用于制备L-赖氨酸的表达盒、基因工程菌及其应用的制作方法

用于制备l-赖氨酸的表达盒、基因工程菌及其应用
技术领域
1.本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种用于制备l-赖氨酸的表达盒、基因工程菌及其应用。


背景技术：

2.赖氨酸(lysine)又名2,6-二氨基己酸，属于碱性氨基酸。赖氨酸具有重要的营养生理功能，在医药、食品和饲料工业中应用广泛。同时，其也可作为前体物质用于合成尼龙聚合材料。赖氨酸的生产途径主要包括蛋白水解法、化学合成法以及发酵法三种，其中，微生物发酵法具有生产成本低、生产强度高、特异性高、环境污染小等特点，成为赖氨酸工业化生产应用最广的方法。
3.用于生产赖氨酸的原核微生物主要包括棒状杆菌、短杆菌、诺卡氏菌、假单胞菌、埃希氏菌、芽孢杆菌等。谷氨酸棒状杆菌(corynebacterium glutamicum)是发酵生产氨基酸最为重要和安全的菌株，通过代谢改造提高它过量合成各种氨基酸的能力一直是研究热点。例如，过表达赖氨酸合成途径的相关基因和反馈抑制脱敏的相关基因，或者从葡萄糖代谢开始的能量供应途径强化以及优化细胞膜上赖氨酸转运蛋白等都有效提高了赖氨酸的生产率。
4.常规的谷氨酸棒状杆菌不能利用木糖，因此通过代谢工程和合成生物学改造使其能够利用木质纤维素中的木糖是其进行木质纤维素发酵的前提条件。专利cn200510076242.x通过引入xylabfghr基因座的方式构建木糖到赖氨酸合成路径，但是获得的菌株依然存在木糖利用率低，以及不能在木质纤维素体系中正常生长和赖氨酸发酵等问题。因此构建高效利用木质纤维素中的葡萄糖和木糖生产赖氨酸的菌株，还需进一步研究。现有技术中缺少高产量赖氨酸的基因工程菌。


技术实现要素：

5.为解决上述技术问题，本发明提供一种用于制备l-赖氨酸的表达盒、基因工程菌及其应用，具体提供一种能提高谷氨酸棒状杆菌的赖氨酸产量的表达盒和能利用秸秆水解液高效生产赖氨酸的基因工程菌。本发明的基因工程菌可以在秸秆水解液中有效利用秸秆中的葡萄糖和木糖。本发明通过增强谷氨酸棒状杆转酮醇酶和转醛醇酶功能的方式，提高谷氨酸棒杆菌在木糖、混合糖和水解液条件下发酵效率，显著提高l-赖氨酸产量，且目前尚未有从转酮醇酶和转醛醇酶角度研究谷氨酸棒状杆菌生产l-赖氨酸的报道。
6.为解决上述技术问题，本发明提供一方面一种表达盒，所述表达盒包括启动子和xylab基因，还包括转醛醇酶基因和/或转酮醇酶基因。
7.本发明所述的表达盒中，所述xylab基因的序列优选如seq id no:1所示。
8.本发明所述的表达盒中，所述转醛醇酶基因的序列优选如seq id no:4所示。
9.本发明所述的表达盒中，所述转酮醇酶基因的序列优选如seq id no:3所示。
10.本发明所述的表达盒中，所述启动子优选为peftu启动子，所述peftu启动子的序
列优选如seq id no:2所示。
11.本发明另一方面提供一种分离的核酸，所述核酸包含如本发明所述的表达盒。
12.本发明另一方面提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包括本发明所述的表达盒，或包括本发明所述的核酸。
13.在某一较佳实施方案中，所述重组表达载体的骨架质粒优选为pk18mob。
14.所述pk18mob的具体信息可参考如下网页：
15.http://www.biovector.net/product/1089.html。
16.本发明另一方面提供一种基因工程菌，其为在出发菌中转入如本发明所述的表达盒，或如本发明所述的核酸，或如本发明所述的重组表达载体。
17.所述基因工程中，所述出发菌较佳地为谷氨酸棒状杆菌(corynebacterium glutamicum)，例如c.glutamicum b253或c.glutamicum caths141。
18.所述基因工程中，所述表达盒较佳地通过同源重组方式整合在所述出发菌的基因组中，或以非整合形式存在于所述出发菌中。
19.所述基因工程菌中，优选不表达乳酸脱氢酶，例如ldh基因被敲除。
20.在某一较佳实施方案中，所述表达盒整合至所述ldh基因的位点上。
21.所述ldh基因较佳地在genbank中的登录号为aje68497.1。
22.本发明所述的出发菌可为野生型菌株，也可为经修饰的菌株。
23.本发明另一方面提供一种制备l-赖氨酸的方法，所述方法包括在发酵培养基中发酵如本发明所述的基因工程菌。
24.在某一较佳实施方案中，所述发酵培养基含有不低于25g/l的葡萄糖和/或不低于25g/l的木糖，例如80-110g/l的葡萄糖和25-40g/l的木糖。
25.所述发酵的温度较佳地为28～32℃，例如30℃。
26.所述发酵的通气量较佳地为1.0～1.7vvm，例如1.4vvm。
27.所述发酵的ph较佳地为6～8，例如7；
28.所述发酵较佳地通过搅拌进行，所述搅拌的转速为400～800rpm，优选600rpm。
29.在某一较佳实施方案中，所述发酵培养基为木质纤维素水解液例如秸秆水解液。
30.所述秸秆水解液较佳地为农作物秸秆经酶解糖化后形成。
31.在某一较佳实施方案中，在所述秸秆水解液中添加15～25g/l硫酸铵、2～8g/l甲硫氨酸和2～8g/l苏氨酸。
32.在某一较佳实施方案中，在所述酶解糖化前对所述秸秆水解液进行预处理，所述预处理包括筛分、除杂、酸预处理和/或脱毒处理。预处理可以提高农作物秸秆的糖化效率。其中的脱毒处理可以降低乙酸、糠醛、5-羟基苯甲醛、糠醛、羟甲基糠醛、4-羟基苯甲醛、乙酰丙酸等毒性抑制物的含量。
33.本发明另一方面提供一种如本发明所述的表达盒、如本发明所述的核酸、如本发明所述的重组表达载体、或如本发明所述的基因工程菌在制备l-赖氨酸中的应用。
34.一种基因工程菌的制备方法，其通过将如本发明所述的表达盒导入如本发明中所定义的出发菌中获得所述基因工程菌。
35.所述制备方法较佳地进一步包括：阻断所述基因工程菌中乳酸脱氢酶的表达，例如敲除ldh基因。
36.所述制备方法中，所述表达盒较佳地整合至所述ldh基因的位点。
37.优选地，所述ldh基因在genbank中的登录号为中aje68497.1。
38.虽然本发明实施例中的出发菌株选用了耐受秸秆水解液的菌株c.glutamicum caths141，但是由实施例5、6可以看出，当培养基为配制的葡萄糖培养基时，本发明的基因工程菌生产l-赖氨酸的效果也优于出发菌株，即耐受秸秆水解液的抑制物毒性不是出发菌株必须具备的条件。
39.本发明所述的转醛醇酶基因也称为cgl1575(其编码的转醛酮酶的氨基酸序列可为genbank登录号bab98968.1对应的序列)；本发明所述的转酮醇酶基因也称为cgl1574(其编码的转酮醇酶的氨基酸序列可为genbank登录号bab98967.1对应的序列)。
40.在某一较佳实施方案中，本发明所述的c.glutamicum caths141的保藏号为cctcc no:m 20211495。
41.本发明所述的c.glutamicum b253购买自上海工业微生物所。
42.在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
43.本发明所用试剂和原料均市售可得。
44.本发明的积极进步效果在于：
45.本发明提供的表达盒导入出发菌后，表达转酮醇酶和转醛醇酶比出发菌株呈提高状态，有助于强化戊糖磷酸途径，从而有效提高木糖和混合糖利用效率，进而提高l-赖氨酸的产量。当使用秸秆水解液时，本发明的基因工程菌的赖氨酸产量比出发菌明显提升。本发明提供的基因工程菌可以有效利用秸秆等农业废料进行发酵，具备良好的应用前景。
46.生物材料保藏信息
47.本发明的谷氨酸棒状杆菌caths141，已于2021年11月29日保藏在中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏地址：中国武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号为：cctcc no:m 20211495，培养物名称是caths141，分类命名是corynebacterium glutamicum caths141。
具体实施方式
48.下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
49.一、本发明所使用的菌株
50.大肠杆菌e.coli dh5α用于表达质粒和敲除质粒的构建，谷氨酸棒状杆菌c.glutamicum caths141是一株用于生产赖氨酸的菌株，本实验中c.glutamicum caths141主要作为出发菌株进行使用。
51.二、试剂与培养基
52.纤维素酶ctec 2.0用于水解木质纤维素中的纤维素和半纤维素，购自中国北京的诺维信(中国)公司。根据nrel lap-006指南中的方法测得纤维素酶的滤纸酶活为203.2fpu/ml，纤维二糖酶活为4900.0cbu/ml，根据bradford方法测得蛋白浓度为87.3mg/ml。限制性内切酶用于切割质粒或基因片段产生粘性末端，购自thermo scientific(wilmington,de,usa)。dna聚合酶用于扩增基因片段，dna连接酶用于连接酶切过的基因片
段和质粒载体，这两种酶都是购自takara(otsu,japan)。无缝克隆试剂盒用于连接含有同源片段的基因片段和质粒载体，购自汉恒生物科技公司(nanjing,china)。质粒抽提试剂盒，pcr产物纯化回收试剂盒和凝胶回收试剂盒都是购自上海捷瑞生物科技公司(shanghai，china)。其他试剂从本地供应商处购买。
53.培养大肠杆菌使用的培养基是luria-bertani(lb)培养基，具体成分如下：10.0g/l氯化钠，10.0g/l蛋白胨和5.0g/l酵母提取物。
54.培养谷氨酸棒状杆菌所用的培养基具体成分如下：
55.(1)种子培养基：25g/l葡萄糖，1.5g/l磷酸二氢钾，2.5g/l尿素和0.6g/l硫酸镁，25g/l玉米浆。
56.(2)发酵培养基：1g/l磷酸二氢钾，3g/l尿素，0.6g/l硫酸镁，20g/l玉米浆，视情况添加葡萄糖作为碳源。
57.实施例1：出发菌c.glutamicum caths141的获得
58.收集新疆乌苏的土壤样品，每1g土壤样品添加至10ml无菌水中，剧烈混匀1min后将静置沉淀一段时间，再将原样品分别稀释成10-3
、10-4
、10-5
涂布在含有100mg/l制霉菌素的lb琼脂平板上，并在30℃下培养。经多次划线分离培养，获得纯化单菌落。
59.通过分离纯化获得一株可以生产l-赖氨酸的菌株，参照《常见细菌系统鉴定手册》对菌株进行菌体特征、生理生化特性等进行测定。所述的菌株具有以下形态特征：菌落湿润，呈圆形，表面光滑，边缘整齐，颜色为浅黄色；用细菌基因组dna提取试剂盒，提取该菌株的dna，以其dna为模版，使用细菌通用引物27f和1492r，并使用16s rdna进行pcr扩增，进行测序后获得菌株16s rdna序列,将菌株的16s rdna序列在genbank数据库中比对，鉴定该菌株为谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)。
60.小麦秸秆经过酸预处理、脱毒和酶水解后得到小麦秸秆水解液，以上述分离纯化得到的谷氨酸棒杆菌为出发菌株，通过使用紫外线、亚硝基胍、5-氟尿嘧啶、artp等多次单独诱变及复合诱变，获得能够耐受秸秆水解液中的毒性抑制物进行正常的生长和赖氨酸生产的稳定菌株。将该菌株命名为c.glutamicum caths141，现保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号cctcc no:m 20211495，保藏日期2021年11月29日。
61.实施例2：将xylab表达盒整合在ldh位点
62.先构建xylab(木糖异构酶和木酮糖激酶编码基因簇)的整合质粒，具体构建方法如下：以c.glutamicum的基因组为模板，利用peftu-f(如seq id no:6所示)和peftu-r(如seq id no:7所示)引物通过pcr的方法扩增得到peftu启动子(如seq id no:2所示)；以e.coli bl21基因组为模板，利用xylab-f(如seq id no:8所示)和xylab-r(如seq id no:9所示)引物通过pcr的方式扩增得到xylab片段(如seq id no:1所示)；以peftu和xylab为模板，利用peftu-f和xylab-r引物，通过重叠延伸pcr的方式得到peftu_xylab融合片段(如seq id no:10所示)。以c.glutamicum的基因组为模板，利用ldh-up-f(如seq id no:11所示)和ldh-up-r(如seq id no:12所示)引物通过pcr的方法扩增得到ldh-up片段(如seq id no:5所示)；以c.glutamicum caths141的基因组为模板，利用ldh-down-f(如seq id no:13所示)和ldh-down-r(如seq id no:14所示)引物通过pcr的方法扩增得到ldh-down片段(如seq id no:15所示)；以ldh-up片段，peftu_xylab和ldh-down片段为模板，利用ldh-up-f和
ldh-down-r引物，通过重叠延伸pcr的方式得到δldh::xylab融合片段，并用ecori和hindiii内切酶对其进行处理，再利用t4连接酶将其插入到pk18mob质粒(购买途径见http://www.biovector.net/product/1089.html)中，得到pk18-δldh::xylab质粒。期间，可利用含有卡那霉素抗性的种子培养平板筛选连接成功的质粒。接着通过电转的方式将整合质粒pk18-δldh::xylab转入c.glutamicum caths141中，进而通过pcr验证的方式筛选出发生正确同源重组的菌株，得到重组谷氨酸棒状杆菌，命名为cgl01。
63.实施例3：构建xylab分别与cgl1574,cgl1575,cgl1574&1575组合表达盒
64.参考实施例2，以c.glutamicum caths141的基因组为模板，通过引物cgl1574-f(如seq id no:16所示)和cgl1574-r(如seq id no:17所示)，以及cgl1575-f(如seq id no:18所示)和cgl1575-r(如seq id no:19所示)分别扩增得cgl1574和cgl1575片段；参考实施例2中融合pcr方式获得cgl1574&1575表达盒(如seq id no:20所示)；参考实施例2中融合pcr方式在进一步获得xylab分别与cgl1574,cgl1575,cgl1574&1575的组合表达盒ab-1574(如seq id no:21所示),ab-1575(如seq id no:22所示)和ab-1574&1575(如seq id no:23所示)，期间用到的引物为p-ab-r(如seq id no:24所示)。
65.实施例4：分别将ab-1574、ab-1575和ab-1574&1575表达盒整合在ldh位点
66.参考实施例2分别将ab-1574、ab-1575和ab-1574&1575插入到pk18mob质粒，分别得到pk18-δldh::ab-1574,pk18-δldh::ab-1575和pk18-δldh::ab-1574&1575。参考实施例2中电转方式分别将整合质粒pk18-δldh::ab-1574,pk18-δldh::ab-1575和pk18-δldh::ab-1574&1575转入c.glutamicum caths141中，正确的基因工程菌株分别命名为cgl02、cgl03和cgl04。
67.实施例5：不同基因工程菌的木糖发酵
68.通过摇瓶体系发酵分别评价cgl01、cgl02、cgl03和cgl04以及对照菌株的发酵性能。发酵过程为：发酵培养基包括1g/l磷酸二氢钾，3g/l尿素，0.6g/l硫酸镁，20g/l玉米浆，并添加40g/l木糖作为碳源，添加25μg/ml的卡纳霉素。发酵在250ml的摇瓶中进行，培养条件为30℃，200rpm，发酵时间为96时。发酵结果如表1所示，可知cgl04代谢木糖能力最强。
69.表1不同基因工程菌的木糖发酵比较
70.菌株消耗的木糖(％)caths1410cgl0149.65
±
2.32cgl0256.28
±
1.76cgl0353.27
±
3.13cgl0468.24
±
1.11
71.实施例6：不同基因工程菌的混合糖发酵
72.参考实施例5在混合糖体系中进行发酵评价，与其不同之处为，此处用到的碳源是25g/l木糖和25g/l葡萄糖。发酵结果如表2所示，转酮醇酶和转醛醇酶的增强可提高赖氨酸转化率，其中，各组与对照组之间均具有显著差异。
73.表2不同基因工程菌的混合糖发酵比较
74.菌株总糖-赖氨酸转化率(％)caths14112.04
±
0.11
cgl0118.58
±
0.20cgl0223.66
±
0.17cgl0322.30
±
0.21cgl0428.24
±
0.39
75.实施例7：不同基因工程菌在木质纤维素水解液中发酵
76.将小麦秸秆经过粉碎后，再通过直径为10毫米的筛网进行筛分，筛分后的秸秆再经过水洗除去泥土，石块和金属等杂质，在105℃烘箱中烘干至恒重后保存在封闭的塑料袋中备用。再通过酸预处理、生物脱毒和酶解糖化后，分离得到小麦秸秆水解液，其含有95.4g/l葡萄糖和34.7g/l木糖。在水解液中添加20g/l硫酸铵和5g/l甲硫氨酸和苏氨酸，将改造得到的木糖利用菌株cgl04和出发菌株培养在小麦秸秆水解液中进行发酵对比，发酵温度为30℃，ph用氨水控制在7.0，通气量为1.4vvm，转速为600rpm。
77.表3不同基因工程菌的水解液发酵比较
78.菌株总糖-赖氨酸转化率(％)caths14115.57
±
0.08cgl0120.38
±
0.15cgl0426.31
±
0.27
79.结果如表3所示，当以小麦秸秆水解液为培养基时，基因工程菌cgl04的赖氨酸产量显著高于菌株caths141和cgl01。此外，当使用谷氨酸棒状杆菌b253为出发菌，按照和菌株cgl04相同的改造方法改造得到菌株命名为b253-104，按照和菌株cgl01相同的改造方法改造得到菌株命名为b253-101，验证其在上述相同的发酵条件下发酵效果，b253、b253-101、b253-104的总糖-赖氨酸转化率分别为15.27
±
0.09％、20.40
±
0.15％、25.77
±
0.23％。据此可知，本发明得到的重组菌株具备较强的抑制物耐受性和高效的赖氨酸生产能力，具备良好的应用前景。
80.以上具体描述了本发明技术方案的操作实例，不视为对本发明的应用限制。凡操作条件的等同替换，均在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒包括启动子和xylab基因，还包括转醛醇酶基因和/或转酮醇酶基因。2.如权利要求1所述的表达盒，其特征在于，所述xylab基因的序列如seq id no:1所示；和/或，所述转醛醇酶基因的序列如seq id no:4所示；和/或，所述转酮醇酶基因的序列如seq id no:3所示。3.如权利要求1所述的表达盒，其特征在于，所述启动子为peftu启动子，所述peftu启动子的序列优选如seq id no:2所示。4.一种分离的核酸，其特征在于，所述核酸包含如权利要求1～3任一项所述的表达盒。5.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包括如权利要求1～3任一项所述的表达盒，或包括如权利要求4所述的核酸；优选地，所述重组表达载体的骨架质粒为pk18mob。6.一种基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为在出发菌中转入如权利要求1～3任一项所述的表达盒，或如权利要求4所述的核酸，或如权利要求5所述的重组表达载体；优选地，所述出发菌为谷氨酸棒状杆菌(corynebacterium glutamicum)，例如c.glutamicum b253或保藏号为cctcc no:m 20211495的c.glutamicum caths141。7.如权利要求6所述的基因工程菌，其特征在于，所述表达盒通过同源重组方式整合在所述出发菌的基因组中，或以非整合形式存在于所述出发菌中。8.如权利要求6或7所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌不表达乳酸脱氢酶，优选ldh基因被敲除；优选地，所述表达盒整合至所述ldh基因的位点上，更优选地，所述ldh基因在genbank的登录号为aje68497.1。9.一种制备l-赖氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括在发酵培养基中发酵如权利要求6～8任一项所述的基因工程菌；较佳地，所述发酵培养基含有不低于25g/l葡萄糖和/或25g/l的木糖；更佳地，所述发酵满足以下条件中的一项或多项：所述发酵的温度为28～32℃，优选30℃；所述发酵的通气量为1.0～1.7vvm，优选1.4vvm；所述发酵的ph为6～8优选7；所述发酵通过搅拌进行，所述搅拌的转速为400～800rpm，优选600rpm。10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基为木质纤维素水解液优选秸秆水解液；较佳地，所述秸秆水解液为农作物秸秆经酶解糖化后形成；更佳地，在所述秸秆水解液中添加15～25g/l硫酸铵、2～8g/l甲硫氨酸和2～8g/l苏氨酸，和/或，在所述酶解糖化前对所述秸秆水解液进行预处理，所述预处理包括筛分、除杂、酸预处理和/或脱毒处理。11.如权利要求1～3任一项所述的表达盒、如权利要求4所述的核酸、如权利要求5所述的重组表达载体或如权利要求6～8任一项所述的基因工程菌在制备l-赖氨酸中的应用。12.一种基因工程菌的制备方法，其特征在于，通过将如权利要求1～3任一项所述的表达盒导入如权利要求6～8任一项中所定义的出发菌中获得所述基因工程菌；
较佳地，所述制备方法进一步包括：阻断所述基因工程菌中乳酸脱氢酶的表达，优选敲除ldh基因；更佳地，所述表达盒整合至所述ldh基因的位点；和/或，所述ldh基因在genbank中的登录号为aje68497.1。

技术总结
本发明公开了一种用于制备L-赖氨酸的表达盒、基因工程菌及其应用。一种表达盒，所述表达盒包括启动子和xylAB基因，还包括转醛醇酶基因和/或转酮醇酶基因。本发明提供的表达盒导入出发菌后，表达转酮醇酶和转醛醇酶比出发菌株呈提高状态，有助于强化戊糖磷酸途径，从而有效提高木糖和混合糖利用效率，进而提高L-赖氨酸的产量。当使用秸秆水解液时，本发明的基因工程菌的赖氨酸产量比出发菌明显提升。本发明提供的基因工程菌可以有效利用秸秆等农业废料进行发酵，具备良好的应用前景。具备良好的应用前景。


技术研发人员：张明明 郝婷婷 刘修才
受保护的技术使用者：CIBT美国公司
技术研发日：2021.12.31
技术公布日：2023/7/13