新型癌症免疫治疗抗体组合物的制作方法

新型癌症免疫治疗抗体组合物
1.本技术是申请号为“201980054723.0”，发明名称为“新型癌症免疫治疗抗体组合物”的发明专利申请的分案申请。相关申请的交叉引用
2.本技术要求2018年8月20日递交的申请号为62/720,015的美国临时专利申请的优先权并要求享有该申请的权益，该临时专利申请的完整内容引入本技术当中作为参考。
技术领域
3.本发明涉及与人体pd-l1相结合的抗原结合多肽、药物组合物及其用途。本发明还涉及产生这些抗原结合多肽或者抗体的表达系统。本发明所描述的抗原结合多肽或者药物组合物有利于治疗有需要的受试者的病理状况，例如哺乳动物癌症、感染等等。


背景技术：

4.在免疫细胞的细胞表面上有共刺激受体和抑制性受体，该受体与膜结合型、可溶性配体相互作用。这些受体通过改变免疫细胞激活或者抑制的阈值及持续时间，来调节免疫应答的效力、持续时间及种类。这些通常统称为免疫检查点。很多检查点分子是b7超级家族分子或者肿瘤坏死因子(tnf)超级家族分子之一的成员。
5.b7家族既包含抑制性共受体也包含刺激性共受体。例如，一方面，程序性(细胞)死亡受体1(pd-1)和细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4(ctla-4)与它们各自的配体(分别为pd-l1和pd-l2；b7-1和b7-2)的连接，导致调节性t细胞的激活或增殖的抑制、无反应性、耗竭及细胞凋亡。另一方面，分化簇28(cd28)和可诱导t细胞共刺激分子(icos)受体与它们各自的配体的连接，导致增殖增加和细胞因子的产生增加。相反，tnf家族的共刺激受体只包含促进增殖和效应器功能分化的刺激分子，例如ox40、4-1bb、cd40、cd27及它们的配体。此外，还有其它归属于这两个家族之一的共受体，例如，tim-3、lag-3、ceacam-1等等。
6.在过去的几十年里，已经明确了多种癌症通过各种各样的机制在肿瘤内产生免疫抑制环境。一种复发的机制是抑制肿瘤内t细胞的抑制性免疫检查点配体(特别是pdl1)的异位表达。也有越来越多的证据证明，这种肿瘤介导的免疫抑制的阻断，可以使肿瘤内的t细胞脱抑制，让它们杀死肿瘤(a dachi k,tamada k.cancer sci.2015；106(8):945-50；rafiq s,et al.,nat biotechnol.2018aug 13；hargadon km,et al.,int immunopharmacol.2018；62:29-39.)。阻断可以通过抗体或多种其他方法来实现。这与抗体与癌症细胞相结合，招募补体依赖的细胞毒性(cdc)和抗体依赖性细胞毒性(adcc)，直接杀死肿瘤细胞的传统抗癌抗体治疗不同。
7.ctla-4抗体是获得fda批准的第一个基于免疫检查点阻断的免疫疗法。其它阻断靶点，例如pd1及其相关分子，在临床中提供了更多不同的增强抗肿瘤免疫的机会。发明概述
8.本发明提供结合pd-l1的抗原结合多肽(或，可互换地，称为“抗pd-l1多肽”、“pd-l1结合多肽”)，优选地，为人pd-l1；该多肽具有以下特征之一或全部：(a)与pd-l1相结合并
抑制其与pd1相互作用的能力；以及(b)具有可以触发adcc和/或cdc的同种型或恒定区。所产生的抗体可以通过两种协同通路杀死肿瘤细胞——t细胞脱抑制和直接细胞毒性。本发明的多肽可以单独或与(a)靶向其它免疫抑制通路的抗体；(b)化疗或放疗；(c)其他阻断免疫抑制通路的机制，例如适配体或rnai；或(d)其它免疫治疗剂，例如细胞因子、靶向治疗等联合，用于治疗肿瘤。
9.在一方面，本发明提供一种抗原结合多肽，例如抗体、片段、衍生物或其类似物，他们是igg1的同种型的并与pd-l1表位结合，优选地，具有至少10-6
m结合亲和力，并且具有“基本上由”，在这里的意思是，至少80％，或者更优选地，85％、90％、95％或甚至100％与选自下列氨基酸序列所组成的群组中相同的序列组成的重链可变区结构域：seq id no:2、seq id no:6、seq id no:10、seq id no:14、seq id no:18、seq id no:22、seq id no:26、seq id no:30、seq id no:34、seq id no:38、seq idno:42、seq id no:46、seq id no:50、seq id no:54、seq id no:58、seq idno:62、seq id no:66、seq id no:70、seq id no:74、seq id no:78、seq idno:82、seq id no:86、seq id no:90、seq id no:94、seq id no:98、seq idno:102、seq id no:106及其组合；以及具有基本上由，即，至少80％，或者更优选地，85％、90％、95％或甚至100％，与选自下列氨基酸序列所组成的群组中相同的序列组成的轻链可变区结构域：seq id no:4、seq id no:8、seq id no:12、seq id no:16、seq id no:20、seq id no:24、seq id no:28、seq id no:32、seq id no:36、seq id no:40、seq id no:44、seq id no:48、seq id no:52、seq id no:56、seq id no:60、seq id no:64、seq id no:68、seq id no:72、seq id no:76、seq idno:80、seq id no:84、seq id no:88、seq id no:92、seq id no:96、seq idno:100、seq id no:104、seq id no:108及其组合。
10.在优选的实施方案中，本发明的抗原结合多肽或抗体包含一对重链可变区和轻链可变区，其各自序列基本上由以下配对组成：(a)seq id no:18和seq id no:20；(b)seq id no:42和seq id no:44；或(c)seq id no:34和seq id no:36。
11.在其它优选的实施方案中，本发明的抗原结合多肽或抗体包含一对重链可变区和轻链可变区，其各自序列基本上由以下配对组成：(a)seq id no:22和seq id no:24；(b)seq id no:2和seq id no:4；(c)seq id no:62和seq id no:64；或(d)seq id no:82和seq id no:84。
12.在其它优选的实施方案中，本发明的抗原结合多肽或抗体包含一对重链可变区和轻链可变区，其各自序列基本上由以下配对组成：(a)seq id no:70和seq id no:72；(b)seq id no:50和seq id no:52；(c)seq id no:102和seq id no:104；或(d)seq id no:30和seq id no:32。
13.在其它优选的实施方案中，本发明的抗原结合多肽或抗体包含一对重链可变区和轻链可变区，其各自可变区序列基本上由以下配对组成：(a)seq id no:6和seq idno:8；(b)seq id no:10和seq id no:12；(c)seq id no:14和seq id no:16；(d)seq id no:26和seq id no:28；(e)seq id no:38和seq id no:40；(f)seq id no:46和seq id no:48；(g)seq id no:54和seq id no:56；或(h)seq idno:58和seq id no:60。
14.在其它优选的实施方案中，本发明的抗原结合多肽或抗体包含一对重链可变区和轻链可变区，其各自可变区序列基本上由以下配对：(a)seq id no:66和seq idno:68；(b)seq id no:74和seq id no:76；(c)seq id no:78和seq id no:80；(d)seq id no:86和seq id no:88；(e)seq id no:90和seq id no:92；(f)seq id no:94和seq id no:96；(g)seq id no:98和seq id no:100；或(h)seq idno:106和seq id no:108组成。
15.优选地，抗原结合多肽是完全人源的或者被人源化的。在一个优选的实施方案中，抗原结合多肽进一步包含一个人源恒定区。在一个特征中，该人源恒定区为igg1。在一些实施方案中，本发明的抗体进一步包含第二对重链可变区和轻链可变区，例如，其与第一对基本上相同。
16.在一个优选的情形中，抗pd-l1多肽与pd-l1相结合，阻断pd-l1与pd1的相互作用。这可能是由于pd-l1上与之结合的表位位于或靠近pd1相互作用界面，或是由于pd1相互作用界面的构象发生了变构变化。
17.在另一方面，本发明提供编码上述多肽的核酸分子。该核酸分子可以是dna分子或rna分子。在一个优选的实施方案中，该核酸分子是编码本发明抗原结合多肽或抗体的重链可变区和轻链可变区的dna分子，该dna序列基本上分别由以下配对组成：(a)seq id no:17和seq id no:19；(b)seq id no:33和seq id no:35；(c)seq id no:41和seq id no:43。
18.在其它优选的实施方案中，该核酸分子是编码本发明抗原结合多肽或抗体的重链可变区和轻链可变区的dna分子，该dna序列基本上分别由以下配对组成：(a)seq id no:21和seq id no:23；(b)seq id no:1和seq id no:3；(c)seq id no:61和seq id no:63；或(d)seq id no:81和seq id no:83。
19.在其它优选的实施方案中，该核酸分子是编码本发明抗原结合多肽或抗体的重链可变区和轻链可变区的dna分子，该dna序列基本上分别由以下配对组成：(a)seq id no:69和seq id no:71；(b)seq id no:49和seq id no:51；(c)seq id no:101和seq id no:103；或(d)seq id no:29和seq id no:31。
20.在其它优选的实施方案中，该核酸分子是编码本发明抗原结合多肽或抗体的重链可变区和轻链可变区的dna分子，该dna序列基本上分别由以下配对组成：(a)seq id no:5和seq id no:7；(b)seq id no:9和seq id no:11；(c)seq id no:13和seq id no:15；(d)seq id no:25和seq id no:27；(e)seq id no:37和seq idno:39；(f)seq id no:45和seq id no:47；(g)seq id no:53和seq id no:55；或(h)seq id no:57和seq id no:59。
21.在其它优选的实施方案中，该核酸分子是编码本发明抗原结合多肽或者抗体的重链可变区和轻链可变区的dna分子，该dna序列基本上分别由以下配对组成：(a)seq id no:65和seq id no:67；(b)seq id no:73和seq id no:75；(c)seq idno:77和seq id no:79；(d)seq id no:85和seq id no:87；(e)seq id no:89和seq id no:91；(f)seq id no:93和seq id no:95；(g)seq id no:97和seq idno:99；或(h)seq id no:105和seq id no:107。
22.在另一方面，本发明提供了一种药物组合物，该药物组合物包含一个抗原结合多
1b11。
36.图10a和10b显示通过sds-page(图10a)和体积排阻色谱(图10b)表征的全长抗体3-1e4。
37.图11a显示测定本发明抗体与hpdl1定量结合的elisa试验的示意图，图11b和11c显示，以如图11a所示的elisa形式的，部分本发明全长抗体实例与hpdl1的定量结合分析结果。
38.图12a和12b显示部分本发明全长抗体实例的定量facs结果，其结合hpdl1-表达293t细胞(上图)，以及hpdl1-阴性293t细胞(下图)。
39.图13a显示受体阻断试验(receptor blocking assay，rba)形式1的示意图，图13b以rba形式1(图13a)：由hpdl1-fc包被并添加biotin-hpd1-fc，显示本发明先导抗体候选物受体阻断试验的结果。
40.图14a显示受体阻断试验形式2的示意图，图14b以rba形式2(图14a)：由hpd1-fc包被并添加biotin-hpdl1-fc)，显示本发明先导抗体候选物受体阻断试验的结果。
41.图15是一幅图表，列出了表征通过本发明实施方案获得的多个全长抗体的数据。
42.图16a-16d描述使用biacore的先导抗体候选物与pd-l1的亲和力：图16a示意地描述本发明实施例应用的biacore形式；图16b列出了使用biacore测试先导抗体候选物与pd-l1的亲和力的结果；图16c描述了4-1e8抗体的biacore亲和力测试响应曲线；以及图16d描述了3-1b11抗体的biacore亲和力测试响应曲线。
43.图17a示意地描述了本发明实施例应用的表位鉴定形式。图17b示意地描述了本发明实施方案中先导抗体候选物的表位鉴定。图17c列出了使用图17a所示形式，先导抗体候选物表位鉴定矩阵。
44.图18a-18d显示facs试验测定：对照组(图18a)、本发明中的“4-1e8”(图18b)、“3-1e4”(图18c)及“3-1b11”(图18d)抗体，与恒河猴pdl1-gfp表达构建体转染的293t细胞(上)以及亲代293t细胞(下)的结合能力。
45.图19a-19d显示facs试验测定：对照组(图19a)、本发明中的“4-1e8”(图19b)、“3-1e4”(图19c)及“3-1b11”(图19d)抗体，与恒河猴pdl1表达构建体转染的293t细胞(上)以及亲代293t细胞(下)的结合能力。
46.图20显示本发明的实施例中，il-2生成试验的代表性ec50结果。
47.图21显示编号为“4-1e8”的多肽实施例与市售的抗pdl1抗体阿特珠单抗(atezolizumab)的adcc活性比较。
48.图22a-22c显示编号为“4-1e8”的多肽实施例与编号为“3-1b11”(图22a)和“3-1e4”(图22b)的实施例的adcc活性比较，重要的数据点总结在图表(图22c)中。
49.图23a、23b和23c提供在本发明的先导抗体存在下与市售的抗pdl1抗体存在下，与pdl1+mda-mb-231肿瘤细胞共培养的pbmcs的il-2生成能力比较的三组试验数据。
50.图24提供在本发明的先导抗体存在下与市售的抗pdl1抗体存在下，与pdl1+mda-mb-231肿瘤细胞共培养的cd8 t细胞的ifnγ生成能力比较结果。
51.图25a和25b显示本发明实施例中，先导抗体的混合淋巴细胞反应结果。
52.图26a和26b显示本发明编号“4-1e8”(图26a)和“3-1b11”(图26b)抗体的结合特异性。
53.图27a和27b显示与单独cd80(实线)和单独第二试剂(虚线)相比，本发明e8(图27a)和b11(图27b)抗体阻断cd80和pd-l1-表达细胞结合(灰底曲线)的能力。
54.图28显示使用tg32小鼠对本发明的抗体实例进行的半衰期测定。发明详述
55.除非另有说明，技术术语根据常规用法使用。
56.如本发明中所使用的，“一个(a)”或“一种(an)”可以指一个或者多个。如本发明中所使用的，当与词语“包含(comprising)”结合使用时，词语“一个(a)”或“一种(an)”可以指一个或多于一个。如本发明中所使用，“另一个(another)”可以指至少第二个或更多。进一步地，除非上下文另有要求，单数术语包括复数，复数术语包括单数。
57.如本发明中所使用，不论是否明确指明，“大约(about)”指数值，例如，包括整数、分数和百分数。术语“大约(about)”通常指数值的范围(例如，该列举值的
±
5至10％)，本领域的普通技术人员会认为该数值的范围等同于所列举的值(如，有同样的功能或结果)。在一些情况下，术语“大约(about)”可以包含的数值四舍五入到最接近的有效数字。除非另外指明，“大约(about)”为所列举值的
±
10％。
[0058]“抗原结合多肽”是指含有与抗原相结合的部分的多肽。抗原结合多肽的示例包括抗体、抗体片段(例如：抗体的抗原结合部分)、抗体衍生物以及抗体类似物。
[0059]
抗原结合多肽或抗原结合蛋白可以具有，例如，天然产生的抗体(也被称为“免疫球蛋白”)的结构。每个天然产生的抗体由两对相同的多肽链组成，每对有一条“轻”链(大约25kda)和一条“重”链(大约50-70kda)。每个轻/重链对的可变区形成抗体-结合位点，这样一个完整的抗体有两个结合位点。
[0060]
天然产生的抗体链的可变区展示出相同的一般结构，即相对保守的骨架区(fr)由三个也称为互补决定区或cdrs的高变区连接着。从n端到c端，轻链和重链都包含了fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3及fr4结构域。氨基酸在每个结构域的分配与kabat等人在sequences of proteins of immunological interest,5
th ed.,us dept.of health and human services,phs,nih,nih出版号91-3242,1991中的定义一致。免疫球蛋白链上氨基酸的其它编号系统包括imgt(international immunogenetics information system，国际免疫遗传学信息系统；lefran c et al.,dev.comp.immunol.29:185-203；2005)和aho(honegger and pluckthun,j.mol.biol.309(3):657-670；2001)。
[0061]
抗体可以从诸如血清或血浆等含有不同抗原特性免疫球蛋白的来源获得。如果这些抗体经过亲和纯化，它们可以被富集为特定的抗原特性。这种抗体的富集制剂通常由少于大约10％的对特定抗原具有特异性结合活性的抗体来制备。使这些制剂经过几轮的亲和纯化，可以提高对抗原具有特异性结合活性的抗体的比例。以这种方式制备的抗体通常被称为“单特异性(monospecific)”。单特异性抗体制剂可由约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或99.9％对特定抗原具有特异性结合活性的抗体组成。
[0062]
本发明中使用的术语“抗体”或“ab”(及它们的复数形式)，广泛地指由四条多肽链(两条重(h)链和两条轻(l)链)组成的任何的免疫球蛋白(ig)分子，或保留了ig分子的基本特征和特定的表位结合特征的，其任何的功能性片段、突变体、变体、衍生物或类似物。这些片段、突变体、变体、衍生物或类似物抗体形式是本领域已知的，并且包括，尤其是，fab、f
(ab')、f(ab')2、fv、单链抗体(scfv)、单域抗体(sdabs)、互补决定区(cdr)片段、嵌合抗体、双抗体、三抗体、四抗体以及包含至少一部分免疫球蛋白的多肽，该部分免疫球蛋白足以使特定抗原与该多肽相结合。抗体片段、衍生物和类似物可以通过重组dna技术或者通过酶或化学裂解完整的抗体产生。
[0063]
fab片段是具有v
l
、vh、c
l
和c
h1
结构域的单价片段；f(ab')2片段是具有两个fab片段的二价片段，这两个fab片段在其铰链区由二硫键连接着；fd片段具有vh和c
h1
结构域；fv片段具有抗体单臂的v
l
和vh结构域；dab片段具有vh结构域、v
l
结构域或者vh或v
l
结构域的抗原结合片段(参见，例如：u.s.pat.nos.6,846,634；6,696,245,us app.pub.20/0202512；2004/0202995；2004/0038291；2004/0009507；2003/0039958，及ward et al.,nature 341:544-546,1989)。
[0064]
单链抗体(scfv)是一种在v
l
和vh区通过接头(例如：氨基酸残基的合成序列)相连以形成连续蛋白链的抗体，该接头足够长以允许蛋白链自我折叠，形成一个单价抗原结合位点(参见，例如：bird et al.,1988,science 242:423-26及huston et al.,1988,proc.natl.acad.sci.usa 85:5879-83)。双抗体是包含两条多肽链的二价抗体，其中每条多肽链包含由接头连接的vh和v
l
结构域，该接头太短，以至于不能允许在同一条链上的两个结构域配对，因此允许每个结构域与另一条多肽链上的互补结构域配对(参见，例如：holliger et al.,1993,proc.natl.acad.sci.usa 90:6444-48和poljak et al.,1994,structure2:1121-23)。如果双抗体的两条多肽链是相同的，那么它们配对产生的双抗体将有两个相同的抗原结合位点。具有不同序列的多肽链，可以用于制备具有两个不同抗原结合位点的双抗体。类似地，三抗体和四抗体是分别包含三条和四条多肽链的抗体，分别形成三个和四个抗原结合位点，抗原结合位点可以相同也可以不同。
[0065]
利用上述kabat et al.；上述lefranc et al.和/或上述honegger和pluckthun描述的系统，可以识别给定抗体的互补决定区(cdrs)和骨架区(fr)。一个或多个cdrs可以共价或非共价地并入到一个分子中，使其成为抗原结合蛋白。抗原结合多肽可以将cdr(s)作为一条较大多肽链的一部分并入，可以共价地连接cdr(s)到另一条多肽链上，也可以非共价地并入cdr(s)。cdrs允许抗原结合蛋白与特定的目标抗原特异性地结合。
[0066]
抗原结合多肽可以具有一个或多个结合位点。如果有不只一个结合位点，这些结合位点可以是彼此相同的或不同的。例如，天然产生的人类免疫球蛋白典型地具有两个相同的结合位点，然而“双特异性”或“双功能”抗体具有两个不同的结合位点。
[0067]
本发明中使用的术语“人类抗体”或“人源化抗体”包含来源于人免疫球蛋白序列的具有一个或多个可变区和恒定区的所有抗体。在一个实施方案中，所有的可变区和恒定区都来源于人免疫球蛋白序列(完全人类抗体或人源化抗体)。这些抗体可以通过多种方式制备，包括通过用目标抗原对小鼠进行免疫，该小鼠经基因修饰以表达源自人类重链和/或轻链编码基因的抗体。通过一个或多个氨基酸的替换、缺失和/或添加，使人源化抗体具有与来源于非人类物种的抗体序列不同的序列，因此，在施用于人类受试者时，与非人类物种抗体相比，人源化抗体不太可能诱导免疫应答，和/或诱导程度较轻的免疫应答。在一个实施方案中，位于非人类物种抗体的重链和/或轻链的骨架区和恒定区的某些氨基酸经突变以产生人源化抗体。在另一个实施方案中，人类抗体的恒定区融合到非人类物种抗体的可变区。在另一个实施方案中，将非人类抗体的一个或多个cdr序列中的一个或多个氨基酸残
基进行改变，以减少非人类抗体在施用于人类受试者时可能的免疫原性，其中改变的氨基酸残基对抗体与抗原的免疫特异性结合不是关键的，或者对氨基酸序列的改变是保守的改变，因此人源化抗体与抗原的结合不会明显地比非人类抗体与抗原的结合差。如何制备人源化抗体的例子可以在美国专利u.s.pat.nos.6,054,297,5,886,152和5,877,293中找到。
[0068]
本发明中所使用的术语“嵌合抗体”是指一类包含来自一种抗体的一个或多个区域和来自至少另一种抗体的一个或多个区域的抗体。在一个实施方案中，来自多个人类抗pd-l1抗体的cdrs在一个嵌合抗体中混合和配对。
[0069]
活化的t细胞在其细胞表面表达pd1。pd-l1与pd1的结合激活pd1，并且抑制pd1
+
t细胞。本发明中使用的“中和抗体”或“抑制性抗体”是指阻断pd1激活的抗体，即采用如本发明实施例中描述的试验，过量的抗pd-l1抗体减少所述激活量的至少约20％。在各实施方案中，抗原结合蛋白使pd1激活量减少了至少30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％以及99.9％。
[0070]
本领域普通技术人员遵循本说明书的教导以及使用本领域已知的技术可以容易地制备抗体的片段或类似物。片段或类似物优选的氨基和羧基端出现在功能结构域边界附近。通过将核苷酸和/或氨基酸序列数据与公共或专用序列数据库进行比较，可以确定结构和功能结构域。计算机化对比方法可以用于识别序列基序或预测在其他已知结构和/或功能的蛋白质中出现的蛋白构象域。识别折叠成已知三维结构的蛋白序列的方法是已知的。参见，bowie et al.,1991,science 253:164。
[0071]
如本发明所使用，如果抗原结合多肽以100纳摩尔或更低的离解常数与抗原结合，则该抗原结合多肽“特异性地结合”抗原(例如，人pd-l1)。
[0072]
本发明所使用的“抗原结合结构域”、“抗原结合区”或“抗原结合位点”，是抗原结合蛋白的一部分，其包含与抗原相互作用且有助于抗原结合蛋白对抗原的特异性和亲和力的氨基酸残基(或其它基团)。为了使抗体特异性地结合抗原，该抗体至少要包含至少其cdr结构域之一的一部分。
[0073]
本发明中所使用的“表位”是指被抗原结合蛋白(例如，抗体)结合的分子的那部分。表位可以包含该分子的非连续的部分(例如，在多肽链中，在多肽一级序列中不连续的氨基酸残基，但在多肽的三级和四级结构中，它们彼此足够近以使其被抗原结合蛋白结合)。
[0074]
如本发明所使用，术语“多聚核苷酸”、“寡核苷酸”及“核酸”在全文中互换使用，包括dna分子(例如，cdna或基因组dna)、rna分子(例如，mrna)、利用核苷酸类似物生成的dna或rna类似物(例如，肽核酸和非天然产生的核苷酸类似物)及上述的混合物。核酸分子可以是单链或者双链的。在一个实施方案中，本发明中的核酸分子包含编码抗体、或其片段、衍生物、突变体或变体的连续开放阅读框(open reading frame)。
[0075]
本发明中使用的“载体”是一种核酸，可以用于将与之相连的另一个核酸导入细胞。载体的一种类型是“质粒”，指线状或环状双链dna分子，可以将附加的核酸片段连接到其中。载体的另一种类型是病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，其中附加的dna片段可以被引入到病毒的基因组中。某些载体能够在被引入的宿主细胞中自主复制(例如，包含细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。其它载体(例如，非游离型哺乳动物载体)在引入宿主细胞后被整合入宿主细胞的基因组中，从而与宿主
基因组一起被复制。“表达载体”是一种可以指导所选多聚核苷酸表达的一种载体。
[0076]
如本发明所使用的，如果调控序列影响核苷酸序列的表达(例如，表达的水平、时间或部位)，则该核苷酸序列“可操作地连接”到调控序列。“调控序列”是一种核酸，其影响与之可操作地连接的核酸的表达(例如，表达的水平、时间或部位)。例如，该调控序列可以直接在被其调节的核酸上发挥作用，或通过一个或多个其它分子(例如，与调节序列和/或核酸相连的多肽)的功能发挥作用。调控序列的例子包括启动子、增强子和其它表达控制元件(例如，聚腺苷酸化信号)。进一步的调控序列的例子描述于，例如，goeddel,1990,gene expression technology:methods in enzymology 185,academic press,san diego,calif.and baron et al.,1995,nucleic acids res.23:3605-06。
[0077]
优选地，本发明的组合物所治疗的广谱哺乳动物癌症选自以下癌症所组成的群组中：卵巢癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌、骨髓瘤、神经母细胞源性中枢神经系统肿瘤、单核细胞白血病、b细胞源性白血病、t细胞源性白血病、b细胞源性淋巴瘤、t细胞源性淋巴瘤、肥大细胞肿瘤、黑色素瘤、膀胱癌、胃癌、肝癌、尿路上皮癌、皮肤癌、肾癌、头颈部癌、胰腺癌及上述癌症的组合。更广泛地，任何至少部分肿瘤细胞表达可检测量的pd-l1的癌症都可以通过本发明的组合物治疗。
[0078]
本公开的多肽可以使用本领域公知的任何标准方法生产。在一个实施例中，通过重组dna的方法生产多肽，通过将编码多肽的核酸序列(例如cdna)插入到重组表达载体中，并在促进表达的条件下表达dna序列。
[0079]
编码任何一种本发明所公开的各种多肽的核酸，可以是经化学合成的。为了提高在细胞中的表达，可以对密码子选用进行选择。这种密码子选用将取决于所选择的细胞类型。针对大肠埃希菌和其它细菌，以及哺乳动物细胞、植物细胞、酵母细胞和昆虫细胞，已经开发出专门的密码子选用模式。参见，例如：mayfield et al.,proc.natl.acad.sci.usa.2003 100(2):438-42；sinclair et al.protein expr.purif.2002(1):96-105；connell n d.curr.opin.biotechnol.2001 12(5):446-9；makrides et al.microbiol.rev.1996 60(3):512-38和sharp et al.yeast.1991 7(7):657-78。
[0080]
核酸操纵的一般技术描述于，例如：sambrook et al.,molecular cloning:alaboratory manual,vols.1-3,cold spring harbor laboratory press,2ed.,1989，或f.ausubel et al.,current protocols in molecular biology(green publishing and wiley-interscience:new york,1987)并且其定期更新中，在本发明中通过引用合并。编码多肽的dna可操作地连接于来自哺乳动物、病毒或昆虫基因的适当的转录或翻译调节元件。这些调节元件包括转录启动子、控制转录的可选的操纵序列、编码合适的mrna核糖体结合位点的序列以及控制转录和翻译终止的序列。通常由复制起点赋予其在宿主中复制的能力，以及便于识别转化子的选择基因也被并入。
[0081]
本发明中的重组dna也可以包含任何类型的蛋白质标签序列，这些序列可能有利于蛋白质的纯化。蛋白质标签的例子包括但不限于组氨酸标签、flag标签、myc标签、ha标签或gst标签。用于细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主的适当的克隆和表达载体可以在cloning vectors:a laboratory manual,(elsevier,n.y.,1985)中找到。
[0082]
本发明的表达构建体通过适合于宿主细胞的方法导入宿主细胞。将核酸导入宿主
细胞的各种方式为本领域公知，包括但不限于，电穿孔；使用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、葡聚糖(deae-dextran)或其它物质转染；基因枪法；脂质转染；以及感染(其中，载体为感染制剂)。适宜的宿主细胞包括原核细胞、酵母、哺乳动物细胞或细菌细胞。
[0083]
本发明公开的蛋白也可以使用细胞翻译系统生产。为此目的，编码该多肽的核酸必须经过修饰，使其能够在体外转录产生mrna，并允许在所使用的特定无细胞系统(真核的，如哺乳动物或酵母无细胞翻译系统；或原核的，如细菌无细胞翻译系统)中对mrna进行无细胞翻译。
[0084]
pd-l1结合多肽也可以通过化学合成产生(例如，通过solid phase peptide synthesis,2nd ed.,1984,the pierce chemical co.,rockford,ill中描述的方法)。蛋白质的修饰也可以通过化学合成产生。
[0085]
本文公开的多肽可以通过蛋白质化学领域通常已知的蛋白质分离/纯化方法进行纯化。非限制性例子包括：萃取、重结晶、盐析(例如，使用硫酸铵或硫酸钠)、离心、透析、超滤、吸附层析、离子交换色谱、疏水色谱、正相色谱、反相色谱、凝胶过滤、凝胶渗透色谱、亲和层析、电泳、逆流分布或上述任何的组合。纯化后，多肽可以交换到不同的缓冲物和/或通过任何本领域所公知的各种方法进行浓缩，包括但不限于过滤和透析。
[0086]
纯化的多肽优选至少85％纯，更优选至少90％或95％纯，最优选至少98％纯。无论纯度的确切数值是多少，多肽都经过充分地纯化以作为药物产品使用。多肽的翻译后修饰
[0087]
在某些实施方案中，本发明的结合多肽可以进一步包含翻译后的修饰。示例性的翻译后的蛋白修饰包括，磷酸化、乙酰化、甲基化、adp-核糖化、泛素化、糖基化、羰基化、类泛素化、生物素化或添加多肽侧链或疏水基团。因此，经修饰的可溶性多肽可能含有非氨基酸元素，例如类脂、多聚糖或单糖以及磷酸盐。糖基化的一种优选形式是唾液酸化，其将一个或多个唾液酸基团连接到多肽上。唾液酸基团改善蛋白质的溶解性和血清半衰期，同时也降低蛋白质可能的免疫原性。参见raju et al.biochemistry.2001 31；40(30):8868-76。可以测试这些非氨基酸元素对多肽功能的影响，以了解其对pd-l1或pd-1功能的拮抗作用，例如其对血管生成或肿瘤生长的抑制作用。
[0088]
在一个实施方案中，主体多肽的修饰形式包含将所述主体可溶性多肽与非蛋白聚合物连接。在一个具体的实施方案中，所述聚合物是聚乙二醇(“peg”)、聚丙二醇或聚氧化烯，按照美国专利u.s.pat.no.4,640,835、4,496,689、4,301,144、4,670,417、4,791,192或4,179,337中规定的方式。
[0089]
在一个特征中，本发明结合多肽的peg化实施例优选地保留至少25％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％的未被修饰的蛋白相关生物活性。在一个实施方案中，生物活性是指其结合pd-l1的能力，通过kd、k
on
或k
off
速率进行评估。在一个具体的实施方案中，与未peg化的对应物相比，peg化的结合多肽蛋白与人pd-l1的结合增加。在另一个实施方案中，生物活性指阻断pd-l1/pd1相互作用。治疗，疫苗&施用
[0090]
本公开进一步提供了治疗疾病或预先预防疾病的方法，该疾病对pd-l1生物活性的抑制有响应。优选的实施例为以细胞过度增生和持续感染为特征的疾病。施用技术和剂量取决于具体的多肽类型和具体治疗的疾病。由于监管机构要求用于治疗的蛋白试剂的致
热源含量需为可接受的低水平，本发明的治疗配方可与其它配方区分，因其基本上不含致热源，或至少包含不超过适当的监管机构(如美国fda)所确定的可接受水平的致热源。
[0091]
本发明的药物制剂可包含至少一种药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。包含于制剂中的赋形剂将有不同的用途，例如，取决于使用的基因构建体或效应细胞的种类以及施用方式。通常使用的赋形剂包括但不限于：盐水、缓冲盐水、葡萄糖、注射用水、甘油、乙醇及上述的组合、稳定剂、增溶剂和表面活性剂、缓冲液和防腐剂、强化剂、填充剂和润滑剂。
[0092]
在本发明的另一个实施方案中，本发明的药物制剂施用于患者。示例性施用方式包括但不限于，静脉注射。其它方式包括但不限于，瘤内、皮内、皮下(s.c.、s.q.、sub-q、hypo)、肌内(i.m.)、腹膜内(i.p.)、动脉内、髓内、心内、关节内(关节)、滑膜内(关节液区)、颅内、脊柱内以及鞘内(脊髓液)。用于胃肠外注射或输注本制剂的任何已知的器械可以用于实现这些施用。如本发明中所使用，术语“治疗(treat,treating,treatment)”具有其通常及惯用的含义，且包含以下一种或多种含义：阻滞、改善受试者疾病(例如肿瘤)症状或降低其严重程度和/或频率，和/或抑制受试者癌症细胞的生长、分裂、扩散或增殖，或癌症进展(例如：出现新的肿瘤)。治疗是指，与未使用本发明方法的受试者相比，阻滞、改善、降低或抑制约5％至约100％。优选地，与未使用本发明方法的受试者相比，阻滞、改善、降低或抑制约100％、99％、95％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％或5％。
[0093]
本发明还提供了一种试剂盒，包含一个或多个容器，其中装有大量编码本发明多肽的基因构建体，及药学上可接受的赋形剂。该试剂盒还可以包含使用说明。与试剂盒相关联的，还可以是管理药品或生物制品生产、使用或销售的政府机构规定格式的通知，该通知反映了生产、使用或销售机构对人类用药的批准。
实施例
[0094]
利用噬菌体展示技术筛选抗原结合多肽
[0095]
间接包被：参考图1，通过标准噬菌体展示技术鉴别pdl1-结合单链可变片段(scfv)。人源原始scfv文库通过基于pcr的重建产生，该基因文库来源于50个健康供体的b细胞。采用hpdl1-fc融合蛋白和无关的fc融合蛋白间接地固定于包被了抗人igg fc抗体的免疫管上，进行固相免疫管淘选(panning)。为淘选出强结合物，首先使用无关的fc融合蛋白耗尽与fc结合的scfvs，然后选出未结合的噬菌体，这些未结合的噬菌体可与hpdl1-fc融合蛋白结合。洗脱的噬菌体在细菌中扩增。这些过程重复3-4轮，在第二轮之后确定噬菌体滴度及复杂度。一旦噬菌体被依次富集(第3轮和第4轮)，则通过elisa试验检测单个噬菌体克隆对hpdl1的结合能力。
[0096]
直接包被：直接将fc蛋白包被在免疫管上，不使用抗人fc抗体(图2)。
[0097]
噬菌体结合elisas：
[0098]
使用与淘选相同的策略进行elisas。对于间接淘选的克隆，首先以抗人fc抗体包被试验板(plates)，然后是fc蛋白。对于直接淘选的克隆，以fc蛋白直接包被试验板。在间接elisa试验中，在平行试验中检测噬菌体对hpdl1-fc和其对无关的fc蛋白(或higg1)的结合能力。选出显示与无关的fc蛋白结合程度低，与hpdl1结合程度高的噬菌体进行进一步测序和二次筛选。数据如图3所示。大多数克隆的非特异性结合较低(以fc蛋白的信号值(1:10
1b11并与对照组比较。结果如图19a-19d所示：三个抗体实施方案均与恒河猴pdl1结合。
[0116]
il2诱导和ec50测定
[0117]
利用ficoll梯度从人体血液中分离出外周血单核细胞(pbmcs)，接着用标准方法将红细胞裂解。本实验rpmi+培养基准备如下：10％ fbs、1％抗-抗(gibco)和1％非必须氨基酸(gibco)加入到经atcc修饰的rpmi培养基(gibco)。从血液中分离后，将pbmcs重悬浮于10-20ml rpmi
+
中，在37℃、5％co2条件下培养过夜。接下来，将pbmcs以100000pbmcs/96孔的浓度接种于96孔组织培养板(corning)；每孔的最终体积为200ul。以1ng/ml的浓度添加葡萄球菌肠毒素b(seb)，以20ug/ml(用于筛选)的浓度或以50ug/ml至0.003ug/ml的浓度范围添加先导抗体。以无seb(如，无刺激)、单独含有seb或含有seb和同型对照的细胞(如，基线)，作为对照组。
[0118]
37℃、5％ co2下孵育76小时后，在室温下将pbmcs 1200rpm离心(spun down)15分钟，收集上清液并存储于-20℃。使用市售的il2-elisa试剂盒(biolegend或thermofisher)，按照生产商的说明书进行il2 elisa。将上清液稀释1/20-1/80用于elisa。使用spectramax3 m3 microplate reader酶标仪(molecular devices)测量吸光度，使用graphpad软件分析数据。先导抗体候选物与市售的抗pd1抗体进行比较。结果如图20所示。在肿瘤与mda-mb-231细胞的共同培养试验中(参见图23a-23c)，在去抑制il2(参见图23a-23c)方面和去抑制ifnγ(参见图24)方面，4-1e8始终优于3-1b11和3-1e4。然而，在与t细胞和mda-mb-231细胞的相似的共同培养试验中，这三个抗体都与市售pdl1抗体(如阿特珠单抗(atezo)和德瓦鲁单抗(durva))产品一样好或更好。
[0119]
adcc活性
[0120]
如图21和22所示，三个先导抗体都显示出很强的adcc活性，而阿特珠单抗(atezolizumab)(设计为adcc-阴性)显示无活性。在本发明的三个实施方案中，4-1e8表现出最高的adcc活性。
[0121]
混合淋巴细胞反应
[0122]
利用ficoll梯度从人体血液中分离外周血单核细胞(pbmcs)，接着使用标准方法将红细胞裂解。在37℃下，将细胞在无血清rpmi 1640中培养1小时。去除非贴壁细胞，剩余的单核细胞在添加有5％人ab血清、2ng/ml gm-csf和10ng/ml il4(bd biosciences)的rpmi 1640中进行培养。每2到3天添加含细胞因子补充剂的新鲜培养基。第6天添加20ng/ml tnfa(bd biosciences)诱导成熟树突状细胞，培养24小时。
[0123]
对树突状细胞进行采集、表型分析以及冷冻以备后用。按照各生产商的说明书，使用磁珠(dynal)将cd4 t细胞从pbmcs中分离出来。cd4 t细胞和同种异型树突状细胞以1：2.5的比例，共培养于96孔平底板(flat bottom plates)(costar)中，使用添加了10％人ab血清的rpmi 1640培养基。在添加树突状细胞前，用100mg/ml丝裂霉素c(sigma)处理树突状细胞。用cfse(或类似染料)稀释t细胞，检测增殖。使用市售的ifng-elisa试剂盒，根据生产商的说明书，测定ifng释放。使用spectramax3 m3microplate reader酶标仪(molecular devices)测量吸光度，使用graphpad软件分析数据。在这些研究中，本发明实施方案的先导抗体候选物和其它市售的抗pd1抗体和抗pdl1抗体的表现相当。示例结果如图25a和25b所示。
[0124]
结合特异性
[0125]
生成稳定表达多种b7家族成员及其受体的expi293细胞系。使用荧光抗人igg，通过facs检测抗pdl1抗体的能力。示例性的先导抗体候选物的结果数据如图26a和26b所示。
[0126]
阻断cd80-pdl1结合
[0127]
设计表达pdl1的dld1细胞，在存在或不存在抗pdl1 abs的情况下，其被用来检测与生物素标记的cd80-fc的结合，接着使用荧光链霉亲和素。本发明的示例性先导抗体候选物的结果数据如图27a和27b所示。
[0128]
半衰期测量
[0129]
使用雄性纯合tg32小鼠(b6.cg-fcgrttm1dcr tg(fcgrt)32dcr/dcrj，jackson labs)测量血清半衰期。第0天静脉滴注2mg/kg抗体，第1天及其后多个时间点抽血。制备血浆，用夹心elisa法测定抗体滴度。滴度归一化至第1天滴度。抗-抗体反应也被测量，并将高滴度样本从分析中移除，因为它们在elisa中经常出现突然的变化。本发明的示例性先导抗体候选物的结果数据如图28所示。不同抗体的半衰期从6.9天(3-1e4，详细序列参见下面实施例9)到10.5天(3-1b11，详细序列参见下面实施例11)和12.3天(4-1e8，详细序列参见下面实施例5)不等。
[0130]
多肽序列
[0131]
本发明的pd-l1结合多肽序列实施例如下所列：实施例1：抗体编号：4-1a2vh
[0132]
dna(seq id no:1)caggttcagctggtgcagtctgggactgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggatacaccttcaccagttatgatatcaactgggtgcgacaggccactggacaagggcttgagtggatgggatggatcaaccctaacagtggtggcacaaactatgcacagaagtttcagggcagggtcaccatgaccacagacacttctacgggcacagcctacatggagctgaggagcctgagatctgacgacacggccgtgtattactgtgcgagatttttatggggttcggggagttatgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctca
[0133]
氨基酸(seq id no:2)qvqlvqsgtevkkpgasvkvsckasgytftsydinwvrqatgqglewmgwinpnsggtnyaqkfqgrvtmttdtstgtaymelrslrsddtavyycarflwgsgsydywgqgtlvtvssvl
[0134]
dna(seq id no:3)gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggcaagtcagagcattagcagctatttaaattggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaagctcctgatctatgctgcatccagtttgcaaagtggggtcccatcaaggttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagtctgcaacctgaagatttcgcaacttactactgtcaacagacttacacattcccgcacacttttgcccaggggaccaacctggagatcaaa
[0135]
氨基酸(seq id no:4)diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqsissylnwyqqkpgkapklliyaasslqsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqtytfphtfaqgtnleik实施例2：抗体编号：4-1a12
vh
[0136]
dna(seq id no:5)caagtccagctggtacaatctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggttacacctttaccagctatggtatcagctgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggatggatcagcgcttacaatggtaacacaaactatgcacagaagctccagggcagagtcaccatgaccacagacacatccacgagcacagcctacatggagctgaggagcctgagatctgacgacacggccgtgtattactgtgcgagagattggatacagctatggttaccccttgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctca
[0137]
氨基酸(seq id no:6)qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftsygiswvrqapgqglewmgwisayngntnyaqklqgrvtmttdtststaymelrslrsddtavyycardwiqlwlpldywgqgtlvtvssvl
[0138]
dna(seq id no:7)gacatccagttgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggcaagtcagagcattagcagctatttaaattggtatcaacagaaaccagggaaagcccctaagctcctgatctatggtgcatccagtttggaaagtggggtcccatcaaggttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagtctgcaacctgaagattttgcaacttactactgtcaacagagtcacagttcccccctcactttcggcggagggaccaaggtggacatcaaa
[0139]
氨基酸(seq id no:8)diqltqspsslsasvgdrvtitcrasqsissylnwyqqkpgkapklliygasslesgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqshsspltfgggtkvdik实施例3：抗体编号：4-1b9vh
[0140]
dna(seq id no:9)gaagtgcagctggtgcagtctgggggaggcttggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtagctatggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatatcatatgatggaagtaataaatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagctgaggacacggctgtgtattactgtgcgaaagatttgatcccgttgcgagatagtaggggggggtactactacggtatggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcctcagggagt
[0141]
氨基酸(seq id no:10)evqlvqsggglvqpgrslrlscaasgftfssygmhwvrqapgkglewvavisydgsnkyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycakdliplrdsrggyyygmdvwgqgttvtvssvl
[0142]
dna(seq id no:11)tcttctgagctgactcaggaccctgctgtgtctgtggccttgggacagacagtcaggatcacatgccaaggagacagcctcagagactattatgcaagctggtaccagcagaagccaggacaggcccctgtacttgtcatctatggtaaaaacaaccggccctcaggaatcccagaccgattctctggctccagctcaggaaacacagcttccttgaccatcactgggactcaggcggaagatgaggctgactattactgtaactcccgtgacagcggtgcttaccattatgtcttcggaactgggaccaaggtcaccgtccta
[0143]
氨基酸(seq id no:12)sseltqdpavsvalgqtvritcqgdslrdyyaswyqqkpgqapvlviygknnrpsgipdrfsgsssgntasltitgtqaedeadyycnsrdsgayhyvfgtgtkvtvl实施例4：抗体编号：4-1b12vh
[0144]
dna(seq id no:13)caaatccagctggtgcagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtagctatggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatatcatatgatggaagtaataaatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagctgaggacacggctgtgtattactgtgcgaaaggaagtattataggggatggtgcttttgatatctggggccaagggacaatggtcaccgtctcttca
[0145]
氨基酸(seq id no:14)qiqlvqsgggvvqpgrslrlscaasgftfssygmhwvrqapgkglewvavisydgsnkyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycakgsiigdgafdiwgqgtmvtvssvl
[0146]
dna(seq id no:15)gatattgtgatgacccagtctccactctccctgcccgtcacccttggagagccggcctccatctcctgcaggtctagtcagaccctcctgcataatggattcaactttttggattggtacctgcagaagccagggcagtctccacaactcctgatgtatttggcctctagccgggcctccggggtccctgacaggttcagtggcagtggatcgggcacagatttcacactgaaaatcagcagagtggaggctgaggatgttggggtttattactgcatgcaaggtacacactggccgtacacttttggccaggggaccaagctggatatcaaa
[0147]
氨基酸(seq id no:16)divmtqsplslpvtlgepasiscrssqtllhngfnfldwylqkpgqspqllmylassrasgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyycmqgthwpytfgqgtkldik实施例5：抗体编号：4-1e8(e8)vh
[0148]
dna(seq id no:17)caaatccagctggtacaatctggggctgaggtgaagatgcctggggcctcagtgacgatttcctgcgaggcgtctggatacaacttcatcagctactatatacactgggtgcgacaggcccctggacaaggccttgagtggatgggattcgtcgtccctagtggtggtgccgcaggctacacacagaagttccagggcagactcaccgtgaccagggacacgtccacgagcacagtctacatggacctgaacagcctgacatctgacgacacggccgtgtattactgtgtgcgagaaatgagtggtggctggtttgatttctggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcg
[0149]
氨基酸(seq id no:18)qiqlvqsgaevkmpgasvtisceasgynfisyyihwvrqapgqglewmgfvvpsggaagytqkfqgrltvtrdtststvymdlnsltsddtavyycvremsggwfdfwgqgtlvtvssvl
[0150]
dna(seq id no:19)gacatcgtgatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggcaagtcagggcattagaaatgatttaggctggtatcagcaaaaaccagggaaagcccctaagctcctgatcta
tgctgcatccactttgcaaagtggggtcccatcaaggttcagcggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcaggctgaagatgtggcagtttattactgtcagcaatattatagtactcctctcactttcggccctgggaccaaagtggatatcaaa
[0151]
氨基酸(seq id no:20)divmtqspsslsasvgdrvtitcrasqgirndlgwyqqkpgkapklliyaastlqsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqaedvavyycqqyystpltfgpgtkvdik实施例6：抗体编号：4-1g7vh
[0152]
dna(seq id no:21)gaggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctgggtcctcggtgaaggtctcctgcaaggcttctggttacacctttaccagctatggtatcagctgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggatggatcagcgcttacaatggtaacacaaactatgcacagaagctccagggcagagtcaccatgaccacagacacatccacgagcacagcctacatggagctgaggagcctgagatctgacgacacggccgtgtattactgtgcgagagcctcaccggtacagcagcccatatggtgggcggagtactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctca
[0153]
氨基酸(seq id no:22)evqlvqsgaevkkpgssvkvsckasgytftsygiswvrqapgqglewmgwisayngntnyaqklqgrvtmttdtststaymelrslrsddtavyycaraspvqqpiwwaeywgqgtlvtvssvl
[0154]
dna(seq id no:23)cagtctgccctgactcagcctgcctccgtgtctgggtctcctggacagtcgatcaccatctcctgcactggaaccagcagtgacgttggtggttataactatgtctcctggtaccaacagcacccaggcaaagcccccaaactcatgatttctgatgtcagtaagcggccctcaggggtttctaatcgcttctctggctccaagtctggcaacacggcctccctgaccatctctgggctccaggctgaggacgaggctgattattactgcagctcatatacaagcaactacactttggtattcggcggagggaccaagctgaccgtccta
[0155]
氨基酸(seq id no:24)qsaltqpasvsgspgqsitisctgtssdvggynyvswyqqhpgkapklmisdvskrpsgvsnrfsgsksgntasltisglqaedeadyycssytsnytlvfgggtkltvl实施例7：抗体编号：4-1h10vh
[0156]
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[0157]
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[0240]
对本领域技术人员而言，本发明可以产生多种不同的修饰和变种，且不会脱离本
发明的范围或精神，是显而易见的。对本领域技术人员而言，参考本公开发明的说明书和实践，本发明的其它实施方案是显而易见的。我们希望说明书和实施例只是被认为是示例的，以下的权利要求书会对本发明的真正的范围和精神进行阐述。
[0241]
贯穿本技术，为更全面地描述和本发明有关的现有技术的情况，参考了不同的公开、专利、和/或专利申请。这些公开、专利、和/或专利申请的公开在本文中以其整体作为参考并入，就如同每一个单独的公开、专利、和/或专利申请专门地、单个地被指出作为参考并入。

技术特征：
id no:35组成。7.一种结合人pd-l1表位的抗体，包含与权利要求1-2任一项中所述的重链可变区和轻链可变区基本上相同的重链可变区和轻链可变区。8.一种药物组合物，包含权利要求1-4任一项所述的抗原结合多肽或权利要求7所述的抗体，及药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。9.权利要求1-4任一项所述的抗原结合多肽或权利要求7所述的抗体在制备治疗有需要的受试者的状况的药物中的用途。10.权利要求8所述的药物组合物在制备治疗有需要的受试者的状况的药物中的用途，所述用途包括：向所述受试者施用治疗有效量的的权利要求8所述的药物组合物；或向所述受试者施用治疗有效量的的权利要求8所述的药物组合物，联合(a)靶向其它免疫抑制通路的抗体；(b)化疗或放射治疗；(c)其它阻断免疫抑制通路的机制；或(d)其它免疫治疗剂。11.根据权利要求9-10任一项所述的用途，其中所述状况是哺乳动物癌症，该哺乳动物癌症选自下列所组成的群组中：卵巢癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌、骨髓瘤、神经母细胞源性中枢神经系统肿瘤、单核细胞白血病、b细胞源性白血病、t细胞源性白血病、b细胞源性淋巴瘤、t细胞源性淋巴瘤、肥大细胞肿瘤、黑色素瘤、膀胱癌、胃癌、肝癌、尿路上皮癌、皮肤癌、肾癌、头颈部癌、胰腺癌以及其组合。12.根据权利要求11所述的用途，其中所述哺乳动物癌症具有至少部分肿瘤细胞表达可检测量的pd-l1。13.一种哺乳动物表达系统，产生权利要求1-4任一项所述的抗原结合多肽。

技术总结
本发明提供了与具有ADCC和/或CDC活性的抗PD-L1抗体相关或来源于该抗体的新型组合物和方法。更具体地，本发明公开了结合PD-L1的完全人源抗体、PD-L1结合抗体片段和衍生物以及包含这些片段的PD-L1结合多肽。L1结合多肽。L1结合多肽。


技术研发人员：李嘉强 S
受保护的技术使用者：北京强新生物科技有限公司
技术研发日：2019.08.20
技术公布日：2023/7/13