MEKK1-MKK1/2-MPK4级联对抗STOP1蛋白的磷酸化和稳定作用

mekk1-mkk1/2-mpk4级联对抗stop1蛋白的磷酸化和稳定作用
技术领域
1.本发明涉及农学领域，具体地，本发明涉及mekk1-mkk1/2-mpk4级联对抗stop1蛋白的磷酸化和稳定作用。


背景技术：

2.酸性土壤占世界潜在可用耕地的40％，铝毒严重限制酸性土壤中的农作物产量。锌指转录因子stop1在植物抗铝毒途径中具有保守的重要作用。铝胁迫通过转录后调控诱导stop1蛋白积累，然而铝胁迫触发stop1蛋白积累的上游信号通路仍然不清楚。
3.铝是地壳中含量最丰富的金属。可溶性铝对生长在酸性土壤中的植物来说是剧毒的，而酸性土壤占比世界可用耕地的40％。为了适应这种条件，植物已经进化出多种多样的解铝毒机制主要分为以下两种：铝外排机制和铝耐受机制。植物中一个重要而广泛的铝毒外排机制是有机酸的分泌来螯合和解毒铝，包含苹果酸、柠檬酸和草酸。模式植物拟南芥(以下简称拟南芥)分泌苹果酸和柠檬酸来抵御铝胁迫，尽管对于解铝毒来说苹果酸比柠檬酸更重要。参与苹果酸和柠檬酸分泌的转运蛋白最初在作物中发现。随后，编码苹果酸转运蛋白的atalmt1和编码柠檬酸转运蛋白的atmate在拟南芥中被鉴定出来，并揭示这是根部分泌苹果酸和柠檬酸所必须。铝被隔离在液泡中对于铝积累植物和正常植物来说一个重要的铝耐受机制。据报道，液泡质体定位的一半大小的atp结合的结合盒介导了液泡中铝的隔离。细菌型abc转运蛋白复合体star1/als3最初被观察到通过铝再分配和细胞壁修饰来解铝毒。而且，最近的研究表明atstar1/als3可能也有助于液泡中铝的隔离，尽管潜在的机制仍有待准确阐述。
4.然而目前诱导stop1蛋白积累的上游铝信号通路在很大程度上仍是个未知数。
5.因此，本领域迫切需要探索stop1的上游信号通路，提高植物的铝毒抗性开发一种调控stop1积累和铝毒抗性的方法。


技术实现要素：

6.本发明的目的就是提供一种调控stop1积累和铝毒抗性的方法。
7.本发明的第一方面提供了一种stop1蛋白的磷酸化位点，所述的位点包括：
8.对应于(i)来源于拟南芥的野生型stop1蛋白(登录号为np_174697.1)的第386位、448位和/或486位氨基酸；或(ii)来源于玉米的野生型stop1蛋白(登录号为np_001149728.2)的第418位、和/或476位氨基酸；或(iii)来源于大豆的野生型stop1蛋白(登录号为xp_003556206.1)的第397位氨基酸。
9.在另一优选例中，对应于(i)来源于拟南芥的野生型stop1蛋白(登录号为np_174697.1)的第386位、448位和/或486位氨基酸；或(ii)来源于玉米的野生型stop1蛋白(登录号为np_001149728.2)的第418位、和/或476位氨基酸；或(iii)来源于大豆的野生型stop1蛋白(登录号为xp_003556206.1)的第397位氨基酸被磷酸化时，所述stop1蛋白可提高植物的抗铝毒能力。
10.本发明第二方面提供了一种磷酸化的stop1蛋白，所述stop1蛋白的对应于(i)来源于拟南芥的野生型stop1蛋白(登录号为np_174697.1)的第386位、448位和/或486位氨基酸；或(ii)来源于玉米的野生型stop1蛋白(登录号为np_001149728.2)的第418位、和/或476位氨基酸；或(iii)来源于大豆的野生型stop1蛋白(登录号为xp_003556206.1)的第397位氨基酸被磷酸化。
11.本发明第三方面提供了一种物质的用途，用于提高植物的抗铝毒能力，或制备一组合物或制剂，所述制剂或组合物用于提高植物的抗铝毒能力，其中所述物质选自下组：(i)磷酸化的stop1蛋白或其促进剂；(ii)mekk1-mkk1/2-mpk4信号通路促进剂、或其组合，所述磷酸化的stop1蛋白包括stop1蛋白的第386位、448位和/或486位氨基酸的磷酸化。
12.在另一优选例中，所述制剂或组合物还用于选自下组的一种或多种用途：
13.(a)促进stop1蛋白的积累；
14.(b)促进stop1下游基因(比如atalmt1,atmate,als3)的表达；
15.(c)提高stop1的蛋白的稳定性。
16.在另一优选例中，所述mekk1-mkk1/2-mpk4信号通路促进剂用于促进mekk1-mkk1/2-mpk4信号通路中mpk4对底物stop1的磷酸化，从而增强stop1下游基因的表达，并促进stop1蛋白的积累，最终增强植物的抗铝毒能力。
17.在另一优选例中，所述mekk1-mkk1/2-mpk4信号通路促进剂选自下组：小分子化合物、核酸分子、或其组合。
18.在另一优选例中，所述mekk1-mkk1/2-mpk4信号通路促进剂包括铝离子(比如，氯化铝)。
19.在另一优选例中，所述mekk1-mkk1/2-mpk4信号通路促进剂促进mekk1-mkk1/2-mpk4信号通路中mpk4的表达。
20.在另一优选例中，所述stop1蛋白来自选自下组的一种或多种农作物十字花科、禾本科、豆科。
21.在另一优选例中，所述的stop1蛋白来自选自下组的一种或多种农作物：拟南芥、水稻、玉米、大豆。
22.在另一优选例中，所述stop1蛋白来自拟南芥或其变体。
23.在另一优选例中，所述stop1蛋白来源于拟南芥(拟南芥的基因号为at1g34370，蛋白名为stop1，蛋白登录号为np_174697.1)；水稻(名称art1，登录号xp_015620753.1)；玉米(zinc finger protein stop1 homolog，登录号np_001149728.2)；大豆(protein sensitive to proton rhizotoxicity 1，登录号xp_003556206.1)。
24.在另一优选例中，所述stop1蛋白的第386位、448位和486位氨基酸位于对应于拟南芥stop1蛋白(登录号为np_174697.1)的第386位、448位和486位氨基酸。
25.在另一优选例中，所述stop1蛋白的第386位、448位和486位氨基酸位于对应于玉米stop1蛋白(登录号为np_001149728.2)的第418、476位氨基酸。
26.在另一优选例中，所述stop1蛋白的第386位、448位和486位氨基酸位于对应于大豆stop1蛋白(登录号为xp_003556206.1)的第397位氨基酸。
27.在另一优选例中，所述stop1蛋白促进剂用于促进stop1蛋白的第386位、448位和/或486位氨基酸的磷酸化水平。
28.在另一优选例中，所述stop1蛋白促进剂包括促进stop1蛋白的第386位、448位和/或486位氨基酸的磷酸化水平的物质。
29.在另一优选例中，所述的stop1蛋白促进剂选自下组：小分子化合物、蛋白、核酸分子、或其组合。
30.在另一优选例中，所述stop1蛋白的促进剂包括铝离子(比如氯化铝)、磷酸激酶mpk4、激酶mekk1和mkk1/2。
31.在另一优选例中，所述组合物包含(a)磷酸化的stop1蛋白或其促进剂、和/或mekk1-mkk1/2-mpk4信号通路促进剂；和(b)农学上可接受的载体。
32.在另一优选例中，所述的组合物为农用组合物。
33.在另一优选例中，所述组合物包含(a)磷酸化的stop1蛋白或其促进剂、和/或mekk1-mkk1/2-mpk4信号通路促进剂；和(b)农学上可接受的载体。
34.在另一优选例中，所述组合物或制剂的剂型选自下组：溶液剂、乳剂、混悬剂、粉剂、泡沫剂、糊剂、颗粒剂、气雾剂、或其组合。
35.在另一优选例中，所述植物包括十字花科、禾本科、豆科。
36.在另一优选例中，所述植物包括拟南芥、水稻、玉米、大豆。
37.本发明第四方面提供了一种组合物，包括：
38.(a)磷酸化的stop1蛋白或其促进剂、和/或mekk1-mkk1/2-mpk4信号通路促进剂；
39.(b)农学上可接受的载体。
40.在另一优选例中，所述组合物包括农用组合物。
41.在另一优选例中，所述组合物的剂型选自下组：溶液剂、乳剂、混悬剂、粉剂、泡沫剂、糊剂、颗粒剂、气雾剂、或其组合。
42.在另一优选例中，所述植物还包括其他用于提高植物的抗铝毒能力的物质。
43.本发明第五方面提供了一种本发明第四方面所述的组合物的用途，用于提高植物的抗铝毒能力。
44.在另一优选例中，所述组合物还用于选自下组的一种或多种用途：
45.(a)促进stop1蛋白的积累；
46.(b)促进stop1下游基因(比如atalmt1,atmate,als3)的表达；
47.(c)提高stop1的蛋白的稳定性。
48.本发明第六方面提供了一种提高植物的抗铝毒能力的方法，包括步骤：
49.给所述植物施用(a)磷酸化的stop1蛋白或其促进剂、和/或mekk1-mkk1/2-mpk4信号通路促进剂；或(b)本发明第四方面所述的组合物；或促进植物中stop1蛋白的第386位、448位和/或486位氨基酸的磷酸化水平；
50.其中所述磷酸化的stop1蛋白包括stop1蛋白的第386位、448位和/或486位氨基酸的磷酸化。
51.在另一优选例中，所述方法包括给予植物(a)磷酸化的stop1蛋白或其促进剂、和/或mekk1-mkk1/2-mpk4信号通路促进剂；或(b)权利要求4所述的组合物。
52.在另一优选例中，所述方法包括向植物中导入促进stop1蛋白的第386位、448位和/或486位氨基酸的磷酸化水平的物质。
53.在另一优选例中，所述方法包括促进植物中stop1蛋白的第386位、448位和/或486
位氨基酸的磷酸化。
54.在另一优选例中，利用转基因方法改造所述植物细胞，从而使所述植物细胞中的stop1蛋白的第386位、448位和/或486位氨基酸发生磷酸化。
55.在另一优选例中，所述转基因方法包括农杆菌侵染法。
56.本发明第七方面提供了一种制备基因工程的植物组织或植物细胞的方法，包括步骤：
57.促进植物组织或植物细胞中的stop1蛋白的第386位、448位和/或486位氨基酸的磷酸化水平，从而获得基因工程的植物组织或植物细胞。
58.在另一优选例中，所述的基因工程包括转基因。
59.在另一优选例中，所述方法还包括向植物组织或植物细胞中导入促进stop1蛋白的第386位、448位和/或486位氨基酸的磷酸化水平的物质。
60.在另一优选例中，利用方法包括利用转基因方法改造所述植物组织或植物细胞，从而使所述植物组织或植物细胞中的stop1蛋白的第386位、448位和/或486位氨基酸发生磷酸化。
61.本发明第八方面提供了一种制备性状改良的植物的方法，包括步骤：
62.将本发明第七方面所述的方法制备的基因工程的植物组织或植物细胞再生为植物体，从而获得性状改良的植物。
63.在另一优选例中，所述的性状包括(a)提高抗铝毒能力；和/或(b)促进stop1蛋白的积累；和/或(c)促进stop1下游基因(比如atalmt1,atmate,als3的表达；和/或(d)提高stop1的蛋白的稳定性。
64.本发明第九方面提供了一种基因工程植株，所述植株中导入促进stop1蛋白的第386位、448位和/或486位氨基酸的磷酸化水平的物质；或给所述植物施用(a)磷酸化的stop1蛋白或其促进剂、和/或mekk1-mkk1/2-mpk4信号通路促进剂；或(b)本发明第四方面所述的组合物；或所述的植株是用本发明第八方面所述的方法制备的；其中所述磷酸化的stop1蛋白包括stop1蛋白的第386位、448位和/或486位氨基酸的磷酸化。
65.在另一优选例中，所述促进stop1蛋白的第386位、448位和/或486位氨基酸的磷酸化水平的物质包括磷酸激酶(比如磷酸激酶mpk4)。
66.应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
67.下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
68.图1显示了rae4突变体中stop1调控的基因表达水平和铝毒抗性增加。
69.(a)luc信号强度在rae4中增加
70.(b-h)在rae4中基因luc(b)，stop1调控基因atalmt1(c),atmate(d)，als3(e),atstar1(f),als1(g)以及stop1(h)表达升高。植株在0(-al)或30μm al(+al)中处理12小时用于mrna水平分析。每个处理包含3个生物学重复(n＝3)。
71.(i)rae4中stop1蛋白积累增加。wt,rae4,rae1以及stop1的苗子在(-al)或30μm al(+al)中处理12小时，stop1内源抗体用于检测植株内的stop1蛋白水平。actin蛋白作为内参蛋白。箭头指示的是stop1蛋白的条带。(j和k)抗铝毒表型代表图片(j)和定量数据(k)。wt,rae4以及rae1的种子点在包含0,0.75，1或1.25mm al的浸泡板上7天，每组包含30-44棵小苗不同字母的含义明显不同(p《0.05，anova test)。scale bar＝1cm。
72.图2显示了mpk4的基因突变降低了stop1调控基因的表达，stop1蛋白的稳定性及抗铝毒表型。
73.(a-d)mpk4中stop1调控基因atalmt1(a),atmate(b)，als3(c)以及stop1(d)表达降低。每组3个生物学重复，星号表示统计学上不同的值(student’s test,*p《0.05，**p《0.01)。n.s.表示没有显著差异。
74.(e)mpk4中stop1的蛋白含量降低。用ha抗体检测-al或+al条件下pstop1:stop1-3ha以及mpk4/pstop1:stop1-3ha中stop1蛋白的含量。
75.(f)mpk4中stop1的蛋白稳定性降低。pstop1:stop1-3ha以及mpk4/pstop1:stop1-3ha的根先在0或(-al)或30μm al(+al)中处理4小时，然后al处理过的根被转移到30μm al且-chx或100μm chx的处理液中继续处理2,4或6小时。最后用ha抗体检测stop1蛋白的含量。
76.(g和h)抗铝毒表型代表图片(g)和定量数据(h)表明mpk4突变体对al敏感。种子点在包含0,0.75，1或1.25mm al的浸泡板上12天。组包含20-25棵小苗不同字母的含义明显不同(p《0.05，anova test)。
77.(i)mpk4根尖中al积累增加。根在30μm al中处理12小时用eriochrome cyanine r染色。
78.图3显示了mpk4能与stop1互作并磷酸化stop1。
79.(a)mpk4与stop1在pull-down实验中互作。his标记的stop1与gst或gst-mpk4孵育，受约束的蛋白在蛋白免疫沉淀中用anti-his和anti-gst检测。
80.(b)mpk4与stop1在酵母系统中互作。stop1和mpk4的cds序列被引入到pbts和ppr3-n载体中。共表达stop1和mpk4的酵母细胞生长在二缺和四缺板子上。
81.(c)mpk4与stop1在split-luc实验中互作。camv 35s启动子驱动的质粒在烟草中共表达，然后互作依赖的luc活性被检测。
82.(d)mpk4与stop1的co-ip实验。stop1-3ha与mpk4-2flag或gfp-2flag在原生质体中共表达。粗蛋白提取物用anti-ha磁珠免疫沉淀并与anti-flag抗体检测。
83.(e)wt版本的以及突变版本的stop1能被持续激活形式的mpk4(mpk4-ca)在体外磷酸化。wt或突变版本的his-stop1与his标记的mpk4-ca孵育，磷酸化的stop1可以通过免疫放射自显影可视化。
84.(f)al胁迫诱发mpk4在体内磷酸化stop1。wt的根在30μm al中处理0,10,30或60分钟然后mpk4被免疫沉淀。重组his标记的stop1与ip下来的mpk4孵育用于磷酸化实验。
85.(g-i)al胁迫下stop1的单突，三突以及mpk4突变对stop1磷酸化的影响。植物根在0(-al)或30μm al(+al)中处理1小时被用于phos-tag检测。上面的条带表示磷酸化的stop1,它可以被λppase处理去磷酸化。
86.图4显示了stop1的t386位点的磷酸化增强了stop1的蛋白含量及铝毒抗性。
87.转基因植物pstop1:stop1
wt-3ha(stop1
wt
),pstop1:stop1
t386a-3ha(stop1
t386a
)或pstop1:stop1
t386d-3ha(stop1
t386d
)在0(-al)或30μm al(+al)中处理12小时用于蛋白检测，或者在包含0,0.75，1或1.25mm al的浸泡板上生长7天来用于衡量铝毒抗性。
88.(a和b)stop1的t386a突变降低了stop1的蛋白水平和铝毒抗性
89.(c-e)stop1的t386d突变增加了stop1的蛋白水平和铝毒抗性
90.图5显示了stop1的t386,s448和s486的磷酸化增加了stop1的蛋白稳定性和铝毒抗性。
91.(a-b)stop1
3a
的突变降低了stop1的蛋白水平和稳定性。转基因植物pstop1:stop1
wt-3ha(stop1
wt
),pstop1:stop1
t386a-3ha(stop1
t386a
)和pstop1:stop1
3a-3ha(stop1
3a
)在0(-al)或30μm al(+al)中处理12小时用于蛋白检测。对于稳定性实验，植株的根先在0或(-al)或30μm al(+al)中处理4小时，然后al处理过的根被转移到30μm al且-chx或100μm chx的处理液中继续处理2,4或6小时。最后用ha抗体检测stop1蛋白的含量。
92.(c和d)抗铝毒表型代表图片(c)和定量数据(d)表明stop1
3a
的植株降低了铝毒抗性。种子点在包含0,0.75，1或1.25mm al的浸泡板上7天用来指示铝毒抗性。
93.(e和f)stop1
3d
的突变增加了stop1的蛋白水平和稳定性
94.(g和h)抗铝毒表型代表图片(g)和定量数据(h)表明stop1
3d
的植株增加了铝毒抗性。
95.图6显示了stop1的磷酸化抑制了其与rae1的互作。
96.(a)wt或突变体版本的stop1与rae1δf在酵母系统中的互作。不同版本的stop1与rae1δf被分别引入到pgadt7和pgbkt7载体中。共表达同版本的stop1与rae1δf的酵母细胞生长在二缺和四缺培养基上。
97.(b和c)t386的突变形式以及thr386 ser448 ser486的突变形式对于其与rae1δf在植物中互作的影响。
98.(d和e)不同版本的stop1与rae1δf在co-ip实验中的互作。stop1
wt-2flag,stop1
t386a-2flag或stop1
t386d-2flag与rae1δf-3ha在原生质体中共转(d),stop1
wt-2flag,stop1
3a-2flag或stop1
3d-2flag与rae1δf-3ha在原生质体中共转。gfp-2flag也与rae1δf-3ha共转，这被视为阴性对照。
99.图7显示了mekk1与mkk1/2的突变都降低了stop1的稳定性以及铝毒抗性
100.(a)mekk1中stop1的蛋白含量降低。pstop1:stop1-3ha以及mekk1/pstop1:stop1-3ha的根在0或(-al)或30μm al(+al)中处理12小时。actin蛋白用作内参。
101.(b)mekk1中stop1的蛋白稳定性下降。pstop1:stop1-3ha以及mekk1/pstop1:stop1-3ha转基因植物0或(-al)或30μm al(+al)中处理4小时，然后al处理过的根被转移到0μm al且-chx或100μm chx的处理液中继续处理2,4或6小时。
102.(c和d)抗铝毒表型代表图片(c)和定量数据(d)表明mekk1植株铝毒抗性下降。
103.wt,mekk1以及als3种子点在包含0,0.75，1或1.25mm al的浸泡板上12天。
104.(e)mkk1 nkk2中stop1的蛋白含量降低
105.(f和g)抗铝毒表型代表图片(f)和定量数据(g)表明mkk1 nkk2植株铝毒抗性下降
106.(h)mekk1-mkk1/2-mpk4参与铝毒信号通路的模式图
107.al胁迫激活mekk1-mkk1/2-mpk4信号通路，它可以在thr386 ser448ser486三个位
点上磷酸化stop1。stop1的磷酸化抑制了它与rae1的互作，从而稳定了stop1的蛋白并提高了stop1调控的下游基因atalmt1,atmate和als3的表达以及铝毒抗性。
108.图8显示了rae4的克隆与定位。
109.rae4(col-0背景)与ler生态型杂交获得f2定位群体。显示ssr标记的名称和物理位置在矩形上方，而每个标记和rae4之间的重组速率(％)表示在矩形下方。rae4最终用了91株具有正常luc信号的f2群体被定位在at1025和at1036之间。stop1上有一个a-t的替换，它造成了从脯氨酸到丝氨酸的变化。
110.图9显示了转基因植物stop1p
387s
增加了stop1的蛋白积累，stop1调控的下游基因的表达以及铝毒抗性。
111.转基因植物pstop1:stop1
wt-3ha(stop1
wt
)和pstop1:stop1
p387s-3ha(stop1
p387s
)在0(-al)或30μm al(+al)中处理12小时用于蛋白检测，或者在包含0,0.75，1或1.25mm al的浸泡板上生长7天来用于衡量铝毒抗性。
112.(a)与stop1
wt
中stop1基因表达水平相似的stop1
p387s
株系
113.(b)stop1
wt
和stop1
p387s
株系中的stop1蛋白含量比较
114.(c-e)stop1
p387s
株系中stop1-调控的下游基因atalmt1(c),atmate(d)和als3(e)表达水平升高
115.(f和g)stop1
wt
和stop1
p387s
株系的抗铝毒表型代表图片(f)和定量数据(g)
116.图10显示了mpk3和mpk6的单突或双突对stop1下游基因的影响
117.(a-c)wt,mpk3以及mpk6中stop1下游基因atalmt1(a),atmate(b)和als3(c)的比较。植株在0(-al)或30μm al(+al)中处理12小时用于mrna含量检测。
118.(d-f)wt和mpk6sr中stop1下游基因atalmt1(d),atmate(e)和als3(f)的比较。植物生长在含有1μm na-ppi或等体积的dmso的1/2ms培养基上生长9天然后在0(-al)或30μm al(+al)中处理12小时用于mrna含量检测。
119.图11显示了mpk4的回补株系中的stop1下游基因的表达以及铝毒抗性
120.(a-c)mpk4中下降的atalmt1(a),atmate(b)和als3(c)基因表达在回补株系中得到了回补。株在0(-al)或30μm al(+al)中处理12小时用于mrna含量检测。
121.(d和e)wt,mpk4以及mpk4的回补株系的抗铝毒表型代表图片(d)和定量数据(e)。wt,mpk4以及mpk4的回补株系在0或0.75mm的浸泡板上生长9天。每组包含20-25棵小苗。
122.图12显示了stop1的thr386位点的突变对于stop1下游基因表达的影响。
123.转基因植物pstop1:stop1
wt-3ha(stop1
wt
),pstop1:stop1
t386a-3ha(stop1
t386a
)和pstop1:stop1
t386d-3ha(stop
t386d
)在0(-al)或30μm al(+al)中处理12小时用于mrna检测。
124.(a-d)t386a降低了stop1(a),atalmt1(b),atmate(c)和als3(d)中的表达。
125.(e-h)t386d增加了stop1(e),atalmt1(f),atmate(g)和als3(h)中的表达。
126.图13显示了stop1的thr386,ser448和ser 486位点的突变对于stop1下游基因表达的影响
127.转基因植物pstop1:stop1
wt-3ha(stop1
wt
),pstop1:stop1
3a-3ha(stop1
3a
)和pstop1:stop1
3d-3ha(stop1
3d
)在0(-al)或30μm al(+al)中处理12小时用于mrna检测。
128.(a-d)3a的突变降低了stop1(a),atalmt1(b),atmate(c)和als3(d)中的表达。
129.(e-h)3d的突变增加了stop1(e),atalmt1(f),atmate(g)和als3(h)中的表达。
130.图14显示了mekk1或mkk1/2的突变降低了stop1下游调控基因的表达
131.(a-d)mekk1的突变降低了stop1下游调控基因的表达。wt和mekk1的植株在0(-al)或30μm al(+al)中处理12小时用于mrna检测。
132.(e-h)mkk1和mkk2的双突降低了stop1下游调控基因的表达。wt和mekk1的植株在0(-al)或30μm al(+al)中处理12小时用于mrna检测。
具体实施方式
133.经过广泛而深入的研究，本发明人通过对大量的植物性状位点的研究和筛选，首次发现，促进植物中stop1蛋白的第386位、448位和/或486位氨基酸的磷酸化水平，可显著(a)提高植物的抗铝毒能力；和/或(b)促进stop1蛋白的积累；和/或(c)促进stop1下游基因(比如atalmt1,atmate和als3(h))的表达；和/或(d)提高stop1的蛋白的稳定性。此外，发明人还意外发现，mekk1-mkk1/2-mpk4信号通路本身以及对mekk1-mkk1/2-mpk4信号通路的促进作用，也可以显著(a)提高植物的抗铝毒能力；和/或(b)促进stop1蛋白的积累；和/或(c)促进stop1下游基因(比如atalmt1,atmate和als3)的表达；和/或(d)提高stop1的蛋白的稳定性。在此基础上，发明人完成了本发明。
134.stop1蛋白
135.如本文所用，术语“本发明多肽”、“stop1蛋白”可以互换使用，都是指来源于植物(比如，拟南芥、水稻、玉米)的stop1蛋白。其核苷酸可以通过基因工程技术来获得，如基因组测序、聚合酶链式反应(pcr)等，其氨基酸序列可由核苷酸序列推导而得到。
136.在一优选实施方式中，所述stop1蛋白来源于拟南芥，名称为stop1，登录号为np_174697.1。
137.在一优选实施方式中，所述sweet蛋白来源于水稻，名称为art1，登录号为xp_015620753.1。
138.在一优选实施方式中，所述sweet蛋白来源于玉米，名称为zinc finger protein stop1 homolog，登录号为np_001149728.2。
139.在一优选实施方式中，所述sweet蛋白来源于大豆，名称为protein sensitive to proton rhizotoxicity 1，登录号为xp_003556206.1。
140.在本发明中，促进植物中stop1蛋白的第386位、448位和/或486位氨基酸的磷酸化水平，可显著(a)提高植物的抗铝毒能力；和/或(b)促进stop1蛋白的积累；和/或(c)促进stop1下游基因(比如talmt1,atmate和als3)的表达；和/或(d)提高stop1的蛋白的稳定性。
141.表达载体
142.本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或本发明突变蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
143.通过常规的重组dna技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产本发明所述的蛋白或其变异体。一般来说有以下步骤：
144.(1).用编码本发明蛋白或其变异体的多核苷酸，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
145.(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；
146.(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
147.本发明还提供了一种包括本发明的基因的重组载体。作为一种优选的方式，重组载体的启动子下游包含多克隆位点或至少一个酶切位点。当需要表达本发明目的基因时，将目的基因连接入适合的多克隆位点或酶切位点内，从而将目的基因与启动子可操作地连接。作为另一种优选方式，所述的重组载体包括(从5’到3’方向)：启动子，目的基因，和终止子。如果需要，所述的重组载体还可以包括选自下组的元件：3’多聚核苷酸化信号；非翻译核酸序列；转运和靶向核酸序列；抗性选择标记(二氢叶酸还原酶、新霉素抗性、潮霉素抗性以及荧光蛋白等)；增强子；或操作子。
148.在本发明中，编码蛋白的多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
149.本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明蛋白编码dna序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组dna技术、dna合成技术、体内重组技术等。使用本发明的基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子。
150.所述的dna序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mrna合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体pl启动子；真核启动子包括cmv立即早期启动子、hsv胸苷激酶启动子、早期和晚期sv40启动子、反转录病毒的ltrs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
151.包括本发明基因、表达盒或的载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使宿主表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体和宿主细胞。用重组dna转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物(如大肠杆菌)时，能吸收dna的感受态细胞可在指数生长期后收获，用cacl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用mgcl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的dna转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
152.转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、幼胚转化法、花芽浸泡法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得转基因的植物。
153.此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(gfp)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
154.包含上述的适当dna序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
155.宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母、植物细胞(如水稻细胞)。
156.本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是dna的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的sv40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。
157.本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
158.获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
159.本发明所述的蛋白可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(hplc)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
160.提高植物的抗铝毒能力
161.在本发明中，还提供了一种提高植物的抗铝毒能力的方法，具体地，给所述植物施用(a)磷酸化的stop1蛋白或其促进剂、和/或mekk1-mkk1/2-mpk4信号通路促进剂；或(b)本发明第四方面所述的组合物；或促进植物中stop1蛋白的第386位、448位和/或486位氨基酸的磷酸化水平；其中所述磷酸化的stop1蛋白包括stop1蛋白的第386位、448位和/或486位氨基酸的磷酸化，从而提高植物的抗铝毒能力。
162.本发明的主要优点包括：
163.(1)本发明首次发现，促进植物中stop1蛋白的第386位、448位和/或486位氨基酸的磷酸化水平，可显著(a)提高植物的抗铝毒能力；和/或(b)促进stop1蛋白的积累；和/或(c)促进stop1下游基因(比如atalmt1,atmate和als3)的表达；和/或(d)提高stop1的蛋白的稳定性。
164.(2)本发明还首次发现，mekk1-mkk1/2-mpk4信号通路本身以及对mekk1-mkk1/2-mpk4信号通路的促进作用，也可以显著(a)提高植物的抗铝毒能力；和/或(b)促进stop1蛋白的积累；和/或(c)促进stop1下游基因(比如atalmt1,atmate和als)的表达；和/或(d)提高stop1的蛋白的稳定性。
165.(3)本发明首次发现，mekk1-mkk1/2-mpk4级联可以正向调控stop1蛋白的磷酸化和稳定性。mekk1,mkk1/2或者mpk4的基因突变会导致stop1稳定性和铝毒抗性的降低。而且，铝胁迫可以诱发mpk4蛋白的激酶活性，从而使其与stop1蛋白互作并磷酸化stop1。stop1的磷酸化抑制了其与f-box蛋白rae1的互作能力，rae1之前被报道过可以降解stop1蛋白，因此磷酸化可以增强stop1自身的稳定性和铝毒抗性。本发明的结果揭示了mekk1-mkk1/2-mpk4级联对于stop1上游以及植物抗铝毒的重要性。
166.(4)本发明首次确定了mekk1-mkk1/mkk2-mpk4级联参与stop1的上游铝信号。mekk1、mkk1/2或mpk4突变能抑制stop1蛋白积累和降低铝抗性。本发明揭示了铝胁迫增强了mpk4的激酶活性，它直接与stop1互作并磷酸化stop1，以此来正调控stop1积累和铝毒抗性。
edta-free,50μm mg132和instab
tm phosphatase inhibitor cocktail(yeasen)。混有sds的样品点在加了10mm mncl2的phos-tag胶上。
192.ip-kinase实验
193.14天的野生型苗子先用ph 4.8的0.5mm的cacl2溶液处理6小时，然后再在包含0或30μm alcl3的0.5mm的cacl2溶液中处理10,30和60分钟。植物根被收集起来提取总蛋白，蛋白提取溶液配方：100mm tris-hcl(ph 7.5),150mm nacl,5％glycerol,1mm dtt,1mm pmsf,1mm naf,1mm na3vo4,50μm mg132,protease inhibitor和phosphatase inhibitor。对于免疫蛋白沉淀实验，60微升的protein g磁珠与3微升的anti-mpk4抗体在4度孵育3个小时。然后大约15毫克的总蛋白与mpk4偶联的protein g磁珠4度孵育3小时。这个混合物接下来用蛋白提取液洗三次，用激酶反应液((20mm tris-hcl at ph 7.5,10mm mgcl2,25μm atp,和1mm dtt)洗一次。对于激酶实验，50微升的反应混合物：包含mpk4偶联的磁珠，10微克stop1蛋白，50μm atp，1μci(γ-32p)atp和激酶反应液在30度反应45分钟。反应结束加上5
×
sds loading buffer上样。
194.重组蛋白表达以及体外磷酸化实验
195.为了在细菌中表达蛋白，pet-29a-ca-mpk4,pet-29a-stop1,pet-29a-stop1
t386a
,pet-29a-stop1
s448a
,pet-29a-stop1
s486a
或者pet-29a-stop
t386a,s448a,s486a
被转化进bl21中。已经转化的细菌细胞在3毫升lb中摇起来，然后再1:100加入到100毫升lb中摇3个小时。0.1mm iptg加入到lb中在17度诱导16个小时。所有的蛋白用ni-nta琼脂糖磁珠纯化。对于体外磷酸化实验，wt或突变体版本的stop1与ca-mpk4在反应液(25mm tris-hcl(ph 7.5),12mm mgcl2,1mm dtt,atp(50μm),和1μci(γ-32p)atp)里30度反应1小时。反应液用sds loading buffer终止。
196.实施例1能增加stop1调控基因的表达和铝毒抗性的rae4突变体的鉴定
197.对atalmt1启动子驱动的荧光素酶(luc)报告基因(patalmt1:luc)转基因株系进行了ems诱变，通过正向遗传筛选得到了一系列luc信号变化的rae(regulation of atalmt1 expression)突变体,这其中包括luc信号增强的突变体rae4(图1a)。mrna表达分析显示受stop1调控的luc,atalmt1,atmate和als3的表达水平均比野生型中表达要高，无论是在氯化铝溶液处理或不处理的情况下(图1b-1e)。然而不受stop1调控的基因，比如atstar1,als1和stop1，它们的表达水平与野生型中类似(图1f-1h)。与阳性对照rae1相比，rae4突变体中stop1调控的基因拥有更高的表达水平。然后我们比较了突变体rae4中的stop1蛋白积累情况通过stop1内源抗体。我们分别使用rae1和stop1作为阳性对照和阴性对照，我们证明了在rae4突变体中stop1蛋白积累比野生型中要多(图1i)。这些结果表明rae4的突变诱导了stop1调控基因的表达，可能是因为stop1丰度或活性的增加。
198.为了确定rae4的抗铝毒表型，我们将wt,rae4和rae1的根暴露在不同浓度的铝处理下。在对照组条件下，rae4突变体的根长比野生型更短(图1j)。然而，在有铝的情况下，rae4突变体以及抗铝毒阳性对照rae1的根都比野生型长得要快(图1k)，这表明rae4植株对al的抗性强于wt植株。
199.实施例2 stop1蛋白第387位氨基酸发生从脯氨酸到丝氨酸的置换导致了rae4突变体中的stop1蛋白积累
200.利用rae4和野生型对照杂交得到的f2群体进行遗传分析，在144株f2中,有106株
植物拥有增强的luc信号，38株植株拥有降低的luc信号。这一比例的卡方检验结果显示增强的luc信号的表型是由单一显性基因控制。
201.为了克隆rae4突变基因，我们将rae4与ler生态型杂交并得到了f2群体。我们首先挑选了具有正常luc信号的20株f2植株，并利用覆盖整个基因组的25个简单序列重复标记对这20株植株进行连锁分析。在1号染色体短臂上的标记at1017和at1033显示与突变基因连锁。随后我们使用了具有正常luc信号的91株f2植株和三个位于at107和at1033之间的标记来标记rae4。最终，rae4被映射到标记at1025和at1036之间，分别具有3.85％和2.2％的重组交换率。基因stop1(at1g34370)被发现在映射区域(图8)。因此，我们对rae4突变体中的stop1基因进行了测序并鉴定到在1459bp的地方存在c到t的碱基替换。这种替换导致了stop1蛋白387位氨基酸从脯氨酸到丝氨酸的转变，提示我们stop1蛋白的p387s的突变可能是rae4突变体中luc信号增强和铝毒抗性增加的原因。
202.为了证实rae4基因就是stop1基因，我们将突变类型的stop1融合在3ha标签后面并在自身启动子的驱动下转化到stop1突变体植株背景中。我们筛选出了具有正常stop1表达水平的两个独立转基因株系(图9a)以供进一步分析。在使用ha抗体的蛋白免疫印迹实验中，stop1
p387s
株系显示出了比stop1
wt
中更高的蛋白丰度(图9b)。与此前观察的一致，stop1
p387s
株系中stop1下游基因也显示比stop1
wt
表达水平更高(图
203.9c-9e)。而且，stop1
p387s
株系比stop1
wt
有更强的的铝毒抗性(图9f和9g)，尽管，stop1
p387s
株系在对照情况下比stop1
wt
株系根长长得慢。这些结果表明stop1中的p387s突变与观察到的rae4突变表型有关。
204.实施例3 mpk4正向调控al诱发的stop1蛋白积累
205.stop1的386位和387位氨基酸分别是苏氨酸和脯氨酸，这是可能被mapks识别的区域。因为磷酸化依赖的信号级联被考虑可能调节stop1蛋白积累，我们推测mapks可能调节stop1的磷酸化和稳定性。为了验证mapk调控stop1蛋白积累，我们获得了参与众多生物过程调控的mpk3,mpk4和mpk6的t-dna插入株系，通过比较了野生型和mpk突变体中stop1调控基因的表达水平来决定哪个基因的突变会影响stop1的丰度。其中，在-al和+al下mpk3或mpk6突变显示都不影响stop1下游基因的表达(图10a-10c)。考虑到mpk3和mpk6存在功能冗余与，我们也分析了化学诱导敲除株系mpk6sr(mpk3 mpk6 pmpk6:mpk6yg)。该株系存在y144g替换，该替换可以被可逆的细胞通透性抑制剂na-pp1阻断。表达分析显示，该化学敲除株系mpk6sr无论是否被na-pp1化学试剂处理，stop1下游基因表达水平均与野生型中一致(图10d-10f)。这些发现表明mpk3和mpk6在调控stop1蛋白积累方面并不起作用。相反地是，mpk4的突变显著的抑制了al诱导的stop1调控基因的表达(图2a-2c),尽管在mpk4和野生型中stop1表达水平相似的情况下(图2d)。因此，mpk4可能调控al诱发的stop1蛋白积累。
206.为了阐明mpk4-2突变对stop1蛋白积累的影响，我们将先前得到的pstop1:stop1-3ha转基因引入到mpk4-2背景下。免疫印迹分析证实，stop1-3ha在mpk4中的含量低于在wt中的含量(图2e)。为了研究mpk4的突变是否改变了stop1的蛋白稳定性，我们分析了蛋白合成抑制剂处理和铝处理下的时间梯度实验中stop1的蛋白积累情况，结果显示mpk4突变体背景下stop1的蛋白含量降低得更快(图2f)，这表明mpk4突变对stop1的稳定性产生了不利的影响。mpk4突变体在对照情况下有根生长缺陷表型(图2g)；然而，相对于野生型，在铝胁迫下mpk4突变体的相对根长比野生型更短(图2g和2h)，表明mpk4突变体对铝胁迫比野生型
更敏感。此外，在铝胁迫下对植物根尖进行er染色。mpk4突变体根尖的al积累量比野生型中要多(图2i)。mpk4中stop1调控的下游基因表达水平的降低和增加的铝敏感性在先前文章中产生的mpk4的回补株系中完全恢复(图11a-e)。综合考虑，这些观察结果表明mpk4正向调控al诱发的stop1蛋白积累。
207.实施例4 mpk4与stop1互作并磷酸化stop1
208.为了测试mpk4是否与stop1直接互作，我们首先利用gst阴性对照和gst-mpk4进行了pull-down实验，结果证明stop1-his能与gst-mpk4而不是单独的gst形成复合体(图3a),表明stop1可以直接与mpk4在体外互作。因为stop1和mpk4在酵母双杂系统中都可以自我激活，我们使用了细胞质酵母双杂交系统(cytoy2h)来验证stop1与mpk4之间的相互作用。在这个系统中，为了避免自我激活，stop1蛋白通过与小的完整膜蛋白ost4p的融合而固定在膜上。cytoy2h系统证明了stop1与mpk4之间的相互作用(图3b)。为了判断stop1是否与mpk4在体内互作，我们在烟草里进行了分裂的luc互补(split-luc)实验。luc信号最终只在stop1-nluc和cluc-mpk4组合检测到(图3d)，反映了在植物内stop1与mpk4的相互作用。为了评估stop1与mpk4在拟南芥中是否形成复合物，我们实行了拟南芥原生质体的co-ip实验。stop1-3ha融合蛋白能与mpk4-2flag共沉淀，而不是与阴性对照gfp-2flag(图3c)。因此，stop1可以直接与mpk4互作。
209.为了检测mpk4是否可以磷酸化stop1,我们通过将持续激活形式的mpk4(mpk4-ca)与stop1共同孵育实施了体外磷酸化实验。实验结果表明mpk4-ca能够磷酸化stop1(图3e)。我们还从受不同时间铝胁迫的野生型植物根尖中免疫沉淀了mpk4通过mpk4内源抗体来检测mpk4是否在体内可以磷酸化stop1。此外，还证明了铝胁迫增加了mpk4的激酶活性(图3f)。
210.在stop1蛋白中有三个mapk结合(s/t)p模体(即thr386pro387,ser448pro449和ser486asp487)。为了检测哪个stop1的t/s可以被mpk4磷酸化，我们将每一个t/s都突变成了a。三个位点的突变分别在不同程度上抑制了stop1被mpk4磷酸化；这三个位点的同时突变消除了stop1的磷酸化(图3e)。因此，在体内mpk4可以在t386,s448,s486三个位点上磷酸化stop1。
211.实施例5 stop1的磷酸化可以正向调控stop1蛋白的积累和铝毒抗性
212.为了检测stop1是否可以在体内被磷酸化，我们利用35s:stop1-3flag过表达株系对stop1蛋白实施了免疫沉淀-质谱分析。不幸的是，由于stop1的低丰度和不稳定性我们无法通过肽段分析证明stop1磷酸化。相反，我们进行了phos-tag sds-page分析，根据磷酸化蛋白的电泳迁移率和非磷酸化形式进行比较来阐明不同铝胁迫条件下的stop1磷酸化状态。无论是在-al还是+al情况下，我们都能在胶上检测到有三个主要的上升的带和一个低一点的带。磷酸酶λppase可以降低上面三条带的染色强度(图3g)，λppase磷酸酶的处理降低了上面三条带的染色强度(图3i)这表明上面的条带代表stop1的磷酸化形式。因此，在对照条件下stop1的磷酸化程度低于铝胁迫处理下。
213.由于p387s突变增加了stop1的含量，我们推测stop1的t386位点也可能影响stop1的磷酸化和积累。为了测试这个假设，我们构建了pstop1:stop1
t386a-3ha(stop1
t386a
)的载体，并通过转基因得到了两个独立的stop1
t386a
株系用于下面的实验，它们与stop1
wt
具有一样的stop1基因表达水平(图12a)。phos-tag分析显示t386a突变导致相对轻微的磷酸化
stop1的降低，非磷酸化stop1的增加(图3g)。在铝胁迫情况下，stop1
t386a
株系中stop1的蛋白含量和stop1调控基因的表达水平相比stop1
wt
勉强地降低了(图4a；图12b-12d)。因此，在stop1
t386a
株系中铝毒抗性降低(图4b)。我们也构建了stop1
t386d
回补株系，在该株系中t386被突变成了t386d。与stop1
t386a
不同，stop1
t386d
株系比stop1
wt
包含更多的stop1蛋白含量，尽管stop1
t386d
和stop1
wt
拥有相同的stop1 mrna表达水平(图4c；图12e)。而且铝毒抗性也相应增加(图4d)。此外，在对照情况下，stop1
t386d
中的stop1调控基因的表达水平也增加了(图12f-12h)。这些结果表明t386位点的磷酸化促进了stop1的蛋白积累。
214.考虑到mpk4可以在t386,s448和s486位点上磷酸化stop1,我们探索了三个位点是否都能在体内磷酸化，并且协同调节stop1的蛋白积累。我们设计了stop1
3a
回补株系，在该株系中所有的三个位点都被转化成了丙氨酸。值得注意的是，在stop1
wt
中可以检测到的磷酸化的条带无法在stop1
3a
中检测到(图3h)，说明stop1主要在这三个位点上发生磷酸化。免疫印迹分析显示stop1
3a
中stop1的蛋白含量和稳定性也比stop1
wt
中低(图5a和5b)。与这些观察一致的是，stop1调控基因的表达水平也比stop1
wt
中低(图13a-13d)。因此，stop1
3a
株系也比stop1
wt
株系抗铝毒能力低(图5c和5d)。我们同样也设计了stop1
3d
回补株系，在该株系中三个位点都被突变成了天冬氨酸。与stop1
3a
株系不同的是，在stop1
3d
回补株系中，stop1的蛋白丰度和稳定性都比stop1
wt
高(图5e和5f)。这也导致了stop1下游基因的表达升高和抗铝毒能力的增强(图13e-13h；图5g和5h)。这些结果表明stop1可以在t386,s448和s486三个位点上被磷酸化，并且正向调控stop1的蛋白积累和铝毒抗性。
215.为了研究mpk4突变是否影响stop1的磷酸化，我们进在野生型和mpk4背景下进行了phos-tag分析，突变体中stop1的磷酸化相对适度降低(图4e)，这也证明了mpk4可能通过调控stop1磷酸化来调节stop1的蛋白积累。
216.实施例6 stop1的磷酸化可以抑制其自身与rae1之间的互作
217.stop1的磷酸化诱发自身蛋白的积累，然而f-box蛋白rae1促进stop1的降解。因此，我们在酵母双杂交系统中测试不同版本的stop1与rae1
△
f之间的互作变化情况。尽管stop1
3a
不影响与rae1
△
f之间的互作，但是stop1
3d
阻碍了stop1与rae1
△
f之间的互作(图6a)。奇怪的是，我们无法获得包含stop1
t386a
或stop1
t386d
的酵母细胞，说明stop1的t386a或t386d突变可能会以某种形式抑制酵母的生长。另外p387s的突变也会妨碍stop1与rae1
△
f之间的互作能力(图6a)。
218.接下来，我们测试了wt，磷酸化失活以及磷酸化激活形式的stop1与rae1
△
f在split-luc与co-ip系统中的互作情况。stop1
t386a
和stop1
3a
并不会显著影响stop1与rae1
△
f之间的互作，然而在split-luc系统中磷酸化激活形式的stop1(stop1
t386d
和stop1
3d
)破坏了stop1-rae1
△
f的互作(图6b和6c)。co-ip的方法进一步提供了证据表明磷酸化激活形式的突变对于stop1与rae1
△
f之间的互作是不利的(图6d和6e)。磷酸化失活形式的stop1能正向影响stop1-rae1
△
f的互作可能暗示了野生型版本的stop1在原生质体系统中也会被磷酸化，而不是在酵母系统中，因此，磷酸化失活形式的stop1能部分抑制其与rae1
△
f之间的互作(图6c和6d)。总的来说，这些结果说明了stop1的磷酸化对于stop1与rae1之间互作的影响。
219.实施例7 mekk1和mkk1/mkk2对于调控stop1的蛋白积累也有贡献
220.mekk1-mkk1/2-mpk4级联反应能帮助调控防御信号通路。为了验证mekk1和mkk1/
mkk2是否也参与到调控stop1的过程中，我们首先比较了野生型和mekk1突变体中stop1以及stop1调控基因的表达情况。mekk1突变体中stop1调控基因包含atalmt1,atmate和als3的表达都大体上下降了很多，尤其是在铝胁迫处理下(图14a-14c)。突变体中stop1的表达也适度的下降了(图14d)。为了阐明mekk1的突变对于stop1蛋白积累的影响，我们通过杂交将pstop1:stop1-3ha转基因引入到mekk1的背景下，然后进行蛋白免疫沉淀检测。检测结果显示mekk1突变体中stop1蛋白含量明显下降(图7a)。它不像stop1的表达水平只适度的下降，stop1的蛋白水平很大程度上下降了(图7a和图14d)。蛋白合成速度检测实验也显示mekk1突变体stop1的蛋白比野生型中下降更快(图7b)，表明在突变体中stop1蛋白更不稳定。铝变型实验中也显示mekk1对铝胁迫更敏感，即使在对照情况下mekk1的根长就短(图7c和7d)。
221.接下来我们测试了mkk1或mkk2突变对stop1下游调控基因的影响。发现单突mkk1或者单突mkk2都不影响stop1的下游基因表达(图14e-14g)。然而双突mkk1mkk2能抑制铝诱发的stop1调控基因的表达，但不影响stop1基因的转录(图14e-14h)。蛋白免疫沉淀分析用内源抗体也显示在双突中stop1的蛋白积累比野生型中少(图7e)。与这些结果一致，双突对铝胁迫也更敏感(图7f和7g)。这些观察都证明mekk1和mkk1/2正向调控stop1的蛋白稳定性和铝毒抗性。
222.讨论
223.胁迫感知和信号转导对于植物耐性和适应环境胁迫十分重要。c2h2锌指转录因子stop1对于植物抗铝毒十分重要，也被报道会在铝胁迫下转录后水平上被调节。然而，诱导stop1蛋白积累的上游铝信号通路仍然不清楚。本发明证明了mekk1-mkk1/2-mpk4信号通路能正向影响铝诱发的stop1蛋白积累。铝胁迫的处理激发了mpk4的激酶活性，使其与stop1互作并在thr386,ser448和ser486三个位点上磷酸化stop1。磷酸化后的stop1影响了它与rae1的互作，rae1能促进stop1降解，因此磷酸化后的stop1促进了本身的积累，并增加了stop1下游基因的表达和抗铝毒能力(图7h)。
224.stop1thr386位点或者所有三个位点的磷酸化激活状态的突变都会抑制stop1与rae1的互作(图6)，表明thr386的磷酸化可能是抑制stop1与rae1互作的主要的决定性因素。所有三个位点的磷酸化失活状态的突变对于stop1蛋白的积累和铝毒抗性都有负面的影响，比thr386单独的磷酸化失活的突变变现得更强烈。相应地，ser448和ser486也会导致stop1的稳定性和铝毒抗性的增加，可能是通过不依赖rae1的调控机制导致的。值得注意的是，pro387的突变预期会扰乱mapk介导的thr386的磷酸化，也会抑制stop1与rae1的互作(图6a)。这些观察表明除了磷酸化的thr386,pro387对于stop1与rae1的互作是非常重要的以外。rae4突变也就是p387s突变会导致stop1的蛋白积累比rae1中多(图1i)。然而，stop1下游基因的表达水平在rae4中比rae1中更高(图1b-1e)。这些结果都证明了p387s的突变会增加stop1的稳定性和活性，也解释了在正常对照情况下是由于stop1蛋白积累增加，抑制植物生长，从而导致rae4根长更短。
225.此外，本发明发现mekk1-mkk1/2-mpk4级联正向调控铝毒抗性与之前的介绍的该级联在生物和非生物胁迫方面的响应有相同的影响。我们观察到它与冷胁迫反应功能不同的是mekk1-mkk1/2-mpk4通路调控铝毒抗性是直接靶向铝抗性相关转录因子stop1而不是通过调节mpk3/mpk6，这对于调控stop1下游基因是不重要的(图10)。
huang,c.f.(2019).f-box protein rae1 regulates the stability of the aluminum-resistance transcription factor stop1 in arabidopsis.proc.natl.acad.sci.usa 116,319-327.
238.zhao,c.,wang,p.,si,t.,hsu,c.c.,wang,l.,zayed,o.,yu,z.,zhu,y.,dong,j.,tao,w.a.,et al.(2017).map kinase cascades regulate the cold response by modulating ice1 protein stability.dev.cell 43,618-629e615.
239.在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。

技术特征：
1.一种stop1蛋白的磷酸化位点，其特征在于，所述的位点包括：对应于(i)来源于拟南芥的野生型stop1蛋白(登录号为np_174697.1)的第386位、448位和/或486位氨基酸；或(ii)来源于玉米的野生型stop1蛋白(登录号为np_001149728.2)的第418位、和/或476位氨基酸；或(iii)来源于大豆的野生型stop1蛋白(登录号为xp_003556206.1)的第397位氨基酸。2.如权利要求1所述的磷酸化位点，其特征在于，对应于(i)来源于拟南芥的野生型stop1蛋白(登录号为np_174697.1)的第386位、448位和/或486位氨基酸；或(ii)来源于玉米的野生型stop1蛋白(登录号为np_001149728.2)的第418位、和/或476位氨基酸；或(iii)来源于大豆的野生型stop1蛋白(登录号为xp_003556206.1)的第397位氨基酸被磷酸化时，所述stop1蛋白可提高植物的抗铝毒能力。3.一种磷酸化的stop1蛋白，其特征在于，所述stop1蛋白的对应于(i)来源于拟南芥的野生型stop1蛋白(登录号为np_174697.1)的第386位、448位和/或486位氨基酸；或(ii)来源于玉米的野生型stop1蛋白(登录号为np_001149728.2)的第418位、和/或476位氨基酸；或(iii)来源于大豆的野生型stop1蛋白(登录号为xp_003556206.1)的第397位氨基酸被磷酸化。4.一种物质的用途，其特征在于，用于提高植物的抗铝毒能力，或制备一组合物或制剂，所述制剂或组合物用于提高植物的抗铝毒能力，其中所述物质选自下组：(i)磷酸化的stop1蛋白或其促进剂；(ii)mekk1-mkk1/2-mpk4信号通路促进剂、或其组合，所述磷酸化的stop1蛋白包括stop1蛋白的第386位、448位和/或486位氨基酸的磷酸化。5.一种组合物，其特征在于，包括：(a)磷酸化的stop1蛋白或其促进剂、和/或mekk1-mkk1/2-mpk4信号通路促进剂；(b)农学上可接受的载体。6.一种权利要求5所述的组合物的用途，其特征在于，用于提高植物的抗铝毒能力。7.一种提高植物的抗铝毒能力的方法，其特征在于，包括步骤：给所述植物施用(a)磷酸化的stop1蛋白或其促进剂、和/或mekk1-mkk1/2-mpk4信号通路促进剂；或(b)权利要求5所述的组合物；或促进植物中stop1蛋白的第386位、448位和/或486位氨基酸的磷酸化水平；其中所述磷酸化的stop1蛋白包括stop1蛋白的第386位、448位和/或486位氨基酸的磷酸化。8.一种制备基因工程的植物组织或植物细胞的方法，其特征在于，包括步骤：促进植物组织或植物细胞中的stop1蛋白的第386位、448位和/或486位氨基酸的磷酸化水平，从而获得基因工程的植物组织或植物细胞。9.一种制备性状改良的植物的方法，其特征在于，包括步骤：将权利要求8所述的方法制备的基因工程的植物组织或植物细胞再生为植物体，从而获得性状改良的植物。10.一种基因工程植株，其特征在于，所述植株中导入促进stop1蛋白的第386位、448位和/或486位氨基酸的磷酸化水平的物质；或给所述植物施用(a)磷酸化的stop1蛋白或其促进剂、和/或mekk1-mkk1/2-mpk4信号通路促进剂；或(b)权利要求5所述的组合物；或所述的植株是用权利要求9所述的方法制备的；其中所述磷酸化的stop1蛋白包括stop1蛋白的第
386位、448位和/或486位氨基酸的磷酸化。

技术总结
本发明涉及MEKK1-MKK1/2-MPK4级联对抗STOP1蛋白的磷酸化和稳定作用，具体地，本发明提供一种STOP1蛋白的磷酸化位点以及相应的磷酸化的STOP1蛋白，以及磷酸化的STOP1蛋白或其促进剂和/或MEKK1-MKK1/2-MPK4信号通路促进剂在提高植物的抗铝毒能力方面的用途。本发明首次发现，促进植物中STOP1蛋白的第386位、448和/或486位氨基酸的磷酸化水平，可显著(a)提高植物的抗铝毒能力；和/或(b)促进STOP1蛋白的积累；和/或(c)促进STOP1下游基因AtALMT,AtMATE,ALS31的表达；和/或(d)提高STOP1的蛋白的稳定性。白的稳定性。


技术研发人员：黄朝锋 周芳林 张杰 方遒
受保护的技术使用者：中国科学院分子植物科学卓越创新中心
技术研发日：2021.12.31
技术公布日：2023/7/13