一株高产低聚糖益生元的大仁红酵母及其应用

1.本发明属于微生物领域，具体涉及到一株高产低聚糖益生元的大仁红酵母及其应用。


背景技术：

2.酱油是以大豆、小麦等为原料，经过微生物的发酵作用形成的调味品。除了调味作用，消费者对食品的益生特性关注度越来越高。通常酱油常见的普通低聚糖，如蔗糖、麦芽糖等，常被消化吸收、能量代谢，而不是发挥益生元特性。
3.益生元低聚糖如低聚果糖、低聚异麦芽糖等是酱油所稀缺的，并且上述益生元低聚糖作为天然甜味剂，具有呈温和、细腻、可遮蔽异味的特点，这是酱油调配时常用的蔗糖、白砂糖或其它甜味剂所不具备的。此外，益生元在酱醪发酵中起菌群调控作用，核心发酵益生菌、酵母菌受其增益作用，抗逆、代谢能力增强，酱油综合品质将得到提升。
4.目前，本领域尚无能高产益生元、调控酿造微生态、提升酱油滋味和风味的核心酿造菌株的报道。


技术实现要素：

5.本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本技术的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
6.鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。
7.因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供大仁红酵母(rhodotorula dairenensis)gt_c14，于2022年12月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no:m 20222011，保藏地址为中国
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武汉
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武汉大学。
8.作为本发明所述大仁红酵母的一种优选方案，其中：所述大仁红酵母在20％nacl w/w、ph＝4、6％乙醇w/w环境中生长，具有良好的抗胁迫能力。
9.本发明的再一个目的是，克服现有技术中的不足，提供大仁红酵母(rhodotorula dairenensis)gt_c14在酱油发酵生产中的应用。
10.作为本发明所述应用的一种优选方案，其中：包括，在酱油发酵生产过程中添加大仁红酵母，高产低聚糖益生元。
11.作为本发明所述应用的一种优选方案，其中：所述大仁红酵母在酱油发酵生产过程中作为甜味调节剂。
12.作为本发明所述应用的一种优选方案，其中：包括，在酱油发酵生产过程中添加大仁红酵母，上调乳酸菌、酵母菌的多样性、丰富度和代谢活性。
13.作为本发明所述应用的一种优选方案，其中：包括，在酱油发酵生产过程中添加大仁红酵母，富集短链脂肪酸及其风味衍生物。
14.作为本发明所述应用的一种优选方案，其中：包括，在酱油发酵生产过程中添加大
仁红酵母，抑制酱油沉淀和脂质酸败，延长酱油货架期。
15.本发明有益效果：
16.本发明提供大仁红酵母(rhodotorula dairenensis)gt_c14，于2022年12月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no:m 20222011，保藏地址为中国
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武汉大学，所述菌株在20％nacl w/w、ph＝4、6％乙醇w/w环境中生长，具有良好的抗胁迫能力，在酱油发酵生产过程中添加大仁红酵母，高产低聚糖益生元，上调乳酸菌、酵母菌的多样性、丰富度和代谢活性，富集短链脂肪酸及其风味衍生物，抑制酱油沉淀和脂质酸败，延长酱油货架期，具有良好的应用前景。
附图说明
17.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
18.图1为本发明实施例中大仁红酵母在ypd营养琼脂上的菌落形态及光学显微镜镜检图。
19.图2为本发明实施例中大仁红酵母受胁迫生长数据图。
20.图3为本发明实施例中大仁红酵母干预下的菌群对比图。
21.图4为本发明实施例中酱油劣变情况对比图。
具体实施方式
22.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
23.在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
24.其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
25.本发明提供一种大仁红酵母(rhodotorula dairenensis)gt_c14，于2022年12月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no:m20222011，保藏地址为中国
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26.实施例1：大仁红酵母的分离
27.所用酱醪来自天津科技大学3年陈酿高盐稀态酱醪，采用五点法取样，充分混匀后置于无菌甘油ep管中并存放于-80℃冰箱。
28.无菌条件下称取-80℃保存的酱油样品5.0g，与45ml无菌生理盐水混合，与摇床中振荡2h，使微生物细胞分散，制成10-1
稀释度的稀释液，并进行系列梯度稀释。分别取0.1ml稀释度为10-3
、10-4
和10-5
的稀释液接种到ypd营养琼脂培养基中，涂布后将平板分别置于30℃培养箱中培养48h，观察并挑取产生色素的菌落，并进行反复划线纯化得到纯种菌株。
29.在ypd固体培养基上进行平板划线，30℃恒温培养箱培养48h，观察菌落形态：菌落的大小、颜色、形状，菌落边缘、凸起情况，如图1。
30.可以看出，挑取的菌落颜色呈现橘色；外形以圆形为主，表面湿润，粘稠，易挑起，表面光滑，产生掷孢子。
31.筛选出的菌株不能发酵半乳糖、麦芽糖、蔗糖、蜜二糖、乳糖、纤维二糖、淀粉；可以同化葡萄糖、半乳糖、山梨糖、核糖、木糖、l-阿拉伯糖、d-阿拉伯糖、蔗糖、麦芽糖、纤维二糖。最适生长温度30
±
2℃，最高温度45℃。
32.实施例2：大仁红酵母的分子生物学鉴定
33.挑取小米粒大小的菌落(克隆直径为0.1-0.3cm大小)至te溶液中，尽量避免挑取任何固体培养基(混有培养基会影响后续基因组提取效果)。
34.添加100μl te溶液，充分重悬沉淀，再添加20μl溶菌酶、10μl rnasea，充分混匀，37℃孵育2.5小时，每隔30分钟摇匀一次。添加100μl lys溶液(55℃提前预热)，轻轻吹打混匀。再添加20μl蛋白酶k溶液，充分混匀。55℃孵育30分钟。添加220μl ext溶液。颠倒数次直至混匀，10,000
×
g离心5分钟。转移上清至新的1.5ml ep管中，添加220μl无水乙醇。颠倒数次直至混匀。
35.将dna离心柱装入2ml收集管中，将样品全部转移到dna离心柱中，10,000
×
g离心1分钟。弃离心废液，将dna离心柱重新装入2ml收集管中。添加500μl pd溶液，10,000
×
g离心1分钟，弃废液，将dna离心柱重新装入2ml收集管中。添加600μlpw溶液，10,000
×
g离心1分钟，弃废液。将dna离心柱重新装入2ml收集管中，重复这一步骤。12,000rpm离心2分钟。
36.将dna离心柱重新装入干净的1.5ml ep管中，室温晾干5分钟。添加50-100μl elution buffer或水至dna离心柱中。室温静置3～5分钟。12,000rpm离心2分钟，收集基因组dna。
37.dna放置-20℃储存。通用引物its1:tccgtaggtgaacctgcgg；its4:tcctccgcttattgatatgc。
38.提取的dna样品适量稀释后作为pcr模板，以擎科1
×
tse101金牌mix进行扩增。用contigexpress拼接测序结果，并去除两端不准的部分。将拼接好的序列在ncbi数据库(blast.ncbi.nlm.nih.gov)中进行比对，鉴定结果为大仁红酵母(rhodotorula dairenensis)。
39.本发明中大仁红酵母的核苷酸序列(seq_1)为：
40.gatatgcttaagttcagcgggtagccctacctgatttcaggtcaaagtcaaaaggtgcgcgatggcaggttttgagcagtcatcaccacaaggagagacgaaacttattacgtctaacactgatgtgggatgttccactaagtcatttgaggtgagccattgctggcagacacccaagtccaagcctaacatgttcagaaaacatattagattgagatttcatgacactgaaacaggcatgcctttcggaataccaaaaggcgcaaggtgcgttcaaagattcgatgattcactgaattctgcaattcacattacttatcgcatttcgctgcgttcttcatcgatgcgagagccaagagatccgttgttaaaagttttgtttaattaagatactcttacgttcgttacactgatgtttgattattaacccggaggtcaacggttcacagaggtggtagaatctgataaggtctttcgaccaatcaataatgatccttccgcagg
41.实施例3：大仁红酵母抗胁迫能力测定
42.将冻存在-80℃的2ml菌液，倒入100mlypd液体培养基中(2％大豆蛋白胨，2％葡萄糖，1％酵母粉，调节ph＝7)，30℃摇床120rpm培养48h，随后将培养好的菌液按照2％的比例
接入到100ml新鲜ypd液体中，30℃摇床120rpm培养至od 600＝0.7，视为完成活化。
43.将活化的菌株以2％接种量分批接种到含0％、4％、8％、12％、16％、20％nacl(w/w)的ypd液体培养基；ph为4、4.5、5、5.5、6、6.5、7的ypd液体培养基；以及乙醇含量(w/w)为0％、2％、4％、6％的ypd液体培养基。及30℃培养120h，培养液离心收集菌体，55℃烘箱烘干24h至恒重，用干重反映生物量。
44.测定结果如图2，考虑到大仁红酵母在酱油发酵中需要发挥实际作用，因此选取生物量大于0.01g/l为阈值评估胶红酵母抗胁迫能力。发现nacl、ph和乙醇的耐受极限阈值分别为20％(w/w)、4和6％(w/w)。
45.实施例4：大仁红酵母产低聚糖益生元能力
46.将冻存在-80℃的2ml菌液，倒入100mlypd液体培养基中，30℃摇床120rpm培养48h，随后将培养好的菌液按照2％的比例接入到100ml新鲜ypd液体中，30℃摇床120rpm培养至od600＝0.7，视为完成活化。
47.将活化的菌株以2％(v/v)接种量接种到酱醪培养基中(大曲：20％盐水＝1：2.5w/w)，30℃培养15天。发酵液板框挤压过滤3次，取10000
×
g上清液冻干后采用蒸馏水溶液溶解。
48.以标准保藏菌株rhodotorula dairenensis ncyc 3725(https://www.mingzhoubio.com/)重复上述步骤作为对照组验证产低聚糖益生元能力。
49.以高效液相色谱(hplc)的测定酮糖含量：用四级泵(delta 600，waters，milford)与lunanh2柱(4.6
×
250mm)和预柱-nh2(phenomenex，torrane)耦合。柱温保持在30℃。使用光散射探测器elsd(mod.1000)，40℃平衡。使用自动注射器(型号717plus，waters，milford，ct，usa)，注射体积为10μl。用乙腈/水洗脱分析物，并用氦气以1.0ml/min的流速脱气35分钟(乙腈：水＝77:235分钟；73：277分钟；73：2714分钟；77:23大于1分钟并保持至分析结束)。所获得的数据使用waters millennium 32软件进行分析。采用离子色谱法分析低聚果糖含量。离子色谱条件：carbopaktm pa200色谱柱(250mm
×
4mm),carbopaktmpa10保护柱(50mm
×
4mm)；柱温30℃；流速1ml/min，进样量25μl。梯度洗脱条件：0～5min，100mmol/l氢氧化钠，0～120mmol/l醋酸钠；5～50min，100mmol/l氢氧化钠，0～120mmol/l醋酸钠；10～50min，100mmol/l氢氧化钠，120～320mmol/l醋酸钠；50～55min，100mmol/l氢氧化钠，320mmol/l醋酸钠；55～65min，100mmol/l氢氧化钠。高效液相色谱法测定海藻糖含量：流动相：乙腈：水(v/v)＝70:30；流速：1ml/min；柱温：25℃；色谱柱：nh2键合相柱，250mm
×
4.6mm；检测器：示差折光检测器。化合物的定量基于其出峰面积与标准品对比。
50.发酵产出低聚糖益生元如表1所示。
51.表1低聚糖益生元产量对比
[0052][0053]
可以看出，本发明菌株与标准菌株相比，发酵液总酮糖、低聚果糖、海藻糖分别提升了6.17、3.67、19.78倍。
[0054]
实施例5：大仁红酵母在酱油酿造中的应用及其作用
[0055]
将冻存在-80℃的2ml菌液，倒入100mlypd液体培养基中，30℃摇床120rpm培养48h，随后将培养好的菌液按照2％的比例接入到100ml新鲜ypd液体中，30℃摇床120rpm培养至od600＝0.7，视为完成活化。
[0056]
将大豆浸泡4h后与炒小麦一起进行高压蒸汽灭菌，连续通蒸汽10min，然后保持高压(0.8mpa)20min。待温度降至37℃后，在原料中添加0.3％的种曲，30℃培养。第8h、12h进行翻曲，36h后制成大曲。将大曲和18％(w/w)nacl溶液按1:2.5混合，补充发酵原料0.5％质量比的活化后胶红酵母，开始盐水发酵。15℃发酵30天，随后升温至30℃发酵30天，继续补充发酵原料0.1％质量比的胶红酵母，保温发酵120天。以板框压榨过滤法滤出生酱油。
[0057]
对照组一添加相同质量的鲁氏接合酵母(鲁氏接合酵母zygosaccharomyces rouxii cicc1379，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心)，对照组二添加相同质量的标准保藏菌株rhodotorula dairenensis ncyc 3725(https://www.mingzhoubio.com)，其它工艺与上述步骤相同。
[0058]
酱油发酵菌群检测：以sds法提取样品基因组dna，质检后稀释进行pcr扩增，将pcr产物进行质控回收，进行文库构建后采用novaseq6000进行高通量测序。将测序原始数据质控后以97％的一致性聚类，并以用mothur方法与silva132的ssurrna数据库进行物种注释分析。
[0059]
利用顶空固相微萃取和气相色谱质谱联用仪检测实验组和对照组的挥发性风味物质。取发酵后样品3ml置于顶空瓶中,并加入20ppm 2-辛醇标准品30ul。密封顶空瓶后在加热磁力搅拌器上，60℃水浴平衡20min。平衡后，取头顶空萃取30min，温度为60℃，gc-ms进样250℃解吸15min。gc条件：起始温度为40℃保持3min,以4℃/min上升到150℃保持1min,再以8℃/min上升到250℃保持6min。以氦气为载气，进样口温度为250℃，进样时间1min。ms条件：离子源温度200℃,接口温度220℃，溶剂延迟时间1.5min,电离方式为ei，70ev扫描质量范围为33～500m/z,扫描速率为3.00s cans/s。根据nist11数据库检索选取相似度≥90％的化合物，并结合离子碎片及保留指数进行定性。以2-辛醇为内标物质,采用内标法进行定量。
[0060]
将上述酿造酱油密封包装，暴露自然环境12个月后取出感官。参照gb/t18186-2000，制定了酱油感官评价表。然后选择了10名训练有素的小组成员来评估酱油样本的风
味、色泽和质地。并且团队成员在正式的感官评估之前接受了几次训练，训练包括定义和描述。取混合均匀的适量试样置于直径60mm～90mm的白色瓷盘中，在自然光线下感官(以同等方法的现酿酱油为基准，根据香气、颜色、沉淀的劣变情况进行打分，无差异为0分～强差异10分)。
[0061]
酱油酿造菌群(发酵60天的酱醪中)如图3所示。常规酱油菌群以枯草芽孢杆菌和魏斯氏菌主导，产生资源竞争，且产香能力差。大仁红酵母gt_c14处理后，基于益生元的益生、抗逆效果，乳酸菌(嗜盐四联球菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌)和酵母菌(鲁氏接合酵母和拟威克酵母)生物量显著提升，计算香浓指数(代表菌群多样性)和chao1指数(代表菌群丰富度)分别高达4.37和841，而标准株组仅为3.14和569。大仁红酵母gt_c14的菌群干预能力显著高于标准保藏菌株rhodotorula dairenensis ncyc 3725。酱油酿造风味组分如表2所示。
[0062]
表2酱油酿造风味组分对比
[0063]
[0064]
[0065][0066]
可以看出，大仁红酵母gt_c14发酵实验组酱油的短链脂肪酸丙酸、异戊酸相对于对照组一分别提升了514.03μg/l和393.73μg/l，醋酸则下降了2752.53μg/l，避免酸味过强掩盖酱油品质。此外，短链脂肪酸衍生物异戊醇、异戊醛、3-甲硫基丙醛分别提升了10.89、25.04、31.90倍，相应的麦芽香、焦糖香、煮土豆等特征香气将显著提升。
[0067]
酱油劣变情况如图4所示，可以看出，大仁红酵母gt_c14发酵实验组酱油未察觉酸败味，沉淀和色泽劣变轻微。对照组一的三种指标劣变严重，并且标准保藏菌株rhodotorula dairenensis ncyc 3725质控能力显著低于本发明菌株。
[0068]
本发明发明菌株高产低聚糖特别是海藻糖在防止蛋白质变性，抑制脂质氧化变质，和矫味作用中发挥主要作用；低聚果糖延长产品的货架期，增加产品的粘度和厚重感；酮糖甜味温和、细致，遮蔽异味(豆腥味、油腥味)，并可以维持酱油更长时间的抗氧化水平。
[0069]
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的范围当中。

技术特征：
1.大仁红酵母(rhodotorula dairenensis)gt_c14，于2022年12月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no:m 20222011，保藏地址为中国
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武汉大学。2.如权利要求1所述的大仁红酵母，其特征在于：所述大仁红酵母在20％naclw/w、ph＝4、6％乙醇w/w环境中生长，具有良好的抗胁迫能力。3.权利要求1或2所述的大仁红酵母在酱油发酵生产中的应用。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：包括，在酱油发酵生产过程中添加大仁红酵母，高产低聚糖益生元。5.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述大仁红酵母在酱油发酵生产过程中作为甜味调节剂。6.如权利要求3所述的应用，其特征在于：包括，在酱油发酵生产过程中添加大仁红酵母，上调乳酸菌、酵母菌的多样性、丰富度和代谢活性。7.如权利要求3所述的应用，其特征在于：包括，在酱油发酵生产过程中中添加大仁红酵母，富集短链脂肪酸及其风味衍生物。8.如权利要求3所述的应用，其特征在于：包括，在酱油发酵生产过程中中添加大仁红酵母，抑制酱油沉淀和脂质酸败，延长酱油货架期。

技术总结
本发明公开了一株高产低聚糖益生元的大仁红酵母及其应用，大仁红酵母(Rhodotoruladairenensis)GT_C14，于2022年12月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M20222011，保藏地址为中国


技术研发人员：赵国忠 周新运 姚云平 郭婷 滕安国 王金菊
受保护的技术使用者：天津科技大学
技术研发日：2023.03.03
技术公布日：2023/7/13