一种与荔枝果实直径相关的SNP分子标记及其应用

一种与荔枝果实直径相关的snp分子标记及其应用
技术领域
1.本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及一种与荔枝果实直径相关的snp分子标记及其应用。


背景技术：

2.荔枝(litchi chinensis sonn.,无患子科)是世界上重要的热带果树树种，是以假种皮为食用部分的珍贵水果。荔枝在20多个国家种植，是当地经济不可分割的一部分。其优良的营养特性，独特的的风味和诱人的果色，使其成为国际市场上最具吸引力的热带或亚热带水果之一。
3.荔枝在中国南方已有几千年的栽培历史。荔枝栽培的最早记录要追溯到公元前二世纪。荔枝树是热带和亚热带果树中生产寿命最长的。最古老的荔枝树
‘
松香’来自中国福建，树龄超过1250年，至今仍在结果。悠久的栽培历史促成了荔枝种质多样性的产生。国家荔枝种质资源库保存了400多个荔枝品种。
4.dna分子标记是指能够直接反映不同生物个体或种群基因组间差异特征的dna片段。分子标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利。分子标记不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速。随着高通量测序技术的不断发展，测序速度的提高与测序成本的降低，目前为止，分子标记已经被开发了数十种，包括(rflp、aflp、ssr、snp)。其中ssr的使用较为广泛，ssr是指在真核生物整个基因组中存在序列较短且重复出现的核苷酸序列，一般由2-6个核苷酸组成一个重复单位。但开发和合成新的ssr引物投入高、难度大。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，snp)，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的dna序列多态性。相比早期ssr分子标记，snp分子标记具有在个体基因组上分布广泛、数量较多，易于基因分型(snp的二态性)、适于快速、规模化筛查等优势。
5.由于snp的广泛利用，使得基于snp的全基因组关联分析(gwas)广泛应用于作物重要农艺性状遗传位点的检测，单核苷多态性(snp)在荔枝基因组中广泛存在，可以满足gwas对于大样本、高密度标记的要求。与传统的qtl相比，gwas具有更高的分辩率，可以更准确的识别和定位新的基因。但目前对于与荔枝果实直径相关的snp位点的研究较少，因此，寻找一种与荔枝果实直径相关的snp分子标记，可为降低荔枝重要农艺性状检测的繁琐度和成本，提高荔枝分子标记辅助育种的效率提供重要的技术基础。


技术实现要素：

6.鉴于此，本发明提出一种与荔枝果实直径相关的snp分子标记及其应用。
7.本发明方案包括：
8.本发明提供一种与荔枝果实直径相关的snp分子标记，其位于荔枝第3条染色体的内含子区，位置为第chr3：25157939位的碱基t/c；其基因型tt为荔枝果实直径较大的极显著分子标记，其基因型cc时为果实直径较小的极显著分子标记。
9.进一步的，本发明提供一种用于检测所述的snp分子标记的引物对，所述引物对的核苷酸序列为：
10.正向引物5
’‑3’
：ctgttgctgctgcaattcat
11.反向引物3
’‑5’
：agagccaggtcgttgttgtt。
12.基于本发明研究成果，本发明进一步涉及上述snp分子标记在调控荔枝果实直径中的应用。
13.进一步的，本发明涉及上述位于荔枝第3号染色体第25157939位的snp分子标记在荔枝果实直径性状辅助选择中的应用。
14.本发明提供一种鉴定荔枝果实直径snp分子标记的方法，包括如下步骤：
15.(1)本发明通过对来自国内六个荔枝主产地的404份荔枝材料构建gwas群体，取荔枝的新鲜嫩叶作为提取dna的样本，待荔枝成熟后调查果实直径作为gwas分析的表型数据。
16.(2)将基因组dna酶切后与接头连接，构建基因组测序文库，采用hiseq2500测序平台，对测序文库进行双末端测序；
17.(3)对产出的测序数据进行质控与过滤，将质控合格的数据比对参考基因组序列，获得群体中snp信息；
18.(4)将获得的snp信息，进行全基因组关联分析，获得与荔枝果实直径显著相关的snp分子标记。
19.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
20.本发明获得了与荔枝果实直径性状相关的snp分子标记，该snp分子标记为位于荔枝第3条染色体的内含子区，位置为第chr3：25157939位的碱基t/c；其可作为荔枝育种过程中果实直径性状的辅助选择标记，有效提高荔枝品种选择的准确性、加快品种培育过程。
附图说明
21.图1为本发明实施例的荔枝果实直径全基因组关联分析的曼哈顿图；其中，曼哈顿图：横坐标代表每个snp所在的基因组位置；纵坐标代表mlm模型下每个snp位点p值的以10为底的负对数。
22.图2为本发明实施例的荔枝中两种基因型果实直径的比较分析图。
具体实施方式
23.为了更好理解本发明技术内容，下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
24.实施例1-群体构建与数据获取
25.(1)对来自不同地区的404份荔枝材料构建gwas群体，取荔枝的新鲜嫩叶作为提取dna的样本，待荔枝成熟后调查果实直径作为gwas分析的表型数据。
26.(2)将基因组dna由bacrode与dna片段连接，pcr扩增，纯化，构建hyper-seq基因组测序文库，采用hiseq2500测序平台，对基因组测序文库进行双末端测序；
27.(3)对产出的测序数据进行质控与过滤，将质控合格的数据比对荔枝whlz基因组参考基因组序列，获得群体中snp信息；
28.实施例2-表型数据调查与dna提取
29.取荔枝的新鲜叶片，用ctab法提取荔枝的dna；待荔枝成熟后，取果实大小均衡，用
游标卡尺测定十个荔枝果实的直径，并取平均值。
30.1.荔枝dna的提取与检测
31.每一个材料中选取1至2株，取其新鲜叶片5-8克提取dna。
32.(1)称取材料5-8g，液氮研磨三至四次；
33.(2)将粉末放到装有800ul 2
×
ctab提取缓冲液的2ml离心管中；
34.(3)加入60ul巯基乙醇混匀，60℃预热30min；
35.(4)其间混匀二至三次取出样品于室温放置；
36.(5)待样品冷却到定温加入800ul氯仿:异戊醇(24:1)；
37.(6)振荡混匀12000rpm离心15min；
38.(7)取上清到一新2ml ep管中加入1.5倍体积的1
×
ctab沉淀液；
39.(8)放置20-30min，12000rpm离心15min；
40.(9)将沉淀晾干溶于200ul te-buffer(溶解)；
41.(10)加入400ul 95％乙醇溶液和20ul 3m naac，-20℃沉淀1h；
42.(11)12000rpm离心15min；
43.(12)500ul 75％乙醇洗，12000rpm离心10min；开盖室温，待残留的乙醇挥发。
44.(13)加入30-50ul te-buffer；提取的dna可立即进行下一步实验或-40℃保存。
45.(14)琼脂糖电泳检测；2％wt琼脂糖凝胶(60v电泳35min)检测dna完整性。
46.实施例3-基因组测序及分析
47.对产出的测序数据进行质控与过滤：对原始illumina的测序数据，通过一个perl脚本(http://afsmseq.sourceforge.net/)进行数据优化和减少人为的数据误差，质控标准为maf＜0.05，缺失率＞0.8，hw(哈迪-温伯格指数)＞0.0001。同时得到测序总reads数量。然后将所有的reads通过设计的标签分配到每个个体中，并统计每个个体的reads数量。
48.将优化后的测序reads用bowtie2软件比对到荔枝参考基因组上，snp的鉴定使用samtools和vcftools(http://vcftools.sourceforge.net/)这两个软件共同完成，获得群体中snp信息。
49.snp的注释是基于荔枝参考基因组，利用snpeff软件将snps的位置归类到间隔区，非翻译区(包括3端非翻译区和5端非翻译区)，内含子区和密码子区。密码子区的snp根据其是否引起氨基酸的变化可以进一步分为同义密码子和非同义密码子。外显子区内的插入缺失可以根据其是否产生了移码突变而分为移码突变和非移码突变。
50.对获得高质量的snps和indels的数据对此群体的荔枝果实直径性状进行全基因组关联分析。用tassel5.0软件的混合线性模型(mixedlinermodel,mlm)来进行关联分析。
51.结果分析：
52.经上述snp质控后，获得合格的snp用于全基因组关联分析，关联分析时基于mlm模型，找到最优的pcs数量，用以拟合最优的性状因子。
53.荔枝果实直径性状的gwas分析结果的见图1。图1为关联分析结果的曼哈顿图，其中，x轴是每个snp所在的基因组上的位置，y轴为每个snp位点p值的以10为底的负对数。
54.当检出的snp的p值小于10-4
时，则认为这个snp达到了基因组水平的显著。本发明获得了与荔枝果实直径相关的snp分子标记，该标记位于荔枝第3条染色体的内含子区，位置为第chr3：25157939位的碱基t/c符合上述条件。
55.上述与荔枝果实直径相关的snp分子标记的扩增引物包括：正向引物5
’‑3’
:ctgttgctgctgcaattcat和反向引物3
’‑5’
:agagccaggtcgttgttgtt。
56.利用本发明的snp位点对一百多份荔枝群体进行荔枝果实直径测定和dna提取来验证，各待测植株基因型与荔枝果实直径结果如下表所示，在三个snp位点中，果实直径最大的是gd-12，基因型为tt，果实直径为4.93cm。果实直径最小的是bwllzsb015，基因型为cc，果实直径为1.55cm。图2为该snp位点的不同基因型在调控荔枝果实直径的效果分析图，从图2可以看出基因型为tt的荔枝样本的果实直径显著高于基因型为cc的样本。
57.表1 90份荔枝基因型与果实直径
58.[0059][0060]
本发明通过上述的鉴定荔枝果实直径snp分子标记的方法，得到了与荔枝果实直径相关的snp分子标记，其能够作为荔枝果实直径显著相关的分子标记，在荔枝果实直径性状辅助选择中应用，有利于提高荔枝品种选择的准确性、加快品种培育过程。
[0061]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种与荔枝果实直径相关的的snp分子标记，其特征在于：其位于荔枝3号染色体的第25157939位碱基，所述碱基为t或c。2.一种用于检测权利要求1所述的snp分子标记的引物对，其特征在于：所述引物对的核苷酸序列为：正向引物5
’‑3’
：ctgttgctgctgcaattcat反向引物3
’‑5’
：agagccaggtcgttgttgtt。3.权利要求1所述的snp分子标记或权利要求2所述的引物对在调控荔枝果实直径中的应用。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述snp分子标记在荔枝果实直径性状辅助选择中的应用。

技术总结
本发明公开了一种与荔枝果实直径相关的SNP分子标记及其应用。本发明通过运用全基因组关联分析的方法，获得了与荔枝果实直径性状相关的SNP分子标记，该SNP分子标记为位于荔枝第3号染色体的内含子区，位置为第Chr3：25157939位，碱基为T或C。该SNP分子标记可作为荔枝育种过程中果实直径的辅助选择标记，能有效提高荔枝品种选择的准确性、加快品种培育过程。程。程。


技术研发人员：邹枚伶 安鹏良 夏志强 肖建加 王文泉 江思容
受保护的技术使用者：海南大学
技术研发日：2023.02.16
技术公布日：2023/7/13