段判断检测样本中有无无鼠源性成分。
16.优选的，所述rpa核酸等温扩增的反应体系为50μl：abuffer 29.3μl，b buffer 2.5μl，10μm上游引物、10μm下游引物和5μm探针各4μl、dna模板1～100ng、ddh2o补充至50μl。
17.优选的，所述rpa核酸等温扩增的反应条件为37℃孵育10min。
18.优选的，判断所述rpa扩增产物中有无目标片段的方法包括将所述rpa扩增产物中经稀释后滴加到侧流层析免疫试纸条上，当出现两条条带，说明为阳性样本，待测样本中含有鼠源成分；当仅质控线出现一条条带，说明为阴性样本，待测样本中不含鼠源成分或未达到检测阈值。
19.本发明提供了一种鼠源性成分rpa核酸等温扩增引物探针组，包括核苷酸序列如seq id no:1所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no:2所示的反向引物和核苷酸序列如seq id no:3所示的探针。本发明以鼠cytb基因的高保守特异性核酸序列为模板设计一套引物探针，具有良好的检测特异性和较高的检测灵敏度。所述引物探针组结合rpa核酸等温扩增方式进行检测，整个过程仅需30min，大大缩短了检测时间，且在检验过程中无需特殊专业设备，适用于基层的现场快速检测，具有良好的推广价值和应用前景。本设计发明适用于肉类制品中鼠源性成分的快速鉴别。
附图说明
20.图1为引物特异性检测示意图，注：从左至右依次为：鼠、rnase-free水、鸭、猪、牛、鸡、羊、鹅、兔、鸽、鹌鹑、人、马的检测结果；
21.图2为灵敏度检测示意图，注：从左至右依次为：100ng、50ng、10ng、5ng、1ng、0.5ng、0.1ng、rnase-free水的检测结果；
22.图3为肉制品中鼠源性成分检测结果示意图，注：从左至右依次为：羊肉卷、牛肉饼、猪肉片、鼠源dna、rnase-free水的检测结果。
具体实施方式
23.本发明提供了一种鼠源性成分rpa核酸等温扩增引物探针组，包括核苷酸序列如seq id no:1(taacattccgcccaatcacccaaaccctatactga)所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no:2(ttcgataattccggagattggtattaggataagga)所示的反向引物和核苷酸序列如seq idno:3(ctcttcattttaacatgaatcggaggccaaccagt/idsp/gaacacccat，其中idsp表示四氢呋喃，作为核酸外切酶的识别位点)所示的探针。
24.在本发明中，所述探针的两末端分别优选修饰有荧光基团和c3 spacer，更优选为荧光基团修饰在探针的5'端，c3 spacer修饰在探针的3'端。本发明对所述荧光基团的种类没有特殊限制，采用本领域所熟知的荧光基团的种类即可，例如fam。所述c3 spacer修饰以阻止3'端外切酶和3'端聚合酶发挥作用。所述下游引物的一端优选修饰生物素，作用是便于后续扩增产物的检测。本发明对所述引物探针组的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的基因合成方法即可。在本发明实施例中，所述引物探针组委托生工生物工程(上海)股份有限公司公司合成。
25.本发明提供了一种基于rpa核酸等温扩增技术鼠源性成分检测试剂盒，包括所述鼠源性成分rpa核酸等温扩增引物探针组和rpa反应液。
26.在本发明中，所述rpa反应液优选包括abuffer和b buffer，购自北京君诺德生物技术有限公司(beijing genenode biotech co.，ltd，china)。
27.在本发明中，所述检测试剂盒优选还包括样本稀释液和/或侧流层析免疫试纸条。所述样本稀释液优选包括ph 8.0、0.05μm tris-hcl的缓冲液或pbs缓冲液。所述侧流层析免疫试纸条优选为通过纳米金修饰的链霉亲和素识别并结合生物素形成复合物，被固定在检测线上，过量的纳米金修饰的链霉亲和素在质控线上显色，从而得到当扩增产物中含有生物素标记的dna片段时显示两条红色条带，否则显示一条红色条带。所述侧流层析免疫试纸条优选购自杭州傲敏生物科技有限公司。
28.本发明提供了所述鼠源性成分rpa核酸等温扩增引物探针组或所述检测试剂盒在检测鼠源性成分中的应用。
29.本发明提供了一种检测鼠源性成分的方法，包括以下以下步骤：
30.提取待测样本的dna；
31.以提取的dna为模板，采用所述鼠源性成分rpa核酸等温扩增引物探针组进行rpa核酸等温扩增，得到rpa扩增产物；
32.根据所述rpa扩增产物中有无目标片段判断检测样本中有无无鼠源性成分。
33.本发明提取待测样本的dna。
34.本发明对提取dna的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的提取dna的方法即可。在本发明实施例中，所述提取dna的方法优选采用商品试剂盒方法完成。
35.提取完成后，本发明以提取的dna为模板，采用所述鼠源性成分rpa核酸等温扩增引物探针组进行rpa核酸等温扩增，得到rpa扩增产物。
36.在本发明中，所述rpa核酸等温扩增的反应体系优选为50μl：abuffer29.3μl，b buffer 2.5μl，10μm上游引物、10μm下游引物和5μm探针各4μl、dna模板1～100ng、ddh2o补充至50μl。所述rpa核酸等温扩增的反应条件优选为37℃孵育10min。当检测未知样本时优选以鼠源dna作为阳性对照，rnase-free水作为阴性对照。
37.得到rpa扩增产物后，本发明根据所述rpa扩增产物中有无目标片段判断检测样本中有无无鼠源性成分。
38.在本发明中，判断所述rpa扩增产物中有无目标片段的方法优选包括将所述rpa扩增产物中经稀释后滴加到侧流层析免疫试纸条上，当出现两条条带，说明为阳性样本，待测样本中含有鼠源成分；当仅质控线出现一条条带，说明为阴性样本，待测样本中不含鼠源成分或未达到检测阈值。
39.在本发明中，本发明提供的方法具有良好的检测特异性，仅对鼠源样本实现扩增和检测，而对鸭、猪、牛、鸡、羊、鹅、兔、鸽、鹌鹑、人、马11种动物的组织或血液提取dna无法实现扩增，未检测到目标条带。同时本发明提供的方法具有较高的检测准确性，检测10份阳性参考品，检测结果均为阳性，未检出假阴性。此外，本发明提供的方法具有较高检测灵敏度，能准确检测最低0.02ng/μl鼠dna。
40.在本发明中，整个检测仅需30分钟，大大缩短了检测时间。且在检验过程中无需特殊专业设备，适用于基层的现场快速检测，具有良好的推广价值和应用前景。因此，本发明
提供的方法可适用于肉类制品中鼠源性成分的快速鉴别。
41.下面结合实施例对本发明提供的一种鼠源性成分rpa核酸等温扩增引物探针组、试剂盒及其检测方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
42.实施例1
43.一种鼠源性成分rpa核酸等温扩增方法
44.1.引物设计
45.从ncbi中的genbank数据库ky611388.1中下载鼠的细胞色素b(cytochrome b，cytb)基因序列，设计一套引物探针组，如下表1所示。
46.表1引物探针序列信息
[0047][0048]
2.肉类dna提取
[0049]
在样本不同部位进行多点采样混合。取代表性样品放入1.5ml ep管中，加入500μl dna提取液(25％chelex-100，ph＝8.0)，充分混匀，95℃加热10min，冰浴3min，12000r/min离心3min，取上清液(即为dna)进行后续操作。
[0050]
3.rpa核酸等温扩增反应体系
[0051]
按照abuffer29.3μl、引物探针组(上游引物10μm、下游引物10μm、探针5μm)4μl、dna 50ng、h2o补充至47.5μl配置rpa反应预混液，转移至mix tube中，添加b buffer 2.5μl。检测未知样本时需以鼠源dna作为阳性对照，rnase-free水作为阴性对照。
[0052]
4.rpa核酸等温扩增反应
[0053]
将配制反应体系置于37℃下孵育10min。
[0054]
5.检测rpa反应产物
[0055]
取10μl产物于90μl样本稀释液(pbs缓冲液)中，将全部稀释好的产物100μl点到侧流层析免疫试纸条加样区，3min后观察结果。
[0056]
6.检验结果的判断方法
[0057]
阳性(+)：试纸条出现两条红色条带，分别位于质控线(c线)和检测线(t线)。阳性结果表明样本中含有待检测的核酸片段，且其数量不低于检测最低阈值。当目的核酸产物浓度较低时，试纸条c线显色呈红色，t线呈淡红色，甚至浅粉色条带，该结果弱阳性。当目的核酸产物浓度较高时，试纸条c线显色呈红色，t线呈红色，该结果也为阳性。阴性(-)：试纸条质控线(c线)出现一条红色条带，检测线(t线)没有条带。阴性结果表明样本中不含目的
核酸片段，或其数量低于检测限的最低阈值。无效：试纸条质控线(c线)和检测线(t线)均未出现条带，提示所用的试纸条或扩增试剂可能已经损坏、失效或操作有误。
[0058]
7.鼠源性成分rpa核酸等温扩增方法的特异性检测
[0059]
分别提取鸭、猪、牛、鸡、羊、鹅、兔、鸽、鹌鹑、人、马11种动物的组织或血液提取dna，利用鼠源性成分rpa核酸等温扩增体系分别进行检测。结果见图1。鼠源性成分rpa核酸等温扩增体系能特异性的扩增出目的片段，而其他动物样本未得到阳性检测结果。说明本发明提供的检测方法仅能检测鼠源性样本，具有较高的检测特异性。
[0060]
8.准确性检测
[0061]
采用上述方法检测10份阳性鼠源参考品，检测结果均为阳性，未检出假阴性。这说明鼠源性成分rpa核酸等温扩增方法准确性强。
[0062]
9.灵敏度检测
[0063]
本发明设计的鼠源性成分rpa核酸等温扩增方法灵敏度高，检测不同浓度鼠dna(2、1、0.2、0.1、0.02、0.01、0.002ng/μl)，结果显示该方法能准确检测1-100ng鼠dna，试纸条对0.5ng鼠dna检测显示为弱阳性，试纸条未能检测到0.002ng/μl鼠dna。
[0064]
10.本发明可用于肉类制品中鼠源性成分的快速检测
[0065]
对市售羊肉卷、牛肉饼、猪肉片，利用上述鼠源性成分rpa核酸等温扩增方法进行检测，能够判断是否含有鼠源性成分。
[0066]
结果见图3。由图3可知，采用本发明的方法仅对鼠源dna的样本检测得到两条明显的条带，而对羊肉卷、牛肉饼、猪肉片均未检测到两条明显的条带，这表明羊肉卷、牛肉饼、猪肉片不含由鼠源成分。
[0067]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种鼠源性成分rpa核酸等温扩增引物探针组，其特征在于，包括核苷酸序列如seq id no:1所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no:2所示的反向引物和核苷酸序列如seq id no:3所示的探针。2.根据权利要求1所述鼠源性成分rpa核酸等温扩增引物探针组，其特征在于，所述探针的两末端分别修饰有荧光基团和c3 spacer；所述下游引物的一端修饰有生物素。3.一种基于rpa核酸等温扩增技术鼠源性成分检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述鼠源性成分rpa核酸等温扩增引物探针组和rpa反应液。4.根据权利要求3所述检测试剂盒，其特征在于，还包括样本稀释液和/或侧流层析免疫试纸条。5.根据权利要求4所述检测试剂盒，其特征在于，所述样本稀释液包括ph8.0、0.05μm tris-hcl的缓冲液或pbs缓冲液。6.权利要求1或2所述鼠源性成分rpa核酸等温扩增引物探针组或权利要求3～5中任意一项所述检测试剂盒在检测鼠源性成分中的应用。7.一种检测鼠源性成分的方法，其特征在于，包括以下以下步骤：提取待测样本的dna；以提取的dna为模板，采用权利要求1或2所述鼠源性成分rpa核酸等温扩增引物探针组进行rpa核酸等温扩增，得到rpa扩增产物；根据所述rpa扩增产物中有无目标片段判断检测样本中有无无鼠源性成分。8.根据权利要求7所述检测鼠源性成分的方法，其特征在于，所述rpa核酸等温扩增的反应体系为50μl：abuffer 29.3μl，b buffer 2.5μl，10μm上游引物、10μm下游引物和5μm探针各4μl、dna模板1～100ng、ddh2o补充至50μl。9.根据权利要求7所述检测鼠源性成分的方法，其特征在于，所述rpa核酸等温扩增的反应条件为37℃孵育10min。10.根据权利要求7～9中任意一项所述检测鼠源性成分的方法，其特征在于，判断所述rpa扩增产物中有无目标片段的方法包括将所述rpa扩增产物中经稀释后滴加到侧流层析免疫试纸条上，当出现两条条带，说明为阳性样本，待测样本中含有鼠源成分；当仅质控线出现一条条带，说明为阴性样本，待测样本中不含鼠源成分或未达到检测阈值。

技术总结
本发明提供了一种鼠源性成分RPA核酸等温扩增引物探针组、试剂盒及其检测方法和应用，属于基因检测技术领域。本发明提供的鼠源性成分RPA核酸等温扩增引物探针组，核苷酸序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:3所示。本发明利用所述引物探针组对鼠cytb基因中高保守特异核酸序列进行扩增，通过对扩增产物的检测判断鼠源性成分的检测，整个检测仅需30分钟，大大缩短了检测时间，且在检验过程中无需特殊专业设备，适用于基层的现场快速检测，具有良好的推广价值和应用前景。本发明适用于肉类制品中鼠源性成分的快速鉴别。源性成分的快速鉴别。源性成分的快速鉴别。


技术研发人员：郝婷 高冲 李元元 邢庭
受保护的技术使用者：最高人民检察院检察技术信息研究中心
技术研发日：2023.03.07
技术公布日：2023/7/13