一种曲普瑞林的纯化方法与流程

1.本发明属于药物化学领域，具体提供了一种曲普瑞林的纯化方法。


背景技术：

2.促性腺激素释放激素(gnrh)是下丘脑分泌的一种内分泌调节激素，可与垂体上的gnrh受体相结合，促进相关性腺激素释放激素的分泌。gnrh可分为促黄体生成激素释放激素(lhrh)和促卵泡生成激素释放激素(fshrh)两种，通常情况下gnrh多代指lhrh。
3.天然的lhrh为十个氨基酸构成的短肽且提取纯化成本极高。而人工合成的与天然lhrh具有相同氨基酸组成的lhrh类似物(lhrha)成本则相对较低。曲普瑞林是一种人工合成的lhrha，其在天然lhrh的基础上，利用d-trp将lhrh肽链第六位上的gly取代，得到生物学功效百倍于天然lhrh的lhrha，并且相较于天然lhrh，具备了更长的体内半衰期和更强的生物学稳定性。
4.曲普瑞林的临床应用与其激素生理作用密切相关，曲普瑞林的激素功效具体体现为正向的促进和负向的抑制。因而对曲普瑞林的临床应用主要集中于一些激素相关性疾病上，通过正向、负向激素分泌调节，对疾病起到抑制、治疗的作用，主要用于治疗子宫肌瘤，儿童真性性早熟，女性子宫内膜异位症，在不孕症的治疗时可用于体外受精-胚胎移植(ivf-et)过程。
5.中国专利cn103122023b采用c18柱纯化，流动相a为磷酸或硫酸的缓冲盐，流动相b为乙腈，梯度洗脱，后经醋酸转盐，浓缩冻干得曲普瑞林成品。纯度大于99.7％，单杂小于0.05％，总收率为30％以上。但是该分离纯化方法总收率较低，需经转盐再脱盐，工艺复杂。
6.中国专利cn109438561b采用c18柱纯化，流动相a为磷酸三乙胺，甲醇为b相，进行梯度洗脱；再经二次纯化，流动相为三氟乙酸水溶液，乙腈为b相，最后经转盐、冻干得到纯度大于99.9％，单杂小于0.02％的醋酸曲普瑞林，总收率为50％以上。但是该分离纯化方法需经多次繁琐的回收纯化才能达到合乎要求的纯度，操作复杂，纯化成本高。


技术实现要素：

7.本发明旨在提供一种操作简单、纯度高、工艺转化率高、易于工业化生产的曲普瑞林的纯化方法。
8.为实现上述目的，本发明采用的技术方案，其包括以下步骤：
9.(1)预处理：称取曲普瑞林粗品，水浴加热，然后通过高压制备液相色谱柱进行粗品预处理，以磷酸氢二铵水溶液为流动相a，以乙腈为流动相b，梯度洗脱，获得预处理接出液；
10.(2)一次纯化：预处理接出液中加入纯化水稀释，然后通过高压制备液相色谱柱进行一次纯化，以磷酸二氢铵水溶液为流动相a，以乙腈为流动相b，梯度洗脱，获得一次纯化接出液；
11.(3)脱盐：一次纯化接出液中加入纯化水稀释，然后通过高压制备液相色谱柱进行
脱盐，以乙酸水溶液为流动相a，以甲醇为流动相b，梯度洗脱，获得脱盐接出液；
12.(4)将脱盐接出液浓缩去除溶剂并冻干，得到曲普瑞林冻干粉。
13.优选地，步骤(1)中所述的粗品预处理使用高压制备液相色谱系统，色谱条件如下：c18色谱柱，50％～75％流动相a：50％～25％流动相b，梯度洗脱，获得预处理接出液。
14.进一步优选地，步骤(1)中所述的粗品预处理使用高压制备液相色谱系统，色谱条件如下：
15.填料：选自sepax hp c18 10μmfuji c18 10μmunisil c18 10μmkromasilc18 10μmsepax gp c18 10μmwelchc18 10μm或acchrom c1810μm中的一种；优选为sepax gp c18 10μm
16.波长：210nm；
17.流速：60ml/min；
18.流动相：磷酸氢二铵水溶液(a相)；乙腈(b相)。
19.优选地，步骤(1)所述的磷酸氢二铵水溶液为0.03mol/l的磷酸氢二铵水溶液，其ph为2.0～4.0；更加优选地ph为2.5～3.0。
20.优选地，步骤(1)所述的流动相，a、b两相的梯度洗脱程序见下表1：
21.表1纯化过程中的洗脱梯度表
[0022][0023][0024]
更加优选地，步骤(1)所述的梯度洗脱程表如下表2：
[0025]
表2纯化过程中的洗脱梯度表
[0026][0027]
优选地，步骤(2)中所述的一次纯化使用高压制备液相色谱系统，色谱条件如下：c18色谱柱，50％～85％流动相a：50％～15％流动相b，梯度洗脱，获得一次纯化接出液。
[0028]
进一步优选地，步骤(2)中所述的一次纯化使用高压制备液相色谱系统，色谱条件
如下：
[0029]
填料：选自sepax hp c18 10μmfuji c18 10μmunisil c18 10μmkromasilc18 10μmsepax gp c18 10μmwelchc18 10μm或acchrom c1810μm中的一种；优选为kromasilc18 10μm
[0030]
波长：210nm；
[0031]
流速：60ml/min；
[0032]
流动相：磷酸二氢铵水溶液(a相)；乙腈(b相)。
[0033]
优选地，步骤(1)所述磷酸二氢铵水溶液为0.05mol/l的磷酸二氢铵水溶液，其ph为2.0～4.0；更加优选地ph为2.5～3.0。
[0034]
优选地，步骤(2)所述的流动相，a、b两相的梯度洗脱程序见表下3：
[0035]
表3纯化过程中的洗脱梯度表
[0036][0037][0038]
更加优选地，步骤(2)所述的梯度洗脱程表如下表4：
[0039]
表4纯化过程中的洗脱梯度表
[0040][0041]
优选地，步骤(3)中所述的脱盐使用高压制备液相色谱系统，色谱条件如下：c18色谱柱，35％～90％流动相a：65％～10％流动相b，梯度洗脱，获得脱盐接出液。
[0042]
进一步优选地，步骤(3)中所述的脱盐使用高压制备液相色谱系统，色谱条件如下：
[0043]
填料：选自sepax hp c18 10μmfuji c18 10μmunisil c18 10μmkromasilc18 10μmsepax gp c18 10μmwelchc18 10μm或acchrom c1810μm中的一种；优选为kromasilc18 10μm
[0044]
波长：280nm；
[0045]
流速：60ml/min；
[0046]
流动相：乙酸水溶液(a相)；甲醇(b相)。
[0047]
优选地，步骤(3)所述乙酸水溶液的体积浓度为0.5％～1.5％(v/v)；更加优选地，所述乙酸水溶液的体积浓度为0.5％～1.0％(v/v)。
[0048]
优选地，步骤(3)所述的流动相，a、b两相的梯度洗脱程序见下表5：
[0049]
表5纯化过程中的洗脱梯度表
[0050][0051]
更加优选地，步骤(3)所述的梯度洗脱程表如下表6：
[0052]
表6纯化过程中的洗脱梯度表
[0053][0054]
将步骤(3)所得的脱盐洗脱液浓缩去除溶剂并冻干，得到曲普瑞林冻干粉。成品纯度可达到99.9％以上，最终产品的纯化收率可超过80％，总收率超过60％。
[0055]
说明书中(v/v)称之为体积比，指相同体积单位的两种溶剂比，例如0.5％的乙酸水溶液指0.005l的乙酸与1l水的混合溶液。
[0056]
本发明提供了一种曲普瑞林的纯化方法，其解决了目前该产品生产过程中纯化收率不高、工艺复杂、纯化成本高的问题，本方法只需一次纯化，无需转盐既可以较高收率的获得高纯度曲普瑞林，操作简单，降低生产成本，非常适合于大生产。且整个生产的过程采用的是常规试剂原料，无剧毒物质，安全环保。
附图说明
[0057]
图1为实施例1粗品预处理的hplc分析谱图。
[0058]
图2为实施例1一次纯化的hplc分析谱图。
[0059]
图3为实施例1脱盐的hplc分析谱图。
[0060]
图4为实施例1曲普瑞林冻干的hplc分析谱图。
具体实施方式
[0061]
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。
[0062]
实施例1
[0063]
(1)曲普瑞林粗品的预处理
[0064]
取10.0g曲普瑞林粗品(hplc纯度为80％)，水浴加热，然后通过高压制备液相色谱系统进行预处理，色谱条件如下：
[0065]
填料：sepax gp c18 10μm
[0066]
波长：210nm；
[0067]
流速：60ml/min；
[0068]
进样量：500ml；
[0069]
流动相：流动相a为磷酸氢二铵水溶液(ph＝3.0)；流动相b为乙腈，洗脱梯度如下：
[0070][0071]
收集预处理接出液，经hplc检测接出液纯度为96.24％；
[0072]
(2)一次纯化
[0073]
预处理接出液中加入纯化水稀释，然后通过高压制备液相色谱系统进行一次纯化，色谱条件如下：
[0074]
填料：kromasilc18 10μm
[0075]
波长：210nm；
[0076]
流速：60ml/min；
[0077]
进样量：400ml；
[0078]
流动相：流动相a为磷酸二氢铵水溶液(ph＝3.0)；流动相b为乙腈，洗脱梯度如下：
[0079][0080]
收集一次纯化接出液，经hplc检测接出液纯度为99.93％；
[0081]
(3)脱盐
[0082]
一次纯化接出液中加入纯化水稀释，然后通过高压制备液相色谱系统进行脱盐，色谱条件如下：
[0083]
填料：kromasilc18 10μm
[0084]
波长：280nm；
[0085]
流速：60ml/min；
[0086]
进样量：1000ml；
[0087]
流动相：流动相a为1.0％乙酸水溶液；流动相b为甲醇，洗脱梯度如下：
[0088][0089]
收集脱盐接出液，经hplc检测接出液纯度为99.96％；
[0090]
(4)洗脱液的浓缩和冻干
[0091]
脱盐接出液经旋转蒸发仪浓缩去除溶剂然后冻干，获得曲普瑞林冻干粉7.06g，hplc纯度为99.96％。
[0092]
实施例2
[0093]
(1)曲普瑞林粗品的预处理
[0094]
取10.0g曲普瑞林粗品(hplc纯度为80％)，水浴加热，然后通过高压制备液相色谱系统进行预处理，色谱条件如下：
[0095]
填料：sepax gp c18 10μm
[0096]
波长：210nm；
[0097]
流速：60ml/min；
[0098]
进样量：500ml；
[0099]
流动相：流动相a为磷酸氢二铵水溶液(ph＝2.5)；流动相b为乙腈，洗脱梯度如下：
[0100][0101][0102]
收集预处理接出液，经hplc检测接出液纯度为96.20％；
[0103]
(2)一次纯化
[0104]
预处理接出液中加入纯化水稀释，然后通过高压制备液相色谱系统进行一次纯化，色谱条件如下：
[0105]
填料：kromasilc18 10μm
[0106]
波长：210nm；
[0107]
流速：60ml/min；
[0108]
进样量：400ml；
[0109]
流动相：流动相a为磷酸二氢铵水溶液(ph＝2.5)；流动相b为乙腈，洗脱梯度如下：
[0110][0111]
收集一次纯化接出液，经hplc检测接出液纯度为99.89％；
[0112]
(3)脱盐
[0113]
一次纯化接出液中加入纯化水稀释，然后通过高压制备液相色谱系统进行脱盐，色谱条件如下：
[0114]
填料：kromasilc18 10μ
[0115]
波长：280nm；
[0116]
流速：60ml/min；
[0117]
进样量：1000ml；
[0118]
流动相：流动相a为0.5％乙酸水溶液；流动相b为甲醇，洗脱梯度如下：
[0119][0120][0121]
收集脱盐接出液，经hplc检测接出液纯度为99.91％；
[0122]
(4)洗脱液的浓缩和冻干
[0123]
脱盐接出液经旋转蒸发仪浓缩去除溶剂然后冻干，获得曲普瑞林冻干粉6.75g，hplc纯度为99.91％。
[0124]
实施例3
[0125]
(1)曲普瑞林粗品的预处理
[0126]
取10.0g曲普瑞林粗品(hplc纯度为80％)，水浴加热，然后通过高压制备液相色谱系统进行预处理，色谱条件如下：
[0127]
填料：sepax gp c18 10μm
[0128]
波长：210nm；
[0129]
流速：60ml/min；
[0130]
进样量：500ml；
[0131]
流动相：流动相a为磷酸氢二铵水溶液(ph＝3.0)；流动相b为乙腈，洗脱梯度如下：
[0132][0133]
收集预处理接出液，经hplc检测接出液纯度为96.21％；
[0134]
(2)一次纯化
[0135]
预处理接出液中加入纯化水稀释，然后通过高压制备液相色谱系统进行一次纯化，色谱条件如下：
[0136]
填料：kromasilc18 10μm
[0137]
波长：210nm；
[0138]
流速：60ml/min；
[0139]
进样量：400ml；
[0140]
流动相：流动相a为磷酸二氢铵水溶液(ph＝3.0)；流动相b为乙腈，洗脱梯度如下：
[0141][0142]
收集一次纯化接出液，经hplc检测接出液纯度为99.88％；
[0143]
(3)脱盐
[0144]
一次纯化接出液中加入纯化水稀释，然后通过高压制备液相色谱系统进行脱盐，色谱条件如下：
[0145]
填料：kromasilc18 10μm
[0146]
波长：280nm；
[0147]
流速：60ml/min；
[0148]
进样量：1000ml；
[0149]
流动相：流动相a为1.0％乙酸水溶液；流动相b为甲醇，洗脱梯度如下：
[0150][0151]
收集脱盐接出液，经hplc检测接出液纯度为99.90％；
[0152]
(4)洗脱液的浓缩和冻干
[0153]
脱盐接出液经旋转蒸发仪浓缩去除溶剂然后冻干，获得曲普瑞林冻干粉6.63g，hplc纯度为99.90％。
[0154]
实施例4
[0155]
(1)曲普瑞林粗品的预处理
[0156]
取10.0g曲普瑞林粗品(hplc纯度为80％)，水浴加热，然后通过高压制备液相色谱系统进行预处理，色谱条件如下：
[0157]
填料：sepax gp c18 10μm
[0158]
波长：210nm；
[0159]
流速：60ml/min；
[0160]
进样量：500ml；
[0161]
流动相：流动相a为l磷酸氢二铵水溶液(ph＝4.0)；流动相b为乙腈，洗脱梯度如下：
[0162][0163]
收集预处理接出液，经hplc检测接出液纯度为90.88％；
[0164]
(2)一次纯化
[0165]
预处理接出液加入纯化水稀释，然后通过高压制备液相色谱系统进行一次纯化，色谱条件如下：
[0166]
填料：kromasilc18 10μm
[0167]
波长：210nm；
[0168]
流速：60ml/min；
[0169]
进样量：400ml；
[0170]
流动相：流动相a为磷酸二氢铵水溶液(ph＝4.0)；流动相b为乙腈，洗脱梯度如下：
[0171][0172][0173]
收集一次纯化接出液，经hplc检测接出液纯度为93.25％；
[0174]
(3)脱盐
[0175]
一次纯化接出液中加入纯化水稀释，然后通过高压制备液相色谱系统进行脱盐，色谱条件如下：
[0176]
填料：kromasilc18 10μm
[0177]
波长：280nm；
[0178]
流速：60ml/min；
[0179]
进样量：1000ml；
[0180]
流动相：流动相a为1.5％乙酸水溶液；流动相b为甲醇，洗脱梯度如下：
[0181][0182]
收集脱盐接出液，经hplc检测接出液纯度为93.26％；
[0183]
(4)洗脱液的浓缩和冻干
[0184]
脱盐接出液经旋转蒸发仪浓缩去除溶剂然后冻干，获得曲普瑞林冻干粉5.03g，hplc纯度为93.26％。
[0185]
实施例5
[0186]
(1)曲普瑞林粗品的预处理
[0187]
取10.0g曲普瑞林粗品(hplc纯度为80％)，水浴加热，然后通过高压制备液相色谱系统进行预处理，色谱条件如下：
[0188]
填料：sepax gp c18 10μm
[0189]
波长：210nm；
[0190]
流速：60ml/min；
[0191]
进样量：500ml；
[0192]
流动相：流动相a为磷酸氢二铵水溶液(ph＝3.0)；流动相b为乙腈，洗脱梯度如下：
[0193][0194]
收集预处理接出液，经hplc检测接出液纯度为91.53％；
[0195]
(2)一次纯化
[0196]
预处理接出液纯化水稀释，然后通过高压制备液相色谱系统进行一次纯化，色谱条件如下：
[0197]
填料：kromasilc18 10μm
[0198]
波长：210nm；
[0199]
流速：60ml/min；
[0200]
进样量：400ml；
[0201]
流动相：流动相a为磷酸二氢铵水溶液(ph＝3.0)；流动相b为乙腈，洗脱梯度如下：
[0202][0203]
收集一次纯化接出液，经hplc检测接出液纯度为93.63％；
[0204]
(3)脱盐
[0205]
一次纯化接出液中加入纯化水稀释，然后通过高压制备液相色谱系统进行脱盐，色谱条件如下：
[0206]
填料：kromasilc18 10μm
[0207]
波长：280nm；
[0208]
流速：60ml/min；
[0209]
进样量：1000ml；
[0210]
流动相：流动相a为1.0％乙酸水溶液；流动相b为甲醇，洗脱梯度如下：
[0211][0212]
收集脱盐接出液，经hplc检测接出液纯度为93.64％；
[0213]
(4)洗脱液的浓缩和冻干
[0214]
脱盐接出液经旋转蒸发仪浓缩去除溶剂然后冻干，获得曲普瑞林冻干粉5.24g，hplc纯度为93.64％。
[0215]
实施例6
[0216]
(1)曲普瑞林粗品的预处理
[0217]
取10.0g曲普瑞林粗品(hplc纯度为80％)，水浴加热，然后通过高压制备液相色谱系统进行预处理，色谱条件如下：
[0218]
填料：fuji c18 10μm
[0219]
波长：210nm；
[0220]
流速：60ml/min；
[0221]
进样量：500ml；
[0222]
流动相：流动相a为磷酸氢二铵水溶液(ph＝3.0)；流动相b为乙腈，洗脱梯度如下：
[0223][0224]
收集预处理接出液，经hplc检测接出液纯度为95.23％；
[0225]
(2)一次纯化
[0226]
预处理接出液中加入纯化水稀释，然后通过高压制备液相色谱系统进行一次纯化，色谱条件如下：
[0227]
填料：welchc18 10μm
[0228]
波长：210nm；
[0229]
流速：60ml/min；
[0230]
进样量：400ml；
[0231]
流动相：流动相a为磷酸二氢铵水溶液(ph＝3.0)；流动相b为乙腈，洗脱梯度如下：
[0232][0233]
收集一次纯化接出液，经hplc检测接出液纯度为98.41％；
[0234]
(3)脱盐
[0235]
一次纯化接出液中加入纯化水稀释，然后通过高压制备液相色谱系统进行脱盐，色谱条件如下：
[0236]
填料：acchrom c18 10μm
[0237]
波长：280nm；
[0238]
流速：60ml/min；
[0239]
进样量：1000ml；
[0240]
流动相：流动相a为1.0％乙酸水溶液；流动相b为甲醇，洗脱梯度如下：
[0241][0242]
收集脱盐接出液，经hplc检测接出液纯度为98.42％；
[0243]
(4)洗脱液的浓缩和冻干
[0244]
脱盐接出液经旋转蒸发仪浓缩去除溶剂然后冻干，获得曲普瑞林冻干粉5.37g，hplc纯度为98.42％。
[0245]
最后所应说明的是：以上实施例仅用以说明，而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

技术特征：
1.一种曲普瑞林的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：1)称取曲普瑞林粗品，水浴加热，然后通过高压制备液相色谱柱进行粗品预处理，流动相a为磷酸氢二铵水溶液，流动相b为乙腈，梯度洗脱，获得预处理接出液；2)预处理接出液中加入纯化水稀释，然后通过高压制备液相色谱柱进行一次纯化，流动相a为磷酸二氢铵水溶液，流动相b为乙腈，梯度洗脱，获得一次纯化接出液；3)一次纯化接出液中加入纯化水稀释，然后通过高压制备液相色谱柱进行脱盐，流动相a为乙酸水溶液，流动相b为甲醇，梯度洗脱，获得脱盐接出液；4)将脱盐接出液浓缩去除溶剂并冻干，得到曲普瑞林冻干粉。2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤1)中所述的粗品预处理使用高压制备液相色谱系统，色谱条件如下：c18色谱柱，50％～75％流动相a：50％～25％流动相b，梯度洗脱；其中流动相a为ph2.5～3.0的磷酸氢二铵水溶液；流动相b为乙腈。3.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤2)中所述的一次纯化使用高压制备液相色谱系统，色谱条件如下：c18色谱柱，50％～85％流动相a：50％～15％流动相b，梯度洗脱；其中流动相a为ph为2.5～3.0的磷酸二氢铵水溶液；流动相b为乙腈。4.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤3)中所述的脱盐使用高压制备液相色谱系统，色谱条件如下：c18色谱柱，35％～90％流动相a：65％～10％流动相b，梯度洗脱；其中流动相a为0.5％-1.5％的乙酸水溶液；流动相b为甲醇。5.根据权利要求2所述的纯化方法，其特征在于，所述的c18色谱柱的填料选自sepax hp c18 10μmfuji c18 10μmunisil c18 10μmkromasil c18 10μmsepax gp c18 10μmwelchc18 10μm或acchrom c18 10μm中的一种；优选为sepax gp c18 10μm6.根据权利要求2所述的纯化方法，其特征在于，所述的洗脱梯度为：7.根据权利要求3所述的纯化方法，其特征在于，所述的c18色谱柱的填料选自sepax hp c18 10μmfuji c18 10μmunisil c18 10μmkromasil c18 10μmsepax gp c18 10μmwelchc18 10μm或acchrom c18 10μm中的一种；优选为kromasil c18 10μm8.根据权利要求3所述的纯化方法，其特征在于，所述的洗脱梯度为：
9.根据权利要求4所述的纯化方法，其特征在于，所述的c18色谱柱的填料选自sepax hp c18 10μmfuji c18 10μmunisil c18 10μmkromasil c18 10μmsepax gp c18 10μmwelchc18 10μm或acchrom c18 10μm中的一种；优选为kromasil c18 10μm10.根据权利要求4所述的纯化方法，其特征在于，所述的洗脱梯度为：

技术总结
本发明提供了一种曲普瑞林的纯化方法。曲普瑞林粗品经过预处理、一次纯化、脱盐三步后，将收集的洗脱液进行浓缩并冻干，最后获得高纯度的曲普瑞林，工艺转化率较高。本发明的方法工艺稳定，操作简单，所获得的曲普瑞林的收率和纯度均较高，成本较低，适合于工业化大生产。适合于工业化大生产。


技术研发人员：张贵民 杨欣茹 李铁健 刘忠
受保护的技术使用者：山东新时代药业有限公司
技术研发日：2021.12.31
技术公布日：2023/7/13