一种基于近红外光谱技术的灵芝孢子粉质量评价方法

1.本发明涉及灵芝孢子粉质量评价，具体为一种基于近红外光谱技术的灵芝孢子粉质量评价方法。


背景技术：

2.灵芝孢子粉主要有效成分有粗多糖和孢子油(以甘油三油酸酯为主)等，具有抗肿瘤、抗氧化和增强免疫调节等作用。但因其价格较贵，因此市面上以染色淀粉等方式掺假的现象已屡见不鲜。
3.甘油三油酸酯含量按2020版《中国药典》高效液相色谱法测定。通过制备供试品溶液和参照物溶液、设置液相色谱仪条件、将供试品溶液和参照物溶液注入色谱仪，测定浓度、用指纹图谱定性最后计算甘油三油酸酯含量。
4.粗多糖含量按2020版紫外-可见分光光度法《中国药典》通过标准曲线的制备、供试品溶液的制备、测定吸光度根据标准曲线上读出供试品溶液中粗多糖的浓度，计算，即得。(苯酚-硫酸法)。
5.通过上述步骤可以看出传统常用的含量测定方法步骤繁多，耗时较长，消耗试剂较多对环境污染也较大。测定少量样品花费时间不会太长，但要测定数量多的样品时，传统方法局限性较大。故在使用可见分光光度法和hplc法测定一定量灵芝孢子粉的多糖和甘油三油酸酯的含量基础上，结合偏最小二乘法建立一种用近红外定量分析多糖和甘油三油酸酯含量的模型，以大量快速测定样品多糖和甘油三油酸酯含量。
6.因此，传统测定灵芝孢子粉中粗多糖的苯酚-硫酸法、hplc测定甘油三油酸酯消耗样品、操作烦琐、耗时较长。


技术实现要素：

7.针对以上不足，本发明提供了一种基于近红外光谱技术的灵芝孢子粉质量评价方法，解决传统测定灵芝孢子粉中粗多糖的苯酚-硫酸法、hplc测定甘油三油酸酯消耗样品、操作烦琐、耗时较长的技术问题。
8.采取的技术方案：
9.一种基于近红外光谱技术的灵芝孢子粉质量评价方法，包括如下步骤：
10.s1、药品收集：灵芝孢子粉粉末样品的收集，获得总样本量；
11.s2、有效成分含量测定：测定s1中总样本量内的灵芝孢子粉粉末的质控指标的含量；
12.s3、近红外光谱采集：s1中总样本量内的灵芝孢子粉粉末近红外光谱数据采集，获得灵芝孢子粉近红外光谱；
13.s4、光谱预处理：对s3中灵芝孢子粉近红外光谱进行预处理；
14.s5、选择建模波段：甘油三油酸酯和粗多糖的建模波段为全波段；
15.s6、建立定量分析模型：
16.对光谱预处理和建模波段选择后的灵芝孢子粉近红外光谱数据，使用matlab 2020b软件下的si-pls方法将谱划分为10、20或30个区间，并将谱与2、3或4个区间结合，运用si-pls建立pls回归模型作为粗多糖含量分析模型；同时采用人工神经网络建立定量模型作为甘油三油酸酯含量分析模型，该人工神经网络模型包括一个两层隐藏神经网络、一个隐藏层神经元和一个激活函数；
17.s7、定量分析模型验证：将验证集数据导入已建立的校正模型，验证模型的稳定性和预测性能；
18.s8、利用构建的粗多糖含量分析模型和甘油三油酸酯含量分析模型分别预测灵芝孢子粉样品中的粗多糖和甘油三油酸酯的含量。
19.对本发明技术方案的进一步优选，s1中，收集不同产地灵芝孢子粉，在40℃下干燥过夜，并通过80目筛过筛，得到粒度均匀的灵芝孢子粉粉末。
20.对本发明技术方案的进一步优选，s2中，选取甘油三油酸酯和粗多糖含量作为灵芝孢子粉的关键质控指标，甘油三油酸酯含量采用高效液相色谱法测定，粗多糖含量采用可见分光光度法测定。
21.对本发明技术方案的进一步优选，s3中，在总样本量内，精密称取灵芝孢子粉2g，置于称量瓶中，近红外光谱仪进行扫描，扫描次数为32，分辨率为8cm-1
，扫描光谱范围为4000-10000cm-1
，重复扫描每个样品3次，取平均光谱为最终光谱，得到灵芝孢子粉原始近红外光谱。
22.对本发明技术方案的进一步优选，s4中，光谱预处理采用向量归一化(snv)、多元散射校正(msc)、一阶导数和二阶导数中的1种或2种方法的结合进行预处理；其中，在pls模型中甘油三油酸酯用一阶导数或二阶导数进行光谱预处理效果较好，粗多糖用一阶导数进行光谱预处理效果较好。
23.对本发明技术方案的进一步优选，s6中，pls回归模型对未知样品的预测能力的评估性能指标为：校正集采用相关系数(r
c2
)和内部交叉验证均方差(rmsecv)，验证集采用相关系数(r
v2
)和验证集预测均方差(rmsep)；
24.人工神经网络模型对未知样品的预测能力的评估性能指标为：通过训练一个两层隐藏神经网络，一个隐藏层神经元和一个激活函数，将光谱预处理和建模波段选择后的灵芝孢子粉近红外光谱数据以5:1:1随机分为训练集、测试集和验证集，构建ann模型，根据训练集、测试集和验证集的确定系数(r2)和均方根误差(rmse)值选择最优的神经网络结构。
25.本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：
26.1、本发明研究采用近红外光谱分析技术分析灵芝孢子粉，在使用可见分光光度法和hplc法测定灵芝孢子粉的粗多糖和甘油三油酸酯的含量基础上，结合偏最小二乘法建立一种用近红外定量分析粗多糖和甘油三油酸酯含量的模型，具有不损耗样品、快速、准确、无污染等优点。
27.2、本发明方法，灵芝孢子粉中的有效成分粗多糖和甘油三油酸酯的含量测定，可通过近红外分析建立模型从而达到检测更快速、更高效、损害样品更少以及对环境更友好。
附图说明
28.图1为本发明的主要成分的操作流程图。
29.图2为本发明的近红外光谱。
30.图3为本发明的人工神经网络模型中灵芝孢子粉中灵芝孢子油的训练集、测试集和验证集的线性相关图。
具体实施方式
31.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图1-附图3及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
32.实施例1
33.如图1所示，一种基于近红外光谱技术的灵芝孢子粉质量评价方法，包括如下步骤：
34.s1、药品收集：灵芝孢子粉粉末样品的收集，获得总样本量；收集不同产地(安徽、江苏、云南、山东、吉林和浙江共59份)灵芝孢子粉,在40℃下干燥过夜，并通过80目筛过筛，得到粒度均匀的灵芝孢子粉粉末。
35.s2、有效成分含量测定：测定s1中总样本量内的灵芝孢子粉粉末的质控指标的含量；选取甘油三油酸酯、粗多糖含量作为灵芝孢子粉的关键质控指标；按照《浙江省中药炮制规范》采用可见分光光度法测定粗多糖含量，采用高效液相色谱法测定甘油三油酸酯含量。
36.1.粗多糖测定方法：
37.称取0.5～1.0g粉碎过80mm孔径筛的样品，精确到0.0001g，置于50ml具塞离心管内。用5ml水浸润样品，缓慢加入20ml无水乙醇，同时使用涡旋振荡器振揺，使混合均匀，置超声提取器中超声提取30min。提取结束后，于4 000r/min离心10min，弃去上清液。不溶物用10ml乙醇溶液(5.4)洗涤、离心。用水将上述不溶物转移入圆底烧瓶，加入50ml蒸馏水，装上磨口的空气冷凝管，于沸水浴中提取2h，冷却至室温，过滤，将上清液转移至100ml容量瓶中，残渣洗涤2～3次，洗涤液装至容量瓶中，加水定容。此溶液为样品测定液。分別吸取0、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8m、1.0ml的葡萄糖工作溶液(4.8)置20ml具塞玻璃试管中，用蒸馏水补至1.0ml。向试液中加入1.0ml苯酚溶液(5.7)，然后快速加入5.0ml硫酸(与液面垂宜加入，勿接触试管壁，以便与反应液充分混合)，静置10min。使用涡旋振荡器使反应液充分混合，然后将试管放置于30℃水浴中反应20min，490nm测吸光度。以葡萄糖质量浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，制定标准曲线。
38.数据计算方法：样品中多糖含量以质量分数w计，单位以克每百克(g/100g)表示,按公式(1)计算:
39.w＝m1*v1/(m2*v2)*0.9*10-4
ꢀꢀꢀꢀ
(1)
40.式中:
41.m1——从标准曲线上查得样品测定液中含糖量,单位为微克(μg)；
42.v1——样品定容体积，单位为毫升(ml)；
43.v2——比色测定时所移取样品测定液的体积，单位为毫升(ml)；
44.m2——样品质量,单位为克(g)；
45.0.9——葡萄糖换算成葡聚糖的校正系数。
46.计算结果保留至小数点后两位。
47.2.甘油三油酸酯测定方法
48.试剂：c18、乙腈-异丙醇(51:49)、甘油三油酸酯、灵芝孢子粉
49.仪器：液相色谱仪、蒸发光散射检测器、烧杯、烧瓶、水浴锅
50.色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂:以乙腈-异丙醇(51:49)为流动相，用蒸发光散射检测器检测。理论板数按甘油三油酸酯峰计算应不低于3000。
51.参照物溶液的制备：取甘油三油酸酯对照品适量，精密称定，加流动相制成每1ml含0.3mg的溶液，即得。
52.供试品溶液的制备：取本品约0.3g，精密称定，置具塞烧瓶中，精密加入流动相25ml，称定重量，水浴回流提取60分钟，放冷，用流动相补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
53.测定法：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶波各2～5μl,注入液相色谱，测定，即得。
54.按中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算，供试品指纹图谐与对照指纹图谱(图1)的相似度不得低于0.95。
55.s3、近红外光谱采集：s1中总样本量内的灵芝孢子粉粉末近红外光谱数据采集，获得灵芝孢子粉近红外光谱；
56.在总样本量内，精密称取灵芝孢子粉2g，置于称量瓶中，近红外光谱仪进行扫描，扫描次数为32，分辨率为8cm-1
，扫描光谱范围为4000-10000cm-1
，重复扫描每个样品3次，取平均光谱为最终光谱，得到灵芝孢子粉原始近红外光谱。如图2所示。(使用opus 7.2软件采集近红外光谱数据)
57.s4、光谱预处理：对s3中灵芝孢子粉近红外光谱进行预处理；s3采集到的近红外光谱导入到simca 13.0软件中进行预处理，为消除或减少干扰因素，采用平滑、向量归一化(snv)、多元散射校正(msc)、一阶导数和二阶导数中的1种或2种方法的结合进行预处理；根据校正集采用相关系数(r
c2
)和内部交叉验证均方差(rmsecv)；验证集采用相关系数(r
v2
)和验证集预测均方差(rmsep)这四个评价指标，以r
c2
和r
v2
值越接近1，rmsec和rmsep值较小的标准，选择合适的预处理方法。不同光谱预处理方法的结果，如下表1。
58.表1、pls下不同光谱预处理方法的结果
[0059][0060]
光谱预处理的方法如下：甘油三油酸酯用一阶导数或二阶导数进行光谱预处理较好，粗多糖用一阶导数进行光谱预处理较好。
[0061]
s5、选择建模波段：甘油三油酸酯和粗多糖的建模波段为全波段；
[0062]
s6、建立定量分析模型：对光谱预处理和建模波段选择后的灵芝孢子粉近红外光谱数据，使用matlab 2020b软件下的si-pls方法将谱划分为10、20或30个区间，并将谱与2、3或4个区间结合，运用si-pls建立pls回归模型作为粗多糖含量分析模型；同时采用人工神经网络建立定量模型作为甘油三油酸酯含量分析模型。
[0063]
然而在实验中发现，si-pls模型的r
c2
和r
v2
低于pls模型。虽然光谱波段的组合可以优化模型的性能，变量的选择可以抵消部分无关变量，但它也去除了有用的光谱信息。综上所述，si-pls变量选择方法并没有提高pls模型的稳健性和可预测性。使用不同区间和不同区间组合的si-pls模型的结果见表2。
[0064]
表2、使用不同区间和不同区间组合的si-pls模型的结果
[0065][0066]
定量模型的建立：采用偏最小二乘回归法建立定量模型，并通过各质控指标考察模型性能。定量模型性能评价：校正集采用相关系数(r
c2
)和内部交叉验证均方差(rmsecv)；验证集采用相关系数(r
v2
)和验证集预测均方差(rmsep)来评价模型对未知样品的预测能力。当r
c2
和r
v2
值越接近1，rmsec和rmsep值较小时，说明此时模型稳定性越好，精确度越高。
[0067]
采用人工神经网络建立定量模型，通过训练一个两层隐藏神经网络，一个隐藏层神经元和一个激活函数。将数据集以5:1:1随机分为训练集、测试集和验证集，构建ann模型，数据集分类情况见表3。根据训练、测试和验证的确定系数(r2)和均方根误差(rmse)值选择最优的神经网络结构。
[0068]
表3、ann的数据集划分
[0069][0070]
由表1可知，在pls模型中，采用一阶导数处理过后的粗多糖模型效果是这5种预处理方法中最好的，r
c2
＝0.9135，r
v2
＝0.9999，rmsecv和rmsep分别为0.3639％和0.0023％；而甘油三油酸酯在一阶导数或二阶导数处理下，r
c2
均为1，r
v2
分别为0.9283和0.9216，然而rmsecv和rmsep则大多大于0.5％，预测能力较差。
[0071]
s7、定量分析模型验证：将验证集数据导入已建立的校正模型，验证模型的稳定性和预测性能。将验证集数据导入已建立的校正模型，验证模型的稳定性和预测性能。从表4中可以看到甘油三油酸酯含量模型的最佳相关系数r
training2
＝0.9689,r
validation2
＝0.9681和r
test2
＝0.9347。结果表明，人工神经网络模型在训练中预测甘油三油酸酯含量是有效果的。
[0072]
表4、ann下不同光谱预处理方法的实验数据与模型预测数据的相关系数和均方根误差
[0073]
[0074][0075]
因此，最后选择预测粗多糖含量的最佳模型是pls模型，r
c2
＝0.9999和r
v2
＝0.9135，rmsecv和rmsep分别为0.3639％和0.0023％。
[0076]
甘油三油酸酯建立的ann模型中，原始光谱ann模型的性能最好。当实验值和预测值之间的相关性最大时，ann模型的最佳相关系数为r
training2
＝0.9689、r
validation2
＝0.9681和r
test2
＝0.9347，见图3结果表明，人工神经网络模型对甘油三油酸酯含量的预测具有较好的训练效果。
[0077]
s8、利用构建的粗多糖含量分析模型和甘油三油酸酯含量分析模型分别预测灵芝孢子粉样品中的粗多糖和甘油三油酸酯的含量。其中表4最右侧一列即为验证集的结果，说明所建模型鲁棒性好，能够得到好的预测结果。
[0078]
以上实施例仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明保护范围之内。

技术特征：
1.一种基于近红外光谱技术的灵芝孢子粉质量评价方法，其特征在于，包括如下步骤:s1、药品收集：灵芝孢子粉粉末样品的收集，获得总样本量；s2、有效成分含量测定：测定s1中总样本量内的灵芝孢子粉粉末的质控指标的含量；s3、近红外光谱采集：s1中总样本量内的灵芝孢子粉粉末近红外光谱数据采集，获得灵芝孢子粉近红外光谱；s4、光谱预处理：对s3中灵芝孢子粉近红外光谱进行预处理；s5、选择建模波段：甘油三油酸酯和粗多糖的建模波段为全波段；s6、建立定量分析模型：对光谱预处理和建模波段选择后的灵芝孢子粉近红外光谱数据，使用matlab 2020b软件下的si-pls方法将谱划分为10、20或30个区间，并将谱与2、3或4个区间结合，运用si-pls建立pls回归模型作为粗多糖含量分析模型；同时采用人工神经网络建立定量模型作为甘油三油酸酯含量分析模型，该人工神经网络模型包括一个两层隐藏神经网络、一个隐藏层神经元和一个激活函数；s7、定量分析模型验证：将验证集数据导入已建立的校正模型，验证模型的稳定性和预测性能；s8、利用构建的粗多糖含量分析模型和甘油三油酸酯含量分析模型分别预测灵芝孢子粉样品中的粗多糖和甘油三油酸酯的含量。2.根据权利要求1所述的基于近红外光谱技术的灵芝孢子粉质量评价方法，其特征在于，s1中，收集不同产地灵芝孢子粉，在40
°
c下干燥过夜，并通过80目筛过筛，得到粒度均匀的灵芝孢子粉粉末。3.根据权利要求1所述的基于近红外光谱技术的灵芝孢子粉质量评价方法，其特征在于，s2中，选取甘油三油酸酯和粗多糖含量作为灵芝孢子粉的关键质控指标，甘油三油酸酯含量采用高效液相色谱法测定，粗多糖含量采用可见分光光度法测定。4.根据权利要求1所述的基于近红外光谱技术的灵芝孢子粉质量评价方法，其特征在于，s3中，在总样本量内，精密称取灵芝孢子粉2g，置于称量瓶中，近红外光谱仪进行扫描，扫描次数为32，分辨率为8 cm-1
，扫描光谱范围为4000-10000cm-1 ，重复扫描每个样品3次，取平均光谱为最终光谱，得到灵芝孢子粉原始近红外光谱。5.根据权利要求1所述的基于近红外光谱技术的灵芝孢子粉质量评价方法，其特征在于，s4中，光谱预处理采用向量归一化（snv）、多元散射校正（msc）、一阶导数和二阶导数中的1种或2种方法的结合进行预处理；其中，甘油三油酸酯用一阶导数+二阶导数进行光谱预处理，粗多糖用一阶导数进行光谱预处理。6.根据权利要求1所述的基于近红外光谱技术的灵芝孢子粉质量评价方法，其特征在于，s6中，pls回归模型对未知样品的预测能力的评估性能指标为：校正集采用相关系数（r
c2
）和内部交叉验证均方差（rmsecv），验证集采用相关系数（r
v2
）和验证集预测均方差（rmsep）；人工神经网络模型对未知样品的预测能力的评估性能指标为： 通过训练一个两层隐藏神经网络，一个隐藏层神经元和一个激活函数，将光谱预处理和建模波段选择后的灵芝孢子粉近红外光谱数据以5:1:1随机分为训练集、测试集和验证集，构建ann模型，根据训练集、测试集和验证集的确定系数（r2） 和均方根误差（rmse） 值选择最优的神经网络结构。

技术总结
本发明公开一种基于近红外光谱技术的灵芝孢子粉质量评价方法，包括如下步骤：S1、药品收集；S2、有效成分含量测定；S3、近红外光谱采集；S4、光谱预处理；S5、选择建模波段；S6、建立定量分析模型；S7、定量分析模型验证；S8、利用构建的粗多糖含量分析模型和甘油三油酸酯含量分析模型分别预测灵芝孢子粉样品中的粗多糖和甘油三油酸酯的含量。优点：本发明研究采用近红外光谱分析技术分析灵芝孢子粉，在使用可见分光光度法和HPLC法测定灵芝孢子粉粗多糖和甘油三油酸酯含量的基础上，结合偏最小二乘法建立一种基于近红外定量分析粗多糖和甘油三油酸酯含量的模型，具有不损耗样品、快速、准确、无污染等优点。本发明研究采用近红外光谱分析技术分析灵芝孢子粉，在使用可见分光光度法和HPLC法测定灵芝孢子粉粗多糖和甘油三油酸酯含量的基础上，结合偏最小二乘法建立一种基于近红外定量分析粗多糖和甘油三油酸酯含量的模型，具有不损耗样品、快速、准确、无污染等优点。染等优点。染等优点。


技术研发人员：张爱莲 钟灵佼 邵清松 甘秀琪 陈子林
受保护的技术使用者：浙江农林大学
技术研发日：2023.02.22
技术公布日：2023/7/13