一种荧光图像检测方法、系统、电子设备及介质

1.本发明主要涉及图像处理技术领域，特别涉及一种荧光图像检测方法、系统、电子设备及介质。


背景技术：

2.疾病是一个由量变到质变的过程，而有效的诊断是治疗疾病的第一步。高灵敏度、高特异性、可同时分析多种生物因子指标的高通量数字式诊断技术被认为是有望显著提高诊断能力的可靠方法。
3.数字式检测方法是一种可以有效降低检测误差、提高检测灵敏度的单分子检测方法：将含有待检测分子的检测液多次稀释后分散在成千上万个皮升级微反应单元中，使得理论上即单个反应单元内，最多有一个目标分子，每个反应单元内有检测底物和发光酶基团，当探针检测到目标分子时，特异性反应将催化酶底物发光，反应单元状态变为“1”，也就是“阳性”的信号状态，而未发生特异性反应的反应单元则呈现“0”，即“阴性”的信号状态。通过对这些反应单元状态的读取，即可推算出反应物的初始分子浓度。
4.微液滴(droplets)、微孔阵列(microarrays)是数字式单分子检测方法中的两种常用的反应单元隔离手段。其中，以微液滴为载体的检测方法，借助于专用的t型结构、流动聚焦结构等微流控芯片，可以在短时间内生成数十万个体积均一、封闭性好、分散性好的微液体反应单元。对于微孔阵列，则是通过化学蚀刻、物理蚀刻的方法构建出数万个物理隔离、排列整齐、可以容纳微升级别反应溶液的微反应单元(micro-wells)，每个反应单元内填充以5-10微米直径，偶联了特异性检测探针的编码微球，检测限(lod)可以低至斐升级别。两种检测手段均可以用于多重数字式核酸、蛋白标志物的检测。
5.然而，传统数字式检测过程中的图像处理方法并不适用于高通量、超灵敏的多重数字式核酸、蛋白检测过程中的复杂成像环境。因此，亟需一种能够有效检测出荧光图像中反应单元的荧光图像检测方法。


技术实现要素：

6.本技术的目的在于提供一种荧光图像检测方法、系统、电子设备及介质，有效地检测出荧光图像中的反应单元的同时，提高了图像检测准确率。
7.第一方面，本技术提供一种荧光图像检测方法，包括：获取待检测样品对应的荧光图像，荧光图像包括包含编码微球的微孔阵列荧光图像以及液滴荧光图像；基于局部多阈值分割识别方法，对微孔阵列荧光图像进行以编码微球为载体、基于微孔阵列的多重数字式检测信息提取，得到第一荧光检测信息；对液滴荧光图像进行以编码微球为载体、基于液滴的多重数字式检测信息提取，得到第二荧光检测信息；通过第一荧光检测信息和第二荧光检测信息得到待检测样品对应的荧光检测信息。
8.本技术中，能够获取待检测样品对应的荧光图像，荧光图像包括包含编码微球的微孔阵列荧光图像以及液滴荧光图像；然后基于局部多阈值分割识别方法，对微孔阵列荧
光图像进行以编码微球为载体、基于微孔阵列的多重数字式检测信息提取，得到第一荧光检测信息；同时对液滴荧光图像进行以编码微球为载体、基于液滴的多重数字式检测信息提取，得到第二荧光检测信息；最后通过第一荧光检测信息和第二荧光检测信息得到待检测样品对应的荧光检测信息。本技术实现了对预处理后的图像中的潜在反应单元的准确识别与分析。
9.在第一方面的一种实现方式中，获取待检测样品对应的荧光图像，包括：通过荧光显微镜对待检测样品进行检测，得到待检测样品对应的荧光图像。
10.本技术中，在获取待检测样品对应的荧光图像时，采用了荧光显微镜，主要包括激发光光源(包括但不限于led、氙灯、激光等类型)、滤光片(保留特定波长的光线，包括但不限于488nm、645nm、等带通频率)、样品台及拍摄样品(包括但不限于pb、pdms、pmma材料制备的微流控芯片，其中包含荧光编码微球、包裹反应底物的乳浊液滴)、物镜(聚焦光线透镜，包括但不限于x4、x10放大倍数)、图像传感器(图像传感器工作原理包括但不限于ccd(电荷耦合器件)、cmos(互补金属氧化物半导体))，本技术根据设定的参数拍摄并采集微流控芯片样品的图像数据信号(包括但不限于明场，cy5，ritc/fitc荧光通道暗场图像)，并通过数据线将图像信号传输到计算机处理系统中的存储器中，准备下一步的信号处理。
11.在第一方面的一种实现方式中，基于局部多阈值分割识别方法，对微孔阵列荧光图像进行以编码微球为载体、基于微孔阵列的多重数字式检测信息提取，得到第一荧光检测信息，包括：对微孔阵列荧光图像进行预处理，得到预处理后的微孔阵列荧光图像；通过局部多阈值分割识别方法识别出预处理后的微孔阵列荧光图像对应的第一编码微球信息，第一编码微球信息包括编码微球位置、编码微球边界及荧光强度信号；根据第一编码微球信息得到第一荧光检测信息。
12.本技术通过局部多阈值分割识别方法(lams，localized area multi-threshold segmentation)，实现了对预处理后的图像中的潜在反应单元(微球、微液滴)的准确识别与分析。
13.在第一方面的一种实现方式中，对微孔阵列荧光图像进行预处理，得到预处理后的微孔阵列荧光图像，包括：对微孔阵列荧光图像进行全图荧光强度均衡化、中值滤波、高斯滤波、形态学开运算以及结构体膨胀。
14.本技术中，数学形态学有2个基本的运算，即腐蚀和膨胀，而腐蚀和膨胀通过结合又形成了开运算和闭运算。形态学开运算即先腐蚀再膨胀，闭运算即先膨胀再腐蚀。结构体膨胀指使目标区域范围变大，将于目标区域接触的背景点合并到该目标物中，使目标边界向外部扩张，作用是用来填补目标区域中某些空洞以及消除包含在目标区域中的小颗粒噪声。本技术通过对微孔阵列荧光图像进行预处理，进一步提高了图像检测准确率。
15.在第一方面的一种实现方式中，通过局部多阈值分割识别方法识别出预处理后的微孔阵列荧光图像对应的第一编码微球信息，包括：当对预处理后的微孔阵列荧光图像进行第n次小区域识别时，获取与预处理后的微孔阵列荧光图像相对应的用于进行第n次小区域识别的灰度图像，迭代次数n为正整数；对用于进行第n次小区域识别的灰度图像进行二值化处理，得到第n次二值化图像；对第n次二值化图像进行小区域信息提取，得到第n次识别区域的识别区域信息；当识别区域信息满足预设筛选条件时，将第n次识别区域作为预处理后的微孔阵列荧光图像中的一个反应单元；将第n次二值化图像中第n次识别区域的像素
点数值设置为第一数值，得到用于进行第n+1次小区域识别的灰度图像；当预处理后的微孔阵列荧光图像内所有反应单元均经过二值化识别筛选处理时，将各个识别区域的识别区域信息作为预处理后的微孔阵列荧光图像对应的第一编码微球信息。
16.在第一方面的一种实现方式中，当识别区域信息满足预设筛选条件时，将第n次识别区域作为预处理后的微孔阵列荧光图像中的一个反应单元，其中，预设筛选条件包括区域面积筛选条件、离心率筛选条件、圆度筛选条件和凸包率筛选条件；区域面积筛选条件为：识别区域的面积大于最小允许面积minvalidarea且小于最大允许面积maxvalidarea；其中，最小允许面积minvalidarea＝d
index
×
0.75
×rreal2
×
π，最大允许面积maxvalidarea＝d
index
×
1.25
×rreal2
×
π，r
real
为实际微球平均半径，d
index
为衰减系数，basethresh为初始的二值化阈值，curthreshn为第n次二值化过程中的实际阈值，bitdepth为图像位深；离心率筛选条件为：当第n次二值化过程中的实际阈值curthreshn小于预设二值化阈值时，允许的识别区域离心率范围：validecc∈[0.75,2]；当curthresh不小于预设二值化阈值时，允许的识别区域离心率范围：validecc∈[0.75
×dindex
,2]；圆度筛选条件为：roundness∈[0.75,2]，识别区域的圆度roundness＝4
×
π
×
area/(perimeter)2，其中perimeter为识别到的区域的轮廓周长，area为识别区域的面积；凸包率筛选条件为：识别区域的凸包率大于凸包率阈值。
[0017]
在第一方面的一种实现方式中，通过局部多阈值分割识别方法识别出预处理后的微孔阵列荧光图像对应的第一编码微球信息，还包括：当识别区域信息不满足预设筛选条件时，获取进行第n+1次小区域识别的二值化阈值curthresh
n+1
，进行第n+1次小区域识别的二值化阈值curthresh
n+1
＝basethresh+(n+1)
×
stepvalue，basethresh为初始的二值化阈值，stepvalue为步进梯度数值。
[0018]
在第一方面的一种实现方式中，对液滴荧光图像进行以编码微球为载体、基于液滴的多重数字式检测信息提取，得到第二荧光检测信息，液滴荧光图像包括有编码微球的编码信号图像以及有液滴中探针的报告信号图像，包括：基于局部多阈值分割识别方法，分别对有编码微球的编码信号图像以及有液滴中探针的报告信号图像进行区域提取，得到液滴荧光图像信息。
[0019]
在第一方面的一种实现方式中，荧光图像检测方法还包括：对液滴包裹微球的状态进行判定；液滴荧光图像信息包括编码微球荧光信息以及液滴信息，基于编码微球荧光信息，从有编码微球的编码信号图像识别到的微球结构体中提取经过校正的微球形心位置参数，记为b(x1，y1)；基于液滴信息，从有液滴中探针的报告信号图像得到经过校正的单个液滴结构体的中心坐标位置参数，记为d(x0，y0)；当经过校正的微球形心位置参数满足时，判定识别到的微球结构体被液滴包裹，r
drop
为单个液滴的半径，d0、h0分别为坐标的修正系数，θ为距离系数。
[0020]
在第一方面的一种实现方式中，液滴荧光图像信息包括液滴包裹编码微球个数，对液滴包裹微球的状态进行判定，还包括：当根据液滴包裹编码微球个数判定液滴包裹微球的状态为空液滴、包裹单微球或包裹多个微球。
[0021]
本技术在数字液滴的图像检测过程中，实现了对荧光图像内单个液滴的分割、识别、参数提取，此外还实现了对液滴包裹编码微球状态(没有包裹微球、包裹单个编码微球、
包裹2个及以上编码微球)的判别功能，进一步提高微球统计结果的准确性。
[0022]
第二方面，本技术提供一种荧光图像检测系统，包括图像获取模块，用于获取待检测样品对应的荧光图像，荧光图像包括包含编码微球的微孔阵列荧光图像以及液滴荧光图像；第一图像检测模块，用于基于局部多阈值分割识别方法，对微孔阵列荧光图像进行以编码微球为载体、基于微孔阵列的多重数字式检测信息提取，得到第一荧光检测信息；第二图像检测模块，用于对液滴荧光图像进行以编码微球为载体、基于液滴的多重数字式检测信息提取，得到第二荧光检测信息；信息获取模块，用于通过第一荧光检测信息和第二荧光检测信息得到待检测样品对应的荧光检测信息。
[0023]
第三方面，本技术提供了一种电子设备，电子设备包括：存储器，存储器存储有多条指令；处理器，处理器从存储器中加载指令，以执行如上述任一种荧光图像检测方法中的步骤。
[0024]
第四方面，本技术提供了一种计算机可读存储介质，其上存储有计算机程序，该程序被电子设备执行时实现上述任一种荧光图像检测方法中的步骤。
[0025]
本技术通过荧光图像检测方法实现对液滴包裹的编码微球、悬浮在微孔阵列反应液中的编码微球位置、边界的识别及荧光强度等信号的提取，本技术解决了高通量的多重数字式检测过程中，对荧光图像中，高密度的反应单元(编码微球、液滴)信号的准确识别问题，以及以编码微球为载体的多重数字式液滴检测过程中，液滴包裹微球状态(空液滴，单微球包裹，多微球包裹)的准确判读问题。本技术不仅能实现对荧光图像内的液滴、微孔阵列反应单元位置信息的准确识别，还能够准确判别反应单元的单微球包裹、多微球包裹等状态，实现了更高的数据统计准确度；本技术同时适用于使用cmod或ccd相机单元拍摄的反应腔室图像信号分析，且不依靠荧光素等试剂做辅助成像，降低了实验复杂性。
附图说明
[0026]
图1为本技术一实施例的应用场景示意图。
[0027]
图2a为本技术一实施例的荧光图像检测方法的流程示意图。
[0028]
图2b为本技术一实施例的编码信号图像与报告信号图像对比示意图。
[0029]
图3为本技术一实施例的荧光图像检测系统的结构示意图。
[0030]
图4为本技术一实施例的电子设备的结构示意图。
具体实施方式
[0031]
以下通过特定的具体实例说明本技术的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本技术的其他优点与功效。本技术还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本技术的精神下进行各种修饰或改变。需说明的是，在不冲突的情况下，以下实施例及实施例中的特征可以相互组合。
[0032]
需要说明的是，以下实施例中所提供的图示仅以示意方式说明本技术的基本构想，遂图式中仅显示与本技术中有关的组件而非按照实际实施时的组件数目、形状及尺寸绘制，其实际实施时各组件的型态、数量及比例可为一种随意的改变，且其组件布局型态也可能更为复杂。
[0033]
对于微液滴(droplets)、微孔阵列(microarrays)对应两种反应单元，如何实现稳定快速的信号捕获方法，是实现高通量、精准的数字式核酸、蛋白检测的前提。考虑到制作成本和检测效率，基于cmos或ccd感光元器件的拍照、计算机对图像处理的方法被是实现对每个反应单元识别、荧光信号读取的有效方法，也是目前实验研究和设备商业的主流发展方向。
[0034]
在以微液滴作为反应单元的数字检测过程中，在保证反应效率的前提下，为了容纳更多反应单元，需要使用更小尺寸的液滴单元，同时液滴间排列更加紧密，收集腔室内得以铺开更多液滴。
[0035]
而在以微孔阵列作为反应单元的固相芯片上，可供使用的反应单元数量有限，而为了装载更多的待测液，就需要尽量提高反应腔室装载量到100％，使用更小放大倍数的物镜使得单张图像内可以容纳更多反应单元。为了能在短时间内实现对大量反应单元拍摄成像，荧光显微镜的物镜放大倍数应尽量小，而这会造成拍摄成片效果较差，图像内的单个反应单元占有的像素尺寸较小，更加不容易识别。此外，由于采用了多重的检测探针，反应单元之间的荧光信号强度差异也会较大。
[0036]
而当图像内大量反应单元相互紧邻在一起时，图像识别的难度显著提高：单张图片中，分布着大量液滴，拍摄过程中的光照不均衡导致单个反应单元的识别困难；反应单元相互靠近，使得单元之间荧光信号的串扰更加严重，这会严重干扰到后期数据的准确性，进一步影响数据计算质量。
[0037]
在液滴图像中，紧密相邻的液滴会因为表界面相互的挤压作用而从荧光图像上看起来像粘连在一起，不同荧光单元的信号间难以完全区分识别。
[0038]
微孔阵列图像中，编码微球的荧光强度分布范围很大，使得部分微球信噪比不高，且荧光信号较弱的微球即以受周围高荧光信号微球散射光线的影响，使得其形态不容易被分辨。
[0039]
经实验发现，传统数字式检测过程中的图像处理方法并不适用于高通量、超灵敏的多重数字式核酸、蛋白检测过程中的复杂成像环境。而针对该领域的问题还没有太多公开的文献、资料以实现稳定的高通量数字式反应单元识别，因此本技术提出了一种荧光图像检测方法、系统、电子设备及介质，可以稳定识别高通量的多重数字式核酸、蛋白检测图像，并得到可靠结果。
[0040]
本技术以下实施例提供了一种荧光图像检测方法、系统、电子设备及介质，其中，该荧光图像检测系统具体可以集成在电子设备中，该电子设备可以为终端、服务器等设备。其中，终端可以为手机、平板电脑、智能蓝牙设备、笔记本电脑、或者个人电脑(personal computer，pc)等设备；服务器可以是单一服务器，也可以是由多个服务器组成的服务器集群。
[0041]
在一些实施例中，该荧光图像检测系统还可以集成在多个电子设备中，比如，该荧光图像检测系统可以集成在多个服务器中，由多个服务器来实现本技术的该荧光图像检测方法。
[0042]
在一些实施例中，服务器也可以以终端的形式来实现。
[0043]
例如，图1为本技术一实施例的应用场景示意图，该应用场景中可以包括荧光显微镜11、存储终端12、服务器13等，荧光显微镜11可以包括待检测样品、物镜、光源、分光片、滤
光片、图像传感器等。存储终端12可以用于存储待检测样品对应的荧光图像等，荧光显微镜11、存储终端12、服务器13之间相互通信连接，在此不再赘述。
[0044]
其中，服务器13可以包括处理器和存储器等。服务器13可以包括图像数据读取模块：调用相关程序接口/函数功能(如matlab中的imread()函数，opencv中的cv2.imread()函数)，按照一定的读取顺序、将图像数据从存储介质(硬盘，包括但不限于ssd固态硬盘、hdd机械硬盘)转移到计算机的内存介质中。
[0045]
服务器13还可以包括荧光编码微球的图像识别模块，使用一系列的图像处理方法实现对液滴包裹的编码微球、悬浮在微孔阵列反应液中的编码微球位置、边界的识别及荧光强度信号提取；即服务器13可以获取待检测样品对应的荧光图像，荧光图像包括包含编码微球的微孔阵列荧光图像以及液滴荧光图像；基于局部多阈值分割识别方法，对微孔阵列荧光图像进行以编码微球为载体、基于微孔阵列的多重数字式检测信息提取，得到第一荧光检测信息；对液滴荧光图像进行以编码微球为载体、基于液滴的多重数字式检测信息提取，得到第二荧光检测信息；通过第一荧光检测信息和第二荧光检测信息得到待检测样品对应的荧光检测信息等。
[0046]
下面将结合本技术实施例中的附图，对本技术实施例中的技术方案进行详细描述。
[0047]
如图2a所示，以服务器13为执行主体，本实施例提供一种荧光图像检测方法，包括步骤s210至步骤s240，如下：
[0048]
s210、服务器13获取待检测样品对应的荧光图像，荧光图像包括包含编码微球的微孔阵列荧光图像以及液滴荧光图像。
[0049]
在一实施例中，获取待检测样品对应的荧光图像，包括：通过荧光显微镜对待检测样品进行检测，得到待检测样品对应的荧光图像。
[0050]
本技术中，在获取待检测样品对应的荧光图像时，采用了荧光显微镜，主要包括激发光光源(包括但不限于led、氙灯、激光等类型)、滤光片(保留特定波长的光线，包括但不限于488nm、645nm、等带通频率)、样品台及拍摄样品(包括但不限于pb、pdms、pmma材料制备的微流控芯片，其中包含荧光编码微球、包裹反应底物的乳浊液滴)、物镜(聚焦光线透镜，包括但不限于x4、x10放大倍数)、图像传感器(图像传感器工作原理包括但不限于ccd(电荷耦合器件)、cmos(互补金属氧化物半导体))，本技术根据设定的参数拍摄并采集微流控芯片样品的图像数据信号(包括但不限于明场，cy5，ritc/fitc荧光通道暗场图像)，并通过数据线将图像信号传输到计算机处理系统中的存储器中，准备下一步的信号处理。
[0051]
s220、基于局部多阈值分割识别方法，对微孔阵列荧光图像进行以编码微球为载体、基于微孔阵列的多重数字式检测信息提取，得到第一荧光检测信息。
[0052]
在一实施例中，基于局部多阈值分割识别方法，对微孔阵列荧光图像进行以编码微球为载体、基于微孔阵列的多重数字式检测信息提取，得到第一荧光检测信息，包括：对微孔阵列荧光图像进行预处理，得到预处理后的微孔阵列荧光图像；通过局部多阈值分割识别方法识别出预处理后的微孔阵列荧光图像对应的第一编码微球信息，第一编码微球信息包括编码微球位置、编码微球边界及荧光强度信号；根据第一编码微球信息得到第一荧光检测信息。
[0053]
本实施例中，对微孔阵列荧光图像进行以编码微球为载体、基于微孔阵列的多重
数字式检测信息提取部分的微球识别流程可以包括：图像预处理
→
局部多阈值分割识别方法
→
数据汇总三部分。其中，lams方法实现对高填充率编码微球荧光图像中的微球识别。数据汇总可以实现对不同通道荧光图像所识别液滴的信息(记录了识别到的单个微球位置、边界区域、圆度、离心率等数据信息的结构体变量)整合、去除重复数据(结构体)的过程。
[0054]
本技术通过提局部多阈值分割识别方法(lams，localized area multi-threshold segmentation)，lams方法实现对高填充率编码微球荧光图像中的微球识别，实现了对预处理后的图像中的潜在反应单元的准确识别与分析。
[0055]
在一实施例中，对微孔阵列荧光图像进行预处理，得到预处理后的微孔阵列荧光图像，包括：对微孔阵列荧光图像进行全图荧光强度均衡化、中值滤波、高斯滤波、形态学开运算以及结构体膨胀。
[0056]
本技术中，数学形态学有2个基本的运算，即腐蚀和膨胀，而腐蚀和膨胀通过结合又形成了开运算和闭运算。形态学开运算即先腐蚀再膨胀，闭运算即先膨胀再腐蚀。结构体膨胀指使目标区域范围变大，将于目标区域接触的背景点合并到该目标物中，使目标边界向外部扩张，作用是用来填补目标区域中某些空洞以及消除包含在目标区域中的小颗粒噪声。本技术通过对微孔阵列荧光图像进行预处理，进一步提高了图像检测准确率。
[0057]
具体地，图像预处理过程可以包括：全图荧光强度均衡化，中值滤波(模板大小：5像素)，高斯滤波(参数σ＝0.25)，形态学开运算(disk圆形结构体，半径为3)，结构体膨胀(disk圆形结构体，半径为3)。
[0058]
在一实施例中，通过局部多阈值分割识别方法识别出预处理后的微孔阵列荧光图像对应的第一编码微球信息，包括：当对预处理后的微孔阵列荧光图像进行第n次小区域识别时，获取与预处理后的微孔阵列荧光图像相对应的用于进行第n次小区域识别的灰度图像，迭代次数n为正整数；对用于进行第n次小区域识别的灰度图像进行二值化处理，得到第n次二值化图像；对第n次二值化图像进行小区域信息提取，得到第n次识别区域的识别区域信息；当识别区域信息满足预设筛选条件时，将第n次识别区域作为预处理后的微孔阵列荧光图像中的一个反应单元；将第n次二值化图像中第n次识别区域的像素点数值设置为第一数值，得到用于进行第n+1次小区域识别的灰度图像；当预处理后的微孔阵列荧光图像内所有反应单元均经过二值化识别筛选处理时，将各个识别区域的识别区域信息作为预处理后的微孔阵列荧光图像对应的第一编码微球信息。
[0059]
在一实施例中，当识别区域信息满足预设筛选条件时，将第n次识别区域作为预处理后的微孔阵列荧光图像中的一个反应单元，其中，预设筛选条件包括区域面积筛选条件、离心率筛选条件、圆度筛选条件和凸包率筛选条件；区域面积筛选条件为：识别区域的面积大于最小允许面积minvalidarea且小于最大允许面积maxvalidarea；其中，最小允许面积minvalidarea＝d
index
×
0.75
×rreal2
×
π，最大允许面积maxvalidarea＝d
index
×
1.25
×rreal2
×
π，r
real
为实际微球平均半径，d
index
为衰减系数，为衰减系数，basethresh为初始的二值化阈值，curthreshn为第n次二值化过程中的实际阈值，bitdepth为图像位深；离心率筛选条件为：当第n次二值化过程中的实际阈值curthreshn小于预设二值化阈值时，允许的识别区域离心率范围：validecc∈[0.75,2]；当curthresh不小于预设二值化阈值时，允许的识别区域离心率范
围：validecc∈[0.75
×dindex
,2]；圆度筛选条件为：roundness∈[0.75,2]，识别区域的圆度roundness＝4
×
π
×
area/(perimeter)2，其中perimeter为识别到的区域的轮廓周长，area为识别区域的面积；凸包率筛选条件为：识别区域的凸包率大于凸包率阈值。
[0060]
在一实施例中，通过局部多阈值分割识别方法识别出预处理后的微孔阵列荧光图像对应的第一编码微球信息，还包括：当识别区域信息不满足预设筛选条件时，获取进行第n+1次小区域识别的二值化阈值curthresh
n+1
，进行第n+1次小区域识别的二值化阈值curthresh
n+1
＝basethresh+(n+1)
×
stepvalue，basethresh为初始的二值化阈值，stepvalue为步进梯度数值。
[0061]
本实施例在有效区域筛选过程中，随着二值化阈值curthresh的增长，二值化后的有效区域会逐步减小，所以本技术提出了一种根据二值化阈值curthresh的动态筛选方程：首先计算出像素面积、凸面积比、离心率、圆度的衰减系数dindex，然后根据衰减系数dindex能够确定在不同二值化阈值curthresh下，潜在反应单元区域的筛选条件：区域面积筛选条件、离心率筛选条件、圆度筛选条件和凸包率筛选条件。对于不满足上述几个筛选条件的识别小区域，则被输入进下一轮的识别过程里。对于每一个子区域，下一轮的二值化阈值设定为curthresh＝basethresh+(n+1)
×
stepvalue，然后提取二值化的子区域信息并使用上述筛选条件进行筛选。
[0062]
当图像经过二值化后完全没有识别到任何小区域的信息，或迭代次数stepcount等于最大迭代次数maxstepcount时，则图像识别过程结束。
[0063]
具体地，本实施例中，首先初始化结构体变量validregions，用于存储筛选后的有效反应单元区域信息。然后设定初始的二值化阈值basethresh，步进梯度数值stepvalue，最大迭代次数maxstepcount，对于第n(n＝1，2，3，
…
，maxstepcount)次小区域识别，多次对输入的灰度图像进行二值化处理，二值化阈值设定为curthresh＝basethresh+n
×
stepvalue。即随着小区域内的迭代次数增加，二值化阈值curthresh也会有相应提高。本实施例中，二值化处理指一张灰度图像里的一个像素点数值介于0-65535(16bit位深)之间，经二值化处理后，二值化图像中的一个像素点数值只有0、1两种，其中0信号代表背景，1代表有效信号。
[0064]
本实施例中，在每次的二值化后，对获得的二值化图像进行小区域信息提取(二值化图像中，0信号为背景，1信号为有效像素点)，分别计算出小区域的像素面积、最小凸面积比率、离心率(长轴、短轴比)、圆度、形心坐标、识别区域的外切方框坐标(boundingbox)数据，所有数据结果可以以结构体列表的方式保存在计算机内存中。
[0065]
接着对获取到的识别区域信息(结构体列表)按照如下的方法进行筛选、剔除，对于满足下述所有筛选条件的识别区域，认为是图像中的反应单元，则将其数据保存到结构体列表validregions变量中。接着使用区域的boundingbox信息，使用赋值方法将灰度图像中对应区域的像素点数值设置为0，即只保留不符合本次筛选条件的图像信息。
[0066]
本实施例在单次二值化图像的识别过程中，不符合本次筛选条件的区域，会进入到下一轮识别：将识别次数变量stepcount加1，即提高curthresh的数值到curthresh＝basethresh+(n+1)
×
stepvalue。并对输入图像重新进行二值化和图像内的小区域信息提取、筛选过程。
[0067]
当某个区域的迭代次数(n)等于设定的最大迭代次数maxstepcount时，程序结束
识别过程，返回汇总的validregions结构体列表信息。在该阈值下(curthresh＝basethresh+maxstepcount
×
stepvalue)的二值化图像中，仍然不满足下述筛选条件的小区域，不再进行进一步识别。当图像内所有潜在反应单元均经过二值化识别筛选处理后，处理系统返回validregions变量信息。
[0068]
s230、对液滴荧光图像进行以编码微球为载体、基于液滴的多重数字式检测信息提取，得到第二荧光检测信息。
[0069]
如图2b所示，左边为有编码微球的编码信号图像，右边为有液滴中探针的报告信号图像。在一实施例中，对液滴荧光图像进行以编码微球为载体、基于液滴的多重数字式检测信息提取，得到第二荧光检测信息，液滴荧光图像包括有编码微球的编码信号图像以及有液滴中探针的报告信号图像，包括：基于局部多阈值分割识别方法，分别对有编码微球的编码信号图像以及有液滴中探针的报告信号图像进行区域提取，得到液滴荧光图像信息。
[0070]
在一实施例中，荧光图像检测方法还包括：对液滴包裹微球的状态进行判定；液滴荧光图像信息包括编码微球荧光信息以及液滴信息，基于编码微球荧光信息，从有编码微球的编码信号图像识别到的微球结构体中提取经过校正的微球形心位置参数，记为b(x1，y1)；基于液滴信息，从有液滴中探针的报告信号图像得到经过校正的单个液滴结构体的中心坐标位置参数，记为d(x0，y0)；当经过校正的微球形心位置参数满足时，判定识别到的微球结构体被液滴包裹，r
drop
为单个液滴的半径，d0、h0分别为坐标的修正系数，θ为距离系数。d0、h0分别为坐标的修正系数，以降低拍摄过程中不同截止频率的滤波片为带来的图像偏移情况。θ为距离系数，可根据实际的液滴尺寸、均一程度进行调整。
[0071]
本实施例中，对于单个编码微球，通过一个可靠的计算方法(小区域距离提取+欧式距离判定)，实现了微球和其所在液滴的判断。
[0072]
在一实施例中，液滴荧光图像信息包括液滴包裹编码微球个数，对液滴包裹微球的状态进行判定，还包括：当根据液滴包裹编码微球个数判定液滴包裹微球的状态为空液滴、包裹单微球或包裹多个微球。
[0073]
本技术在数字液滴的图像检测过程中，实现了对荧光图像内单个液滴的分割、识别、参数提取，此外还实现了对液滴包裹编码微球状态(没有包裹微球、包裹单个编码微球、包裹2个及以上编码微球)的判别功能，进一步提高微球统计结果的准确性。
[0074]
s240、通过第一荧光检测信息和第二荧光检测信息得到待检测样品对应的荧光检测信息。
[0075]
现有技术中，目前尚没有商业化的、可以实现基于编码微球的多重数字式液滴检测设备，也无法利用编码微球实现目标分子的检测。尽管quanterix的simoa技术(产品如qh-1)可以实现以微孔阵列为载体，基于编码微球的多重数字式检测，但是根据公开数据(文献，专利介绍：)，其尚不具备高编码重数下的准确检测能力。
[0076]
本技术中，能够获取待检测样品对应的荧光图像，荧光图像包括包含编码微球的微孔阵列荧光图像以及液滴荧光图像；然后基于局部多阈值分割识别方法，对微孔阵列荧光图像进行以编码微球为载体、基于微孔阵列的多重数字式检测信息提取，得到第一荧光检测信息；同时对液滴荧光图像进行以编码微球为载体、基于液滴的多重数字式检测信息提取，得到第二荧光检测信息；最后通过第一荧光检测信息和第二荧光检测信息得到待检
测样品对应的荧光检测信息。本技术实现了对预处理后的图像中的潜在反应单元的准确识别与分析。
[0077]
本技术通过荧光图像检测方法实现对液滴包裹的编码微球、悬浮在微孔阵列反应液中的编码微球位置、边界的识别及荧光强度等信号的提取，本技术解决了高通量的多重数字式检测过程中，对荧光图像中，高密度的反应单元(编码微球、液滴)信号的准确识别问题，以及以编码微球为载体的多重数字式液滴检测过程中，液滴包裹微球状态(空液滴，单微球包裹，多微球包裹)的准确判读问题。本技术不仅能实现对荧光图像内的液滴、微孔阵列反应单元位置信息的准确识别，还能够准确判别反应单元的单微球包裹、多微球包裹等状态，实现了更高的数据统计准确度；本技术同时适用于使用cmod或ccd相机单元拍摄的反应腔室图像信号分析，且不依靠荧光素等试剂做辅助成像，降低了实验复杂性。
[0078]
本技术实施例的荧光图像检测方法的保护范围不限于本实施例列举的步骤执行顺序，凡是根据本技术的原理所做的现有技术的步骤增减、步骤替换所实现的方案都包括在本技术的保护范围内。
[0079]
本技术实施例还提供一种荧光图像检测系统，荧光图像检测系统可以实现本技术的荧光图像检测方法，但本技术的荧光图像检测方法的实现装置包括但不限于本实施例列举的荧光图像检测系统的结构，凡是根据本技术的原理所做的现有技术的结构变形和替换，都包括在本技术的保护范围内。
[0080]
如图3所示，本技术还提供了一种荧光图像检测系统，包括图像获取模块310、第一图像检测模块320、第二图像检测模块330和信息获取模块340。其中，图像获取模块310，被配置于获取待检测样品对应的荧光图像，荧光图像包括包含编码微球的微孔阵列荧光图像以及液滴荧光图像；第一图像检测模块320，被配置于基于局部多阈值分割识别方法，对微孔阵列荧光图像进行以编码微球为载体、基于微孔阵列的多重数字式检测信息提取，得到第一荧光检测信息；第二图像检测模块330，被配置于对液滴荧光图像进行以编码微球为载体、基于液滴的多重数字式检测信息提取，得到第二荧光检测信息；信息获取模块340，被配置于通过第一荧光检测信息和第二荧光检测信息得到待检测样品对应的荧光检测信息。
[0081]
本技术中，能够获取待检测样品对应的荧光图像，荧光图像包括包含编码微球的微孔阵列荧光图像以及液滴荧光图像；然后基于局部多阈值分割识别方法，对微孔阵列荧光图像进行以编码微球为载体、基于微孔阵列的多重数字式检测信息提取，得到第一荧光检测信息；同时对液滴荧光图像进行以编码微球为载体、基于液滴的多重数字式检测信息提取，得到第二荧光检测信息；最后通过第一荧光检测信息和第二荧光检测信息得到待检测样品对应的荧光检测信息。本技术实现了对预处理后的图像中的潜在反应单元的准确识别与分析。
[0082]
在一实施例中，图像获取模块310包括图像获取子模块，图像获取子模块被配置于：通过荧光显微镜对待检测样品进行检测，得到待检测样品对应的荧光图像。
[0083]
本技术中，在获取待检测样品对应的荧光图像时，采用了荧光显微镜，主要包括激发光光源(包括但不限于led、氙灯、激光等类型)、滤光片(保留特定波长的光线，包括但不限于488nm、645nm、等带通频率)、样品台及拍摄样品(包括但不限于pb、pdms、pmma材料制备的微流控芯片，其中包含荧光编码微球、包裹反应底物的乳浊液滴)、物镜(聚焦光线透镜，包括但不限于x4、x10放大倍数)、图像传感器(图像传感器工作原理包括但不限于ccd(电荷
耦合器件)、cmos(互补金属氧化物半导体))，本技术根据设定的参数拍摄并采集微流控芯片样品的图像数据信号(包括但不限于明场，cy5，ritc/fitc荧光通道暗场图像)，并通过数据线将图像信号传输到计算机处理系统中的存储器中，准备下一步的信号处理。
[0084]
在一实施例中，第一图像检测模块320包括第一图像检测子模块，第一图像检测子模块被配置于：对微孔阵列荧光图像进行预处理，得到预处理后的微孔阵列荧光图像；通过局部多阈值分割识别方法识别出预处理后的微孔阵列荧光图像对应的第一编码微球信息，第一编码微球信息包括编码微球位置、编码微球边界及荧光强度信号；根据第一编码微球信息得到第一荧光检测信息。
[0085]
本技术通过提局部多阈值分割识别方法(lams，localized area multi-threshold segmentation)，lams方法实现对高填充率编码微球荧光图像中的微球识别，实现了对预处理后的图像中的潜在反应单元的准确识别与分析。
[0086]
在一实施例中，第一图像检测子模块包括预处理模块，预处理模块被配置于：对微孔阵列荧光图像进行全图荧光强度均衡化、中值滤波、高斯滤波、形态学开运算以及结构体膨胀。
[0087]
本技术中，数学形态学有2个基本的运算，即腐蚀和膨胀，而腐蚀和膨胀通过结合又形成了开运算和闭运算。形态学开运算即先腐蚀再膨胀，闭运算即先膨胀再腐蚀。结构体膨胀指使目标区域范围变大，将于目标区域接触的背景点合并到该目标物中，使目标边界向外部扩张，作用是用来填补目标区域中某些空洞以及消除包含在目标区域中的小颗粒噪声。本技术通过对微孔阵列荧光图像进行预处理，进一步提高了图像检测准确率。
[0088]
在一实施例中，第一图像检测子模块包括识别模块，识别模块被配置于：当对预处理后的微孔阵列荧光图像进行第n次小区域识别时，获取与预处理后的微孔阵列荧光图像相对应的用于进行第n次小区域识别的灰度图像，迭代次数n为正整数；对用于进行第n次小区域识别的灰度图像进行二值化处理，得到第n次二值化图像；对第n次二值化图像进行小区域信息提取，得到第n次识别区域的识别区域信息；当识别区域信息满足预设筛选条件时，将第n次识别区域作为预处理后的微孔阵列荧光图像中的一个反应单元；将第n次二值化图像中第n次识别区域的像素点数值设置为第一数值，得到用于进行第n+1次小区域识别的灰度图像；当预处理后的微孔阵列荧光图像内所有反应单元均经过二值化识别筛选处理时，将各个识别区域的识别区域信息作为预处理后的微孔阵列荧光图像对应的第一编码微球信息。
[0089]
在一实施例中，在一实施例中，当识别区域信息满足预设筛选条件时，将第n次识别区域作为预处理后的微孔阵列荧光图像中的一个反应单元，其中，预设筛选条件包括区域面积筛选条件、离心率筛选条件、圆度筛选条件和凸包率筛选条件；区域面积筛选条件为：识别区域的面积大于最小允许面积minvalidarea且小于最大允许面积maxvalidarea；其中，最小允许面积minvalidarea＝d
index
×
0.75
×rreal2
×
π，最大允许面积maxvalidarea＝d
index
×
1.25
×rreal2
×
π，r
real
为实际微球平均半径，d
index
为衰减系数，basethresh为初始的二值化阈值，curthreshn为第n次二值化过程中的实际阈值，bitdepth为图像位深；离心率筛选条件为：当第n次二值化过程中的实际阈值curthreshn小于预设二值化阈值时，允许的识别区域离
心率范围：validecc∈[0.75,2]；当curthresh不小于预设二值化阈值时，允许的识别区域离心率范围：validecc∈[0.75
×dindex
,2]；圆度筛选条件为：roundness∈[0.75,2]，识别区域的圆度roundness＝4
×
π
×
area/(perimeter)2，其中perimeter为识别到的区域的轮廓周长，area为识别区域的面积；凸包率筛选条件为：识别区域的凸包率大于凸包率阈值。
[0090]
在一实施例中，识别模块还包括识别子模块，识别子模块被配置于：当识别区域信息不满足预设筛选条件时，获取进行第n+1次小区域识别的二值化阈值curthresh
n+1
，进行第n+1次小区域识别的二值化阈值curthresh
n+1
＝basethresh+(n+1)
×
stepvalue，basethresh为初始的二值化阈值，stepvalue为步进梯度数值。
[0091]
在一实施例中，液滴荧光图像包括有编码微球的编码信号图像以及有液滴中探针的报告信号图像，第二图像检测模块包括第二图像检测子模块，第二图像检测子模块被配置于：基于局部多阈值分割识别方法，分别对有编码微球的编码信号图像以及有液滴中探针的报告信号图像进行区域提取，得到液滴荧光图像信息。
[0092]
在一实施例中，荧光图像检测系统还包括第一判别模块，第一判别模块被配置于：对液滴包裹微球的状态进行判定；液滴荧光图像信息包括编码微球荧光信息以及液滴信息，基于编码微球荧光信息，从有编码微球的编码信号图像识别到的微球结构体中提取经过校正的微球形心位置参数，记为b(x1，y1)；基于液滴信息，从有液滴中探针的报告信号图像得到经过校正的单个液滴结构体的中心坐标位置参数，记为d(x0，y0)；当经过校正的微球形心位置参数满足时，判定识别到的微球结构体被液滴包裹，r
drop
为单个液滴的半径，d0、h0分别为坐标的修正系数，θ为距离系数。
[0093]
在一实施例中，液滴荧光图像信息包括液滴包裹编码微球个数，第一判别模块包括第一判别子模块，第一判别子模块被配置于：当根据液滴包裹编码微球个数判定液滴包裹微球的状态为空液滴、包裹单微球或包裹多个微球。
[0094]
本技术在数字液滴的图像检测过程中，实现了对荧光图像内单个液滴的分割、识别、参数提取，此外还实现了对液滴包裹编码微球状态(没有包裹微球、包裹单个编码微球、包裹2个及以上编码微球)的判别功能，进一步提高微球统计结果的准确性。
[0095]
具体实施时，以上各个模块可以作为独立的实体来实现，也可以进行任意组合，作为同一或若干个实体来实现，以上各个模块的具体实施可参见前面的方法实施例，在此不再赘述。
[0096]
由上可知，本技术通过荧光图像检测方法实现对液滴包裹的编码微球、悬浮在微孔阵列反应液中的编码微球位置、边界的识别及荧光强度等信号的提取，本技术解决了高通量的多重数字式检测过程中，对荧光图像中，高密度的反应单元(编码微球、液滴)信号的准确识别问题，以及以编码微球为载体的多重数字式液滴检测过程中，液滴包裹微球状态(空液滴，单微球包裹，多微球包裹)的准确判读问题。本技术不仅能实现对荧光图像内的液滴、微孔阵列反应单元位置信息的准确识别，还能够准确判别反应单元的单微球包裹、多微球包裹等状态，实现了更高的数据统计准确度；本技术同时适用于使用cmod或ccd相机单元拍摄的反应腔室图像信号分析，且不依靠荧光素等试剂做辅助成像，降低了实验复杂性。
[0097]
在本技术所提供的几个实施例中，应该理解到，所揭露的系统、装置或方法，可以通过其它的方式实现。例如，以上所描述的装置实施例仅是示意性的，例如，模块/单元的划
分，仅仅为一种逻辑功能划分，实际实现时可以有另外的划分方式，例如多个模块或单元可以结合或者可以集成到另一个系统，或一些特征可以忽略，或不执行。另一点，所显示或讨论的相互之间的耦合或直接耦合或通信连接可以是通过一些接口，装置或模块或单元的间接耦合或通信连接，可以是电性，机械或其它的形式。
[0098]
作为分离部件说明的模块/单元可以是或者也可以不是物理上分开的，作为模块/单元显示的部件可以是或者也可以不是物理模块，即可以位于一个地方，或者也可以分布到多个网络单元上。可以根据实际的需要选择其中的部分或者全部模块/单元来实现本技术实施例的目的。例如，在本技术各个实施例中的各功能模块/单元可以集成在一个处理模块中，也可以是各个模块/单元单独物理存在，也可以两个或两个以上模块/单元集成在一个模块/单元中。
[0099]
本领域普通技术人员应该还可以进一步意识到，结合本文中所公开的实施例描述的各示例的单元及算法步骤，能够以电子硬件、计算机软件或者二者的结合来实现，为了清楚地说明硬件和软件的可互换性，在上述说明中已经按照功能一般性地描述了各示例的组成及步骤。这些功能究竟以硬件还是软件方式来执行，取决于技术方案的特定应用和设计约束条件。专业技术人员可以对每个特定的应用来使用不同方法来实现所描述的功能，但是这种实现不应认为超出本技术的范围。
[0100]
本技术实施例还提供一种电子设备，该电子设备可以为终端、服务器等设备。其中，终端可以为手机、平板电脑、智能蓝牙设备、笔记本电脑、个人电脑，等等；服务器可以是单一服务器，也可以是由多个服务器组成的服务器集群，等等。
[0101]
在一些实施例中，本技术提供的荧光图像检测系统还可以集成在多个电子设备中，比如，荧光图像检测系统可以集成在多个服务器中，由多个服务器来实现本技术的荧光图像检测方法。
[0102]
在本实施例中，将以本实施例的电子设备是服务器为例进行详细描述，比如，如图4所示，其示出了本技术实施例所涉及的服务器的结构示意图，具体来讲：
[0103]
该服务器可以包括一个或者一个以上处理核心的处理器410、一个或一个以上计算机可读存储介质的存储器420、电源430、输入模块440以及通信模块450等部件。本领域技术人员可以理解，图4中示出的服务器结构并不构成对服务器的限定，可以包括比图示更多或更少的部件，或者组合某些部件，或者不同的部件布置。其中：
[0104]
处理器410是该服务器的控制中心，利用各种接口和线路连接整个服务器的各个部分，通过运行或执行存储在存储器420内的软件程序和/或模块，以及调用存储在存储器420内的数据，执行服务器的各种功能和处理数据，从而对服务器进行整体监控。在一些实施例中，处理器410可包括一个或多个处理核心；在一些实施例中，处理器410可集成应用处理器和调制解调处理器，其中，应用处理器主要处理操作系统、用户界面和应用程序等，调制解调处理器主要处理无线通信。可以理解的是，上述调制解调处理器也可以不集成到处理器410中。
[0105]
存储器420可用于存储软件程序以及模块，处理器410通过运行存储在存储器420的软件程序以及模块，从而执行各种功能应用以及数据处理。存储器420可主要包括存储程序区和存储数据区，其中，存储程序区可存储操作系统、至少一个功能所需的应用程序(比如声音播放功能、图像播放功能等)等；存储数据区可存储根据服务器的使用所创建的数据
等。此外，存储器420可以包括高速随机存取存储器，还可以包括非易失性存储器，例如至少一个磁盘存储器件、闪存器件、或其他易失性固态存储器件。相应地，存储器420还可以包括存储器控制器，以提供处理器410对存储器420的访问。
[0106]
服务器还包括给各个部件供电的电源430，在一些实施例中，电源430可以通过电源管理系统与处理器410逻辑相连，从而通过电源管理系统实现管理充电、放电、以及功耗管理等功能。电源430还可以包括一个或一个以上的直流或交流电源、再充电系统、电源故障检测电路、电源转换器或者逆变器、电源状态指示器等任意组件。
[0107]
该服务器还可包括输入模块440，该输入模块440可用于接收输入的数字或字符信息，以及产生与用户设置以及功能控制有关的键盘、鼠标、操作杆、光学或者轨迹球信号输入。
[0108]
该服务器还可包括通信模块450，在一些实施例中通信模块450可以包括无线模块，服务器可以通过该通信模块450的无线模块进行短距离无线传输，从而为用户提供了无线的宽带互联网访问。比如，该通信模块450可以用于帮助用户收发电子邮件、浏览网页和访问流式媒体等。
[0109]
尽管未示出，服务器还可以包括显示单元等，在此不再赘述。具体在本实施例中，服务器中的处理器410会按照如下的指令，将一个或一个以上的应用程序的进程对应的可执行文件加载到存储器420中，并由处理器410来运行存储在存储器420中的应用程序，从而实现荧光图像检测系统的各种功能。
[0110]
在一些实施例中，本技术还提供了一种计算机可读存储介质。本领域普通技术人员可以理解实现上述实施例的方法中的全部或部分步骤是可以通过程序来指令处理器完成，的程序可以存储于计算机可读存储介质中，存储介质是非短暂性(non-transitory)介质，例如随机存取存储器，只读存储器，快闪存储器，硬盘，固态硬盘，磁带(magnetic tape)，软盘(floppy disk)，光盘(optical disc)及其任意组合。上述存储介质可以是计算机能够存取的任何可用介质或者是包含一个或多个可用介质集成的服务器、数据中心等数据存储设备。该可用介质可以是磁性介质(例如，软盘、硬盘、磁带)、光介质(例如数字视频光盘(digital video disc，dvd))、或者半导体介质(例如固态硬盘(solid state disk，ssd))等。
[0111]
本技术实施例还可以提供一种计算机程序产品，计算机程序产品包括一个或多个计算机指令。在计算设备上加载和执行计算机指令时，全部或部分地产生按照本技术实施例的流程或功能。计算机指令可以存储在计算机可读存储介质中，或者从一个计算机可读存储介质向另一计算机可读存储介质传输，例如，计算机指令可以从一个网站站点、计算机或数据中心通过有线(例如同轴电缆、光纤、数字用户线(dsl))或无线(例如红外、无线、微波等)方式向另一个网站站点、计算机或数据中心进行传输。
[0112]
计算机程序产品被计算机执行时，计算机执行前述方法实施例的方法。该计算机程序产品可以为一个软件安装包，在需要使用前述方法的情况下，可以下载该计算机程序产品并在计算机上执行该计算机程序产品。
[0113]
上述各个附图对应的流程或结构的描述各有侧重，某个流程或结构中没有详述的部分，可以参见其他流程或结构的相关描述。
[0114]
上述实施例仅例示性说明本技术的原理及其功效，而非用于限制本技术。任何熟
悉此技术的人士皆可在不违背本技术的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本技术所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本技术的权利要求所涵盖。

技术特征：
1.一种荧光图像检测方法，其特征在于，所述方法包括：获取待检测样品对应的荧光图像，所述荧光图像包括包含编码微球的微孔阵列荧光图像以及液滴荧光图像；基于局部多阈值分割识别方法，对所述微孔阵列荧光图像进行以编码微球为载体、基于微孔阵列的多重数字式检测信息提取，得到第一荧光检测信息；对所述液滴荧光图像进行以编码微球为载体、基于液滴的多重数字式检测信息提取，得到第二荧光检测信息；通过所述第一荧光检测信息和所述第二荧光检测信息得到所述待检测样品对应的荧光检测信息。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述获取待检测样品对应的荧光图像，包括：通过荧光显微镜对所述待检测样品进行检测，得到所述待检测样品对应的荧光图像。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述基于局部多阈值分割识别方法，对所述微孔阵列荧光图像进行以编码微球为载体、基于微孔阵列的多重数字式检测信息提取，得到第一荧光检测信息，包括：对所述微孔阵列荧光图像进行预处理，得到预处理后的微孔阵列荧光图像；通过所述局部多阈值分割识别方法识别出所述预处理后的微孔阵列荧光图像对应的第一编码微球信息，所述第一编码微球信息包括编码微球位置、编码微球边界及荧光强度信号；根据所述第一编码微球信息得到第一荧光检测信息。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述对所述微孔阵列荧光图像进行预处理，得到预处理后的微孔阵列荧光图像，包括：对所述微孔阵列荧光图像进行全图荧光强度均衡化、中值滤波、高斯滤波、形态学开运算以及结构体膨胀。5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述通过所述局部多阈值分割识别方法识别出所述预处理后的微孔阵列荧光图像对应的第一编码微球信息，包括：当对所述预处理后的微孔阵列荧光图像进行第n次小区域识别时，获取与所述所述预处理后的微孔阵列荧光图像相对应的用于进行第n次小区域识别的灰度图像，迭代次数n为正整数；对所述用于进行第n次小区域识别的灰度图像进行二值化处理，得到第n次二值化图像；对所述第n次二值化图像进行小区域信息提取，得到第n次识别区域的识别区域信息；当所述识别区域信息满足预设筛选条件时，将所述第n次识别区域作为所述预处理后的微孔阵列荧光图像中的一个反应单元；将所述第n次二值化图像中所述第n次识别区域的像素点数值设置为第一数值，得到用于进行第n+1次小区域识别的灰度图像；当所述预处理后的微孔阵列荧光图像内所有反应单元均经过二值化识别筛选处理时，将各个识别区域的识别区域信息作为所述预处理后的微孔阵列荧光图像对应的第一编码微球信息。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述当所述识别区域信息满足预设筛选条件时，将所述第n次识别区域作为所述预处理后的微孔阵列荧光图像中的一个反应单元，其中，所述预设筛选条件包括区域面积筛选条件、离心率筛选条件、圆度筛选条件和凸包率筛选条件；所述区域面积筛选条件为：所述识别区域的面积大于最小允许面积minvalidarea且小于最大允许面积maxvalidarea；其中，所述最小允许面积minvalidarea＝d
index
×
0.75
×
r
real2
×
π，所述最大允许面积maxvalidarea＝d
index
×
1.25
×
r
real2
×
π，r
real
为实际微球平均半径，d
index
为衰减系数，basethresh为初始的二值化阈值，curthresh
n
为第n次二值化过程中的实际阈值，bitdepth为图像位深；所述离心率筛选条件为：当第n次二值化过程中的实际阈值curthresh
n
小于预设二值化阈值时，允许的识别区域离心率范围：validecc∈[0.75,2]；当curthresh不小于所述预设二值化阈值时，所述允许的识别区域离心率范围：validecc∈[0.75
×
d
index
,2]；所述圆度筛选条件为：roundness∈[0.75,2]，所述识别区域的圆度roundness＝4
×
π
×
area/(perimeter)2，其中perimeter为识别到的区域的轮廓周长，area为识别区域的面积；所述凸包率筛选条件为：识别区域的凸包率大于凸包率阈值。7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述通过所述局部多阈值分割识别方法识别出所述预处理后的微孔阵列荧光图像对应的第一编码微球信息，还包括：当所述识别区域信息不满足预设筛选条件时，获取进行第n+1次小区域识别的二值化阈值curthresh
n+1
，所述进行第n+1次小区域识别的二值化阈值curthresh
n+1
＝basethresh+(n+1)
×
stepvalue，所述basethresh为初始的二值化阈值，stepvalue为步进梯度数值。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述对所述液滴荧光图像进行以编码微球为载体、基于液滴的多重数字式检测信息提取，得到第二荧光检测信息，所述液滴荧光图像包括有编码微球的编码信号图像以及有液滴中探针的报告信号图像，包括：基于局部多阈值分割识别方法，分别对所述有编码微球的编码信号图像以及有液滴中探针的报告信号图像进行区域提取，得到液滴荧光图像信息。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：对液滴包裹微球的状态进行判定；所述液滴荧光图像信息包括编码微球荧光信息以及液滴信息，基于编码微球荧光信息，从所述有编码微球的编码信号图像识别到的微球结构体中提取经过校正的微球形心位置参数，记为b(x1，y1)；基于液滴信息，从所述有液滴中探针的报告信号图像得到经过校正的单个液滴结构体的中心坐标位置参数，记为d(x0，y0)；当所述经过校正的微球形心位置参数满足当所述经过校正的微球形心位置参数满足时，判定所述识别到的微球结构体被液滴包裹，r
drop
为单个液滴的半径，d0、h0分别为坐标的修正系数，θ为距离系数。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述液滴荧光图像信息包括液滴包裹编
码微球个数，所述对液滴包裹微球的状态进行判定，还包括：当根据所述液滴包裹编码微球个数判定所述液滴包裹微球的状态为空液滴、包裹单微球或包裹多个微球。11.一种荧光图像检测系统，其特征在于，所述系统包括：图像获取模块，用于获取待检测样品对应的荧光图像，所述荧光图像包括包含编码微球的微孔阵列荧光图像以及液滴荧光图像；第一图像检测模块，用于基于局部多阈值分割识别方法，对所述微孔阵列荧光图像进行以编码微球为载体、基于微孔阵列的多重数字式检测信息提取，得到第一荧光检测信息；第二图像检测模块，用于对所述液滴荧光图像进行以编码微球为载体、基于液滴的多重数字式检测信息提取，得到第二荧光检测信息；信息获取模块，用于通过所述第一荧光检测信息和所述第二荧光检测信息得到所述待检测样品对应的荧光检测信息。12.一种电子设备，其特征在于，所述电子设备包括：存储器，所述存储器存储有多条指令；处理器，所述处理器从所述存储器中加载指令，以执行如权利要求1～10任一项所述的方法中的步骤。13.一种计算机可读存储介质，其上存储有计算机程序，其特征在于，该程序被电子设备执行时实现权利要求1～10任一项所述的方法中的步骤。

技术总结
本发明公开了一种荧光图像检测方法、系统、电子设备及介质，包括获取待检测样品对应的荧光图像，荧光图像包括包含编码微球的微孔阵列荧光图像以及液滴荧光图像；基于局部多阈值分割识别方法，对微孔阵列荧光图像进行以编码微球为载体、基于微孔阵列的多重数字式检测信息提取，得到第一荧光检测信息；对液滴荧光图像进行以编码微球为载体、基于液滴的多重数字式检测信息提取，得到第二荧光检测信息；通过第一荧光检测信息和第二荧光检测信息得到待检测样品对应的荧光检测信息。本申请不仅能实现对荧光图像内的液滴、微孔阵列反应单元位置信息的准确识别，还能准确判别反应单元的单微球包裹、多微球包裹等状态，实现了更高的数据统计准确度。据统计准确度。据统计准确度。


技术研发人员：方晓霞 孙通 郭庆生 徐宏 古宏晨
受保护的技术使用者：上海交通大学
技术研发日：2022.12.27
技术公布日：2023/7/13