一种空腔发夹ThT光核酸开关及其应用

3’，seq id no.17；
11.6h3m2：5
’‑
ttttttcggtttttttcggttttttaaaaaaaaaaaaa aaaaaaaaaaaaaaaaaa-3’，seq id no.18；
12.6h3m3：5
’‑
cggttttttttcggttttttttcggaaaaaaaaaaaaa aaaaaaaaaaaaaaaaaa-3’，seq id no.19。
13.本发明还提供一种包含四环素(tetracycline,tet)双价适配体的空腔发夹序列，序列发夹环为0～10个a碱基的添加构成，且序列二级结构均包含前述的cgg-aaa错配空腔结构，且空腔结构分布在发夹臂的中部或尾部。
14.四环素双价适配体的空腔发夹序列，包括如下所示序列：
15.6h3mm-tet：5
’‑
cggtggtgcggtggtgaaaaaacaccaaaacacc accg-3’，seq id no.23；
16.6h3mt-tet：5
’‑
cggtggtgcggtggtgaaaaaacaccaccgcacca aaa-3’，seq id no.24；
17.6h3md-tet：5
’‑
cggtggtgcggtggtgaaaaaacaccaaaacacc aaaa-3’，seq id no.25；
18.h3md-tet：5
’‑
cggtggtgcggtggtgcaccaaaacaccaaaa-3’，seq id no.32；
19.1h3md-tet：5
’‑
cggtggtgcggtggtgacaccaaaacaccaaaa-3’，seq id no.33；
20.2h3md-tet：5
’‑
cggtggtgcggtggtgaacaccaaaacaccaaaa-3’，seq id no.34；
21.3h3md-tet：5
’‑
cggtggtgcggtggtgaaacaccaaaacaccaaa a-3’，seq id no.35；
22.4h3md-tet：5
’‑
cggtggtgcggtggtgaaaacaccaaaacaccaa aa-3’，seq id no.36；
23.8h3md-tet：5
’‑
cggtggtgcggtggtgaaaaaaaacaccaaaaca ccaaaa-3’，seq id no.37；
24.10h3md-tet：5
’‑
cggtggtgcggtggtgaaaaaaaaaacaccaaa acaccaaaa-3’，seq id no.38。
25.本发明还提供一种空腔发夹tht光核酸开关四环素荧光传感器，包含前述的四环素双价适配体的空腔发夹序列。优选地，序列为seq id no.35所示的序列。
26.本发明还提供一种空腔发夹tht光核酸开关四环素荧光传感器，其对1nm～50μm浓度范围内的四环素具有良好定量检测能力和线性关系，最低检测限达0.64nm。
27.另一方面，本发明提供一种包含黄连素(berberine，bb)荧光适配体空腔发夹序列，包括如下所示序列：
28.h3mm-bb：5
’‑
acataatttaatacggatgttaacataaatattaaa ttatgt-3’,seq id no.28；
29.h3mt-bb：5
’‑
acataacggaatatttatgttaacataaatattaaat tatgt-3’，seq id no.29；
30.h3md-bb：5
’‑
acataacggaatacggatgttaacataaatattaaa ttatgt-3’，seq id no.30。
31.上述序列二级结构均包含1～2个前述的错配空腔结构，且空腔结构分布在发夹臂的中部或尾部。
32.本发明还提供一种空腔发夹tht光核酸开关黄连素比例型传感器，其制备步骤包括：
33.(1)将包含黄连素荧光适配体的空腔发夹序列用超纯水溶解至50～100μm，经pcr仪进行90～98℃，3～10min热解链，自然冷却至室温备用；
34.优选地，将包含黄连素荧光适配体的空腔发夹序列用超纯水溶解至100μm，经pcr仪进行95℃，5min热解链，自然冷却至室温备用；
35.(2)将上述适配体加入到tris-hcl缓冲液中，并向体系中加入待测黄连素溶液，斡旋混匀，室温条件孵育3～30min，检测前向体系中加入tht混匀，室温条件孵育，然后读取荧光；
36.优选地，将上述适配体加入到tris-hcl缓冲液中，并向体系中加入待测黄连素溶液，斡旋混匀，室温条件孵育3min，检测前向体系中加入tht混匀，室温条件孵育，然后读取荧光；
37.(3)结果判定方法为：加入黄连素前后445nm激发波长下，tht与黄连素对应490nm及530nm荧光值做比值(i490/i530)。
38.包含黄连素荧光适配体空腔发夹序列选自上述序列。优选地，选择seq id no.30所示的序列。
39.空腔发夹tht光核酸开关黄连素比例型传感器，对100nm～50μm浓度范围内的黄连素具有良好定量检测能力和线性关系，最低检测限达24.99nm。
40.本发明还提供一种空腔发夹tht光核酸开关黄连素荧光传感器，包含上述黄连素荧光适配体空腔发夹序列。优选地，选择seq id no.30所示的序列。
41.本发明提供的上述空腔发夹序列在激发tht中的应用。
42.本发明还提供包含四环素双价适配体的空腔发夹序列在四环素检测中的应用。
43.本发明还提供包含四环素双价适配体的空腔发夹序列在制备四环素检测试剂盒中的应用。
44.本发明还提供一种空腔发夹tht光核酸开关四环素荧光传感器在四环素检测中的应用。
45.本发明还提供一种空腔发夹tht光核酸开关四环素荧光传感器在制备四环素检测试剂盒中的应用。
46.本发明还提供黄连素荧光适配体空腔发夹序列在黄连素比例型、荧光型检测中的应用。
47.本发明还提供黄连素荧光适配体空腔发夹序列在制备黄连素比例型、荧光型检测试剂盒中的应用。
48.本发明还提供一种空腔发夹tht光核酸开关黄连素比例型传感器在黄连素检测中的应用。
49.本发明还提供一种空腔发夹tht光核酸开关黄连素比例型传感器在制备黄连素检测试剂盒中的应用。
50.本发明还提供一种空腔发夹tht光核酸开关黄连素荧光传感器在黄连素检测中的应用。
51.本发明还提供一种空腔发夹tht光核酸开关黄连素荧光传感器在制备黄连素检测试剂盒中的应用。
52.基于用于tht荧光激发的核酸构象形成因素限制条件多且应用通用性不足等问题，本发明要解决的技术问题为：提供一种新型双链核酸构象，该构象具有强tht荧光激发和装载稳定性、受自身构象形成制约因素少等优点，并可作为核心元件，令tht充当荧光报
告分子，开发用于非酶免标记小分子传感的通用平台。
53.本发明具有的技术效果为：
54.(1)本发明获得cgg-aaa错配空腔结构，其具有tht结合绑定和荧光激发能力。
55.(2)本发明利用cgg-aaa错配空腔结构构建发夹，其可实现对tht的荧光激发相比单链核酸增强17～20倍，比互补双链增强2.5～5倍，比tht自发荧光增强近500倍的效果；具有相比于g-四链体和其他已发现的可激发th t的核酸构象更便利的形成模式。
56.(3)本发明提出一种基于cgg-aaa错配的空腔发夹tht光核酸开关荧光差/比率传感平台，该平台具有良好的发夹靶段序列可编程性，以及对不同小分子物质的检测通用性。
57.(4)本发明无需额外引入荧光标记或酶等荧光显色物质，免去复杂的操作和额外的成本，实现了对四环素和黄连素的非酶免标记传感。
58.(5)本发明可实现在1nm～50μm的浓度范围内的四环素检测，检测限低至640pm；同时，对卡那霉素、氨苄西林、多西环素、土霉素、庆大霉素、氯霉素和林可霉素等几种常见抗生素均无显著非特异性信号变化，传感灵敏、特异性强。
59.(6)本发明可实现在1nm～10μm的浓度范围内的黄连素检测，检测限低至550pm；同时，对黄芩苷、辣椒碱、甜菜碱、大麻二酚、甘氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸、抗坏血酸等几种常见的天然产物和生物活性物质均无显著非特异性信号变化，传感灵敏、特异性强。
60.(7)本发明可在16min内可实现对牛奶样品中四环素残留的快速检测，具有良好的实用价值，便于推广。
61.(8)本发明可在10min内可实现对血浆样品中黄连素残留的快速检测，具有良好的实用价值，便于推广。
附图说明
62.图1为tht和单碱基对(a)、双碱基对(b)、三碱基对(c)、cgg-aaa(d)四种空腔之间的分子对接模拟结果。加深框区代表预期的对接区域，而深色区域代表实际的对接口袋。
63.图2为tht和空腔发卡之间的分子对接结果的受体-配体相互作用2d图。
64.图3为无功能实际序列评估cgg-aaa空腔结构激发tht效果。包含不同数量空腔的双链(a)和发夹(b)对应的二级预测结构。结构对tht/sgi的实际荧光激发能力(c)和电泳结果(d)。
65.图4为双联体结构激发tht效果及自身互补性评估。(a)b-tet、ds-te t和6h-tet的预测二级结构。(b)序列激发的tht荧光强度。(c)序列的sgi荧光强度和电泳结果。
66.图5为携带功能片段的实际序列评估cgg-aaa空腔结构激发tht效果。携带(a)tet和(d)bb适配体对应空腔发夹核酸序列的预测二级结构。携带(b)tet和(e)bb适配体对应空腔发夹核酸序列的tht激发能力。携带(c)tet和(f)bb适配体对应空腔发夹核酸序列的sgi荧光强度和电泳结果。
67.图6为空腔发夹tht光开关发夹环数量优化。(a)含有不同碱基数发夹环的二级预测结构。突出标记为形成环而添加的碱基。(b)发夹的tht激发能力(深色)和响应tet前后的荧光差异(浅色)。(c)发条的sgi荧光强度变化和电泳结果。
68.图7为tet-空腔发夹tht光开关传感体系优化。(a)tht与3h3md-te t的孵育时间优化。(b)tet与3h3md-tet结合的反应时间优化。(c)3h3md-tet与tht的反应比例优化。(d)缓
冲液和离子浓度优化。
69.图8为tet-空腔发夹tht光开关传感器检测能力评估。(a)不同浓度tet介导的tht荧光光谱。实线代表没有tet时的tht荧光曲线。(b)荧光差(i0-if)与tet浓度的对数的线性关系。(c)传感器对干扰物质的响应情况评估。
70.图9为bb和tht在不同激发波长下的发射光谱。
71.图10为bb-空腔发夹tht光开关传感体系优化。(a)tht与h3md-bb的孵育时间优化。(b)bb与h3md-bb结合的反应时间优化。(c)h3md-bb与tht的反应比例优化。(d)缓冲液和离子浓度优化。
72.图11为bb-空腔发夹tht光开关比率型传感器检测能力评估。(a)不同浓度bb介导的tht荧光和bb荧光变化光谱。实线代表没有bb时的t荧光曲线。(b)荧光比(i490/i530)与bb浓度的对数的线性关系。(c)传感器对干扰物质的响应情况评估。
73.图12为bb-空腔发夹tht光开关传感器检测能力评估。(a)不同浓度bb介导的tht荧光光谱。实线代表没有bb时的tht荧光曲线。(b)荧光差(i0-if)与tet浓度的对数的线性关系。(c)传感器对干扰物质的响应情况评估。
具体实施方式
74.本发明公开了一种空腔发夹tht光核酸开关的构建和将其用于小分子非酶免标记传感器及胞内成像平台的开发方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本

技术实现要素：
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
75.实施例1具有tht结合绑定和荧光激发能力的空腔结构的理性设计及分子对接模拟筛选
76.鉴于可激发tht构象的光开关机制，以及dna在转录加工过程中伴随形成的突变和转录鼓泡结构，本实验预探究是否存在潜在的双链错配空腔结构可实现tht分子插入和激发，并基于计算机分子模拟对接进行结构筛选。首先，以a-t碱基互补配对形成的dna发夹为骨架，设计了a-a，a-g和a-c错配碱基对形成的单碱基空腔发夹(序列见表1)，将发夹序列通过mc fold服务器(https://major.iric.ca/mc-pipeline/)预测2d结构后，将二级结构信息经rna composer服务器(http://rnacomposer.ibch.poznan.pl/)转换得到三级结构，进一步通过discovery studio 2021软件将所获得的三级结构u碱基替换为t碱基，得到并输出pdb.格式的dna核酸受体分子，并将其同在pubche m(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)获得的，经过chemoffice软件能量最小化后的tht配体分子在hdock服务器(http://hdock.phys.hust.edu.cn/)进行分子对接，最终将所获结果经discovery studio 2021软件进行分析，以cscore得分评估对接效果。
77.结果见图1a，预期tht与a-a错配腔的结合(加方框区域)没有发生，即该错配模式并不是tht与序列首选的结合位点；而即使tht与a-g和a-c错配腔发生结合，其也并不能完全匹配tht的插入，与腔临位的互补碱基对也同tht发生了相互作用(图2a)。表明单碱基错配空腔并不能完全限制tht的分子扭转。因此，考虑到tht的分子大小和空腔构象的形成稳
定性，本研究认为，可用于tht完全插入和高效荧光激发的空腔尺寸或由2-3个错配碱基对组成。
78.选择具有更优对接效果的a-c，a-g单碱基错配空腔为基础，进行双碱基错配空腔发夹的构建和分子模拟对接(序列见表1，分析方式同上)，分析cscore得分和受体-配体的相互作用，a-c/a-g双碱基错配腔比单碱基错配腔显示出更高的与tht结合可能性，同时tht分子两个环平面与碱基平面平行性更好(图1b，图2)，提示该空腔口袋更适合tht插入。
79.继续，以为a-c/a-g基础，构建三碱基错配腔，图1c及图2显示，三碱基错配腔组中受体-配体相互作用力趋于相似，一方面，对接模式的一致提示在无法消除分子模拟分析随机性的基础上，三碱基错配腔组的对接结果更为可信；另一方面，暗示三碱基错配腔在尺寸上或最适tht坐入，而a-c/a-g/a-g(cgg-aaa)组确实显示出最好的对接结果(图1d，图2)，并用于后续实际序列验证及分析。同时，基于图2作用力分析结果，确定tht的荧光增强得益于cgg-aaa腔的a碱基提供的π-π键和范德华力与tht分子的苯并噻唑环相互作用，以及c和g碱基提供氢键和π-π键的形式与tht二甲基氨基环上的氨基甲基相互作用；进一步，基于a-c(嘌呤-嘧啶)碱基错配的尺寸效应，为tht的插入提供合适口袋，当tht与a-c腔互作后，分子会增强g碱基和对位a碱基之间的作用力碰撞，以促进分子插入式定位，并依托g-a错配起到的类似于“底座”的“支撑”作用，帮助tht更好地与空腔结合，限制其两个环平面的自由旋转，实现荧光增强。
80.表1模拟筛选序列设计
[0081][0082]
实施例2cgg-aaa错配空腔发夹实际序列tht激发能力验证
[0083]
首先，合成以a-t互补配对为基础的，包含0～3个cgg-aaa错配空腔的双链及发夹序列(序列见表2)，并用nupack服务器(http://www.nupack.org/partition/new/)绘制核酸二级结构(图3a，图3b)。将合成序列用超纯水溶解至100μm，经pcr仪进行95℃，5min热解链，自然冷却至室温备用。将序列加入ph＝7.4的10mm tris-hci缓冲液中，至终浓度为1μm，检测前向体系中加入终浓度为2μm的tht，混匀。将100μl检测体系立即置于荧光分光光度计中，选择荧光测量模式，设置发射、激发狭缝宽度为10nm，荧光分子激发波长为445nm，荧光发射光谱监测范围为470-600nm，选择490nm处为最大发射光强度，以验证其对tht的实际激发效果。
[0084]
结果显示，在同空腔数量组中，tht最高荧光发射均由发夹构象激发(图3c)。为此，
通过分析2％琼脂糖凝胶电泳条带及向含有终浓度为1μm的核酸序列(ph＝7.4,10mm tris-hci)缓冲液中加入终浓度为1μm的sybr gre en i(sg i)荧光染料，至总体积为100μl，后置于荧光分光光度计中，选择荧光测量模式，设置发射、激发狭缝宽度为10nm，荧光分子激发波长为497nm，荧光发射光谱监测范围为510-620nm，选择525nm处为最大发射光强度的方式，以验证序列双链结构形成程度。
[0085]
结果表明，同空腔数量组中，发夹相比于双链组，sgi荧光更强，电泳条带更清晰明亮(图3c、图3d)，即发夹环的引入，或有利于两互补臂以比双链更高的概率配对，从而使双链和空腔能更好地形成。
[0086]
进一步地，当双联体构象中只引入一个cgg-aaa错配腔时，发夹的互补性未受到明显影响，且比全互补发夹获得了近2.5倍的tht荧光增强，提示cgg-aaa错配对tht荧光激发的积极作用。随着cgg-aaa错配单元数量的增加，双链的互补性降低。特别是对于双链组，具有2或3个空腔单元的tht荧光强度几乎接近单链ployt(cgg)2/3，暗示双链及空腔形成有限，无法提供更多的tht激发。然而，6h3m2和6h3m3组仍然显示出明显优于相同数量错配单元的双链和单链构象以及互补发夹的荧光增强能力，尽管它们的互补性也受到了不小的影响，并相比于6h3m1折损了对应的tht荧光激发，但依然足以证明cgg-aaa错配腔和发夹环存在的价值。
[0087]
因此，实验结果说明，只要确保双联体结构互补程度，即合理控制空腔单元引入数量，cgg-aaa错配空腔发夹即可实现比全互补双联体结构更优秀的tht荧光激发。
[0088]
表2错配空腔实际验证序列设计
[0089]
[0090][0091]
经非功能性实际序列验证后，进一步选择kwon等人裁剪后的8nt tet单链适配体(包含cgg空腔单元)，尝试进行含cgg-aaa错配腔发夹的搭建。特别是，在搭建过程中，由于原8nt序列为可供tht荧光激发的富含g序列，因此，在搭建过程将8nt短序列延展为16nt的双价适配体，来进一步促进g4的形成，以更好比较g4和空腔对tht的荧光激发效果；同时，设计了互补双链、互补双链发夹，并通过增加空腔设置数量(序列见表2)，以及变换空穴位置的方式，以更好地验证空腔在实际功能性序列中的激发效果。
[0092]
从图4b和4c的结果可以看出，最好的tht荧光激发和双联体的形成都来自于发夹结构(6h-tet)，这再次证实了前文的推断，即发夹环可以更好地将具有互补潜力的双链配对形成双联体结构，以增强tht荧光。
[0093]
由于6h-tet序列含有两个重复的cgg单元，首先探讨了cgg-aaa空腔的位置和数量对tht激发的影响(图5a)。如图5b和5c所示，在中间(6h3mm-tet)或尾部(6h3md-tet)有单个空腔的发夹具有相似的tht荧光强度和发夹互补程度，表明只要发夹互补性不发生明显变化，空腔位置不会过度干扰tht荧光激发。而对于双空腔发夹(6h3md-tet)，虽然互补性程度会受到轻微影响，但仍然可以实现比b-tet强近17倍，比6h-tet近5倍，比单空腔的发夹近1.7倍的tht点亮效果，证明发夹臂处cgg-aaa错配空腔的存在可以有效点亮tht，甚至远远超过有潜力形成g4的单链序列。
[0094]
此外，为了更好地验证空腔的通用性，实验类比6h3md-tet、6h3mt-tet、6h3mm-tet的构建方式，设计了包含黄连素(bb)荧光适配体序列bbr4s3(包含空腔构成基本单元aaa)的发夹序列(序列见表2)(图5d)。对应的荧光激发效果与上述结果很一致(图5e，f)，h3md-bb对tht荧光激发表现出更高的功效。
[0095]
实施例3cgg-aaa错配腔发夹用于四环素传感器的搭建及优化
[0096]
基于实施例2的分析结果表明，发夹环的引入会通过邻位效应促进发夹配对。因此，合成并验证了双价适配体序列在内的，包含2个cgg-aaa错配空腔的，含有不同环碱基数量的发夹序列(序列见表3)，并用nupack服务器(http://www.nupack.org/partition/new/)绘制核酸二级结构(图6a)，以尝试通过优化发夹环的碱基数量的方式，探索最优的互补发夹，从而提高在无靶标时的tht荧光激发，减少分析过程中的背景信号，尽可能实现灵敏检测。特别指出，由于验证应建立在发夹被tet破坏的难易程度一致的条件下，所以在合成序列前，首先应用mcfold预测了不同碱基数量发夹环对应的发夹二级结构，以确保互补的发夹臂和cgg-aaa空腔构象的一致性。发现由0-2个碱基组成的发夹环所引发的发夹配对与其与结构完全不同(图6a)，故未对其进行后续验证。
[0097]
表3tet无标记传感器光核酸开关序列设计
[0098][0099][0100]
研究结果表明，在无tet时，当组成环碱基数增加到6时，sgi荧光的明显下降(图6c)，表明含有3或4个碱基发夹环的发夹互补稳定性最优。相应地，3h3md-tet显示出最优的tht增强以及加入靶标后最明显的荧光变化，尽管10h3md-tet显示出比8h3md-tet更好的tht增强和检测潜力(图6b)，但它可能受益于发夹环中a基的促进作用，导致tht荧光的反弹。因此，3h3md-tet被选择作为tet无标记传感器的空腔发夹tht光核酸开关(cavity hairpin tht-light nucleic acid switches,chtlnas)，并进一步优化了传感器的反应条件。
[0101]
(1)tht插入3h3md-tet空腔的最佳时间优化将热退火后的3h3md-tet序列加入ph＝7.4的10mmtris-hcl缓冲液中，至终浓度为1μm，检测前向体系中加入终浓度为2μm的tht，混匀。将100μl检测体系至于荧光分光光度计内，测量程序选择为荧光动力学扫描模式，设置发射、激发狭缝宽度为10nm，激发波长为445nm，在490nm处采集最大发射光强度，采集时间15min，采集间隔0.02s。结果如图7a所示，tht的荧光强度在加入体系后持续上升，直至8min后没有观察到明显的变化，说明tht可以迅速与发夹结合，并保持体系荧光稳定。
[0102]
(2)四环素孵育时间优化将热退火处理后的3h3md-tet序列加入ph＝7.4的10mmtris-hcl缓冲液中，至终浓度为1μm，向体系中加入终浓度为2μm的tht，斡旋混匀10min
后，先体系中加入终浓度为1μm的tet溶液，将100μl检测体系立即至于荧光分光光度计内，测量程序选择为荧光动力学扫描模式，设置发射、激发狭缝宽度为10nm，激发波长为445nm，在490nm处采集最大发射光强度，采集时间15min，采集间隔0.02s。结果如图7b所示，在向反应体系中加入tet后，荧光迅速下降，而在最初的30秒内观察到两个连续的小峰(图7b插图)，荧光的波动提示tet破坏发夹这一活动与tht结合空腔之间存在的竞争。而曲线在8min的波动下降后，保持不变，故8min被选为tet和序列之间的最佳反应时间。
[0103]
(3)3h3md-tet序列与tht反应体系浓度比优化将热退火处理后的3h3md-tet序列加入ph＝7.4的10mmtris-hcl缓冲液中，至终浓度为1μm，检测前向体系中分别加入终浓度为0.1μm、0.2μm、0.5μm、1μm、2μm、5μm、10μm的tht，混匀。将100μl检测体系立即至于荧光分光光度计中，选择荧光测量模式，设置发射、激发狭缝宽度为10nm，荧光分子激发波长为445nm，在490nm处采集最大发射光强度。结果如图7c显示，当tht浓度从0.1μm增加到2μm时，荧光强度不断增强，而tht浓度的进一步增加，荧光值出现随tht浓度增加而降低的趋势，这表明tht分子在高浓度下倾向于形成二聚体或聚合物，而受到分子结构和尺寸的限制，不能与发夹中的空腔很好地匹配，并激发荧光。提示tht对序列的荧光反应达到饱和，故选择1:2作为后续实验的最佳比例。
[0104]
(4)反应体系及离子浓度优化将热退火处理后的3h3md-tet序列适配体序列分别加入超纯水、ph＝7.4的5、10、20、50、100mm tris-hcl、tris-kcl、tris-nacl、trisl-mgcl2的缓冲液中，至终浓度为1μm，检测前向体系中加入终浓度为2μm的tht，混匀。将100μl检测体系立即至于荧光分光光度计中，选择荧光测量模式，设置发射、激发狭缝宽度为10nm，荧光分子激发波长为445nm，在490nm处采集最大发射光强度。荧光测定结果如图7d所示，发现在10mm tris-hcl缓冲液条件下，表现出了tht最大的荧光强度变化，提示该条件为传感器实现构象自由转换的最适缓冲环境。
[0105]
如图8a所示，在最佳实验条件下探索3h3md-tet的检测性能。在没有tet的情况下，反应体系显示出最强的tht荧光。加入tet后，荧光强度随着tet浓度的增加而降低，并在1nm-50μm范围内，浓度的对数与tet加入前后的tht荧光差(i0-if)之间表现出良好的线性关系(y＝65.26516logx-54.5016，r2＝0.99526)(图8b)，根据公式3σ/k计算传感器的lod为0.64nm。
[0106]
选择1.25μm tet和各12.5μm可能在牛奶中残留的抗生素，即卡那霉素、氨苄青霉素、强力霉素、土霉素、庆大霉素、氯霉素、林可霉素，以研究tet检测的抗干扰性。如图8c所示，常见抗生素残留对检测没有明显的干扰，显示出传感器良好的选择性。
[0107]
将2ml纯牛奶制品用超纯水稀释至5ml，然后，加入2ml 10％的三氯乙酸和2ml氯仿，在涡旋状态下混合1min，以沉淀蛋白质并溶解样品基质中的脂肪和其他有机物质。为了去除蛋白质、脂肪和其他有机物，然后将混合物在20℃下超声处理10min，并在12,000rpm下离心10min以分离沉积物。其次，将上清液转移到另一个离心管中，以12,000rpm离心10min，再次去除沉积物，得到最终的上清液，稀释5倍后，溶解tet，配置加标原液。将不同浓度的加标原液加入到终浓度含有1μm 3h3md-tet，ph＝7.4的10mm tris-hcl缓冲液中，斡旋混匀，室温条件孵育8min，检测前向体系中加入终浓度为2μm的tht，混匀8min，将总体积100μl的检测样品至于荧光分光光度计中，选择荧光测量模式，选择490nm处不同tet浓度牛奶样本中对应tht的荧光值，上述操作进行3次平行重复后，分析带入标准曲线计算回收浓度，获得
回收浓度与实际加标浓度之间的关系。将所得荧光强度值与无靶标条件下tht荧光强度取差值，带入标准曲线，计算得到牛奶样品中残留四环素浓度。获得回收浓度与实际加标浓度之间的关系，见表4。可以看出，该方法的回收率在98.6％～105.8％之间，即传感器的重现性及准确度较好。说明本传感器具备了在实际牛奶样品中检测四环素的能力。
[0108]
表4牛奶样品加标回收
[0109][0110]
实施例4cgg-aaa错配腔发夹用于黄连素传感器的搭建
[0111]
由于构成发夹环的桥接碱基数量会影响发夹臂的互补程度，进而影响传感器的灵敏度，同时，在实施例3中，验证得到的最适发夹环碱基数为3，而在针对黄连素的chtlnas设计中，发现h3md-bb的二级结构在不额外添加任何桥接碱基前，发夹环处已存在2对碱基对无法正常互补，因此，考虑到发夹的互补稳定性及bb加入后介导构象变化的灵活性，研究认为h3md-bb的构象已经最大限度地接近传感器的最适构象条件，无需进一步引入桥接碱基，以免影响荧光反应的敏感性。
[0112]
由于h3md-bb包含bb荧光适配体序列，且tht和bb具备在相同激发波长下同时获得优秀荧光发射的潜力，因此研究致力于构建bb比率型荧光传感器。如图9所示，bb和tht的分别在最适的激发波长下(365nm/445nm)显示出良好的荧光发射，而交换最适激发波长时，两者的荧光发射都非常弱。因此，忽略在445nm的最大激发波长下，bb荧光对tht的荧光影响，同3h3md-tet优化形式，进行传感器的反应条件优化：图10表明，在10mm tris-hcl(ph＝7.4)中，h3md-bb和tht的浓度比为1:2，tht和bb的孵化时间分别为3min和6min，传感器显示了最佳的检测性能。
[0113]
进一步，在保证反应条件一致性的基础上，综合考虑tht和bb在各自最适激发波长下的荧光效果，将tht浓度降低到100nm，于445nm激发波长下，得到了预期的清晰的双峰荧光变化曲线(图11a)，可以看到，随bb浓度增高，tht在490nm处的荧光发射峰减弱，530nm处bb荧光发射峰增强，i490/i530的值逐渐下降，对应比值和bb浓度的对数之间在100nm～50μm之间有明显的线性关系，线性回归方程为y＝-0.44197logx+2.28556，r2＝0.99265(图11b)，lod为24.99nm，显示出基于h3md-bb构建无标签比率荧光传感器的可行性。
[0114]
然而，由于tht和bb的最大发射峰极为接近[(em(max)tht＝490nm，em(max)bb＝530nm)]，且bb的发射峰会随着浓度的降低出现明显的蓝移，表明两种荧光信号间存在干扰。同时，为保证比率传感器双峰的同时出现，不得不降低的tht掺入浓度也一定程度削弱
了传感器的反应灵敏度，而可致使检测范围有限。因此，考虑到荧光变化的敏感性和检测的实用性，选择tht作为传感器的单一信号输出，检测结果如图12a所示，bb浓度越高，tht在490nm处的荧光发射峰就越弱。当bb浓度达到500nm时，荧光曲线变平，提示系统检测能力达到饱和。取490nm处的荧光强度与bb浓度作关系图(图12b)，发现在1nm～10μm的范围内，荧光差(i0-if)和bb浓度对数之间有线性关系(y＝30.556logx+1.467,r2＝0.99756)，lod为0.55nm。
[0115]
选择1.25μm bb和各12.5μm的各种植物提取物，包括黄芩素、辣椒素、甜菜碱、大麻二酚和各种常见的天然生化分子，包括甘氨酸、苏氨酸、酪氨酸和抗坏血酸，研究bb检测的抗干扰性。如图12c所示，与1.25μm的bb相比，12.5μm的天然产物和生物活性物质引发的荧光响应很弱，显示出传感器良好的选择性。
[0116]
将3ml氯仿加入到500μl bb加标后的人血浆中，在涡旋状态下混合2min，后在4,000rpm下离心10min。然后，将有机相转移到一个离心管中，在40℃下，在温和的氮气流中蒸发至干。将残余物重新溶解在由乙腈和水(1:2，v/v)组成的流动相中，涡旋30s，超声处理10min，并在4000rpm下离心5min。上清液被用作最终的样品溶液。将其加入到终浓度含有1μm h3md-tet，ph＝7.4的10mm tris-hcl缓冲液中，斡旋混匀，室温条件孵育6mi n，检测前向体系中加入终浓度为2μm的tht，混匀3min，将总体积100μl的检测样品至于荧光分光光度计中，选择荧光测量模式，选择490nm处不同bb浓度血浆样本中对应tht的荧光值，上述操作进行3次平行重复后，分析带入标准曲线计算回收浓度，获得回收浓度与实际加标浓度之间的关系。将所得荧光强度值与无靶标条件下tht荧光强度取差值，带入标准曲线，计算得到血浆样品中残留的黄连素浓度。获得回收浓度与实际加标浓度之间的关系，见表5。实际添加浓度与回收浓度的关系确定在104.7％～106.4％之间，证实了该方法的可靠性和实用性。
[0117]
表5血浆样品加标回收
[0118][0119][0120]
本发明提供的技术方法中所用试剂或仪器均可由市场购得。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种可激发tht荧光潜力的碱基对错配空腔结构，其特征在于，碱基对错配空腔结构由cgg和aaa错配组成，其中各碱基形成a-c/a-g/a-g的错配空腔结构。2.如权利要求1所述的碱基对错配空腔结构，其特征在于，a-c/a-g/a-g的错配空腔结构，通过构象中a碱基提供的π-π键和范德华力与tht分子的苯并噻唑环相互作用，以及c和g碱基提供氢键和π-π键的形式与tht二甲基氨基环上的氨基甲基相互作用，从而帮助tht更好地与空腔结合，限制其两个环平面的自由旋转，而实现增强荧光。3.如权利要求1或2所述的碱基对错配空腔结构，其特征在于，cgg组成的连续核苷酸和aaa组成的连续核苷酸在同一核苷酸链上，形成发卡结构。4.一种空腔发夹序列，其特征在于，所述序列如下：a-c/a-g/a-g：5
’‑
ttttcggttttaaaaaaaaaaaaaaaaa-3’，seq id no.10；6h3m1：5
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tttttttttttcggtttttttttttaaaaaaaaaaaaaa aaaaaaaaaaaaaaaaa-3’，seq id no.17；6h3m2：5
’‑
ttttttcggtttttttcggttttttaaaaaaaaaaaaa aaaaaaaaaaaaaaaaaa-3’，seq id no.18；6h3m3：5
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cggttttttttcggttttttttcggaaaaaaaaaaaaa aaaaaaaaaaaaaaaaaa-3’，seq id no.19。5.一种包含四环素双价适配体的空腔发夹序列，其特征在于，所述序列发夹环为0～10个a碱基的额外添加构成，且序列二级结构均包含1～2个权利要求1所述的cgg-aaa错配空腔结构，且空腔结构分布在发夹臂的中部或尾部。6.如权利要求5所述的空腔发夹序列，其特征在于，所述序列如下：6h3mm-tet：5
’‑
cggtggtgcggtggtgaaaaaacaccaaaacacc accg-3’，seq id no.23；6h3mt-tet：5
’‑
cggtggtgcggtggtgaaaaaacaccaccgcacca aaa-3’，seq id no.24；6h3md-tet：5
’‑
cggtggtgcggtggtgaaaaaacaccaaaacacc aaaa-3’，seq id no.25；h3md-tet：5
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cggtggtgcggtggtgcaccaaaacaccaaaa-3’，s eq id no.32；1h3md-tet：5
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cggtggtgcggtggtgacaccaaaacaccaaaa-3’，seq id no.33；2h3md-tet：5
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cggtggtgcggtggtgaacaccaaaacaccaaaa-3’，seq id no.34；3h3md-tet：5
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cggtggtgcggtggtgaaacaccaaaacaccaaa a-3’，seq id no.35；4h3md-tet：5
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cggtggtgcggtggtgaaaacaccaaaacaccaa aa-3’，seq id no.36；8h3md-tet：5
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cggtggtgcggtggtgaaaaaaaacaccaaaaca ccaaaa-3’，seq id no.37；10h3md-tet：5
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cggtggtgcggtggtgaaaaaaaaaacaccaaa acaccaaaa-3’，seq id no.38。7.一种包含黄连素荧光适配体的空腔发夹序列，其特征在于，所述序列二级结构均包含1～2个权利要求1所述的cgg-aaa错配空腔结构，且空腔结构分布在发夹臂的中部或尾部。8.如权利要求7所述的空腔发夹序列，其特征在于，所述序列如下：h3mm-bb：5
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acataatttaatacggatgttaacataaatattaaa ttatgt-3’,seq id no.28；h3mt-bb：5
’‑
acataacggaatatttatgttaacataaatattaaat tatgt-3’，seq id no.29；h3md-bb：5
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acataacggaatacggatgttaacataaatattaaa ttatgt-3’，seq id no.30。9.如权利要求1-3任一所述碱基对错配空腔结构、如权利要求4所述空腔发夹序列和/
或如权利要求5-8任一所述空腔发夹序列在激发tht中的应用。10.根据权利要求5或6所述空腔发夹序列在四环素检测中的应用。

技术总结
本发明提出了一种基于空腔发夹的ThT光核酸开关。其具有相比于G-四链体等激发ThT的核酸构象更便利的形成模式，可实现对ThT的荧光激发相比单链核酸增强17-20倍，比互补双链增强2.5-5倍，比ThT自发荧光增强近500倍的效果，同时，基于其发夹互补序列的高度可编程性，通过适配体的整合，已成功构建出可用于四环素、黄连素的非酶、免标记荧光/比例型ThT光核酸开关传感器，在16min内可实现对两靶标在pM水平的特异性鉴定，并具备对牛奶及血浆样本中靶标检测的良好选择性，展现出所开发的ThT光核酸开关在传感领域的强大实用性及通用潜力。开关在传感领域的强大实用性及通用潜力。开关在传感领域的强大实用性及通用潜力。


技术研发人员：许文涛 兰欣悦 朱龙佼 陈可仁
受保护的技术使用者：中国农业大学
技术研发日：2023.03.03
技术公布日：2023/7/13