一种表面改性的多孔铁基支架及其制备方法和应用

1.本发明涉及生物医学材料领域，特别涉及一种表面改性的多孔铁基支架及其制备方法和应用。


背景技术：

2.因疾病、创伤、交通事故等引发的骨缺损已成为临床的常见疾病。由于大部分的骨缺损修复均需要内植物的辅助，而作为金标准的自体骨因来源受限、二次手术等问题难以满足临床的需求，所以推动了人工骨修复材料的快速发展。在众多已上市的骨科材料中，传统医用金属如钛及钛合金、不锈钢等因其良好的机械性能而被广泛应用于骨科植入物领域。但这些材料仍存在一些难以解决的问题，如它们在人体内服役过程中会因腐蚀、磨损等产生碎屑并释放有害金属离子，导致炎症、骨质溶解的潜在风险，常需二次手术取出，增加了病人风险和经济负担。因此，有必要开发具有优异机械性能和良好生物相容性的可降解金属材料，对传统医用金属进行替换。
3.当前的可降解金属材料，主要包括镁基、锌基和铁基材料，其中镁基材料相关研究最为广泛，但镁和锌基材料的力学强度较低，不能用于承重部位的骨缺损修复。铁基材料具有良好的生物相容性和优异的机械强度，能够对承重部位的骨组织进行有效固定和支撑，近些年来也开始逐渐获得关注。
4.虽然铁基植入体能够较好促进承重骨部位的骨组织再生和修复，但其过低的降解速率致使其与植入体周边新骨的形成速度不匹配，严重影响了骨缺损的愈合速度和修复程度。常规方法是通过在基底材料内部增添合金元素以加快降解，但该方法对铁基材料的降解提升程度并不能够满足其体内降解需求，且该方法也同时会对材料的力学性能造成很大影响。此外，还有通过模板法、占位填料法、3d打印技术在铁基体中引入孔结构，通过增加与腐蚀环境的接触有效面积来提高其降解速率，但仅仅制备多孔铁也不能明显提高降解速率。


技术实现要素：

5.针对上述工艺中存在的问题，本发明拟提供一种力学性能好且降解速度快的表面改性的多孔fe基支架。
6.发明人前期所做研究(in vitro and 48 weeks in vivo performances of 3d printed porous fe-30mn biodegradable scaffolds(acta biomaterialia,2021,121,724-740)表明3d打印fe基支架在骨缺损修复过程中呈现出较好的生物相容性，但仍旧存在fe基材料降解速率过慢，导致材料降解速度与新骨再生速度不匹配的问题。
7.发明人希望通过在fe基支架已有的多孔结构上再次表面改性来提高其降解速率。基于液相溶液浸泡的化学刻蚀常被用于多孔支架的表面改性，但其刻蚀速度较慢，且难以实现支架表面形貌结构的均匀可控。去合金化是实现金属合金(如mn-cu、mg-al等)纳米化的常用方法，但直接通过去合金化制备的纳米多孔铁基材料并不适合作为植入支架，而截
至目前为止，尚未有任何关于fe-mn基多孔支架的去合金化相关研究报道。发明人经过研究发现，选择不同介质溶液，通过电化学去合金化能够在fe基支架表面构建不同形貌的纳米拓扑结构，增大其与溶液的接触面积，进而在不影响支架力学性能的前提下，显著提高其降解速率。此外，支架表面纳米拓扑结构的构建还能对成骨类细胞的增殖及分化起到一定的促进作用，提升支架的促成骨能力，最终实现fe基支架体内服役期间降解速率和成骨再生速率的动态适配。
8.本发明所采用的技术方案如下：
9.一种表面改性多孔铁基支架的制备方法，具体过程为：
10.使用电化学工作站，以多孔铁基支架为工作电极，以3.33molkcl溶液中的ag/agcl电极为参比电极，以铂板为对电极。将表面处理后的多孔fe-mn支架置于电解质溶液中，通过开路电位和动电位极化曲线(时间为900s、动电位极化扫描速率为1mvs-1
)的测定，对fe基合金的电化学性质进行了表征，从而确定临界电压。在临界电压范围(-0.85v，-0.2v)进行不同时间(20min-120min)、不同温度(25℃-45℃)的恒电位去合金化处理。
11.其中，电解液为酸性氯化钠溶液或稀盐酸溶液。
12.去合金化所用的电解液的种类、浓度以及去合金化的电压、温度、时间均会影响支架表面形貌结构，如果过度脱合金会影响支架结构，从而造成力学性能下降，如果去合金程度不够，不能形成合适的纳米结构，其降解速率得不到提升。
13.所述的多孔铁基支架可以通过常见的多孔金属制备方法制得，比如模板法、占位填料法、3d打印、有机海绵浸渍法等。孔隙率的不同会对支架的力学性能产生影响，因此通过不同的方法制备的支架，需要满足体内植入物的基本力学性能要求，在本发明中实施例中所使用支架的孔隙率为70-80％左右。
14.进一步地，所述酸性氯化钠溶液中na：h＝10:1-20:1，稀盐酸溶液浓度为0.5％-5％。
15.进一步地，所述酸性氯化钠溶液中na：h＝20:1；稀盐酸溶液浓度为1.5％。
16.进一步地，所述多孔fe基支架为fe-mn合金，fe-mn-si合金中的一种，进一步为fe-30mn。
17.fe-30mn为含有30wt％mn的fe-mn合金。
18.fe-mn合金相较于其他的铁合金具有较好的生物相容性，其中fe-30mn能够在细胞活力的抑制作用和机械性能之间的保持较好的平衡。
19.进一步地，所述电解质溶液为稀盐酸溶液时，选择恒定电压-0.4v、温度25℃进行20min的恒电位去合金化处理。所述电解质溶液为酸性氯化钠溶液时，选择恒定电压-0.65v、温度25℃、进行30min的恒电位去合金化处理。
20.本发明还提供一种采用上述方法的表面多微孔铁基支架。
21.本发明还提供上述表面改性多孔铁基支架在骨修复材料中的应用。
22.进一步地，所述骨修复材料为用于骨缺损修复的辅助内植物。
23.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
24.本发明对现有的多孔fe基支架进行去合金化处理，通过对电解液的种类以及去合金化的电压、温度、时间的筛选，在多孔支架表面100nm范围内构建适宜的纳米结构，不会对其力学性能造成影响，且通过多孔支架原有的微米孔与纳米结构配合，能够有效增大其表
面面积，提高铁基支架的降解速率。通过实验验证，其具有较好的生物相容性，能够促进成骨类细胞在其表面的增殖和分化，进而实现支架在体内降解速率和骨再生速率完美匹配。
25.说明书附图
26.图1扫描电子显微镜(sem)观察：a,d为未经过处理的多孔fe-mn支架；b,e为hcl处理多孔fe-mn支架；c,f为nacl处理多孔fe-mn支架
27.图2扫描电子显微镜(sem)观察：a:hcl溶液浓度1.25％,b：hcl溶液浓度2.5％、c：hcl溶液浓度5％
28.图3扫描电子显微镜(sem)观察：a:去合金化时间10min,b：去合金化时间20min，c：去合金化时间1h
29.图4扫描电子显微镜(sem)观察：a:恒定电压-0.4v，b：恒定电压-0.3v，c：恒定电压-0.2v
30.图5扫描电子显微镜(sem)观察：a:柠檬酸溶液浓度1.25％,b：柠檬酸溶液浓度2.5％、c：柠檬酸溶液浓度5％
31.图6不同材料表面的接触角测试
32.图7不同支架的开路电位(a)和动电位极化曲线(b)
33.图8 mc3t3-e1在不同材料表面培养3天的激光扫描共聚焦显微镜(clsm)观察
34.图9 mc3t3-e1与不同材料共培养1、3和5天时的细胞增殖分析
35.图10不同支架浸提液的细胞增殖测试
36.图11不同支架浸提液与mc3t3-e1细胞共培养后的成骨相关基因表达结果
37.图12 fe-mn支架去合金化前后的力学强度对比
具体实施方式
38.本发明实施例中所使用的多孔铁基支架依据文献in vitro and 48 weeks in vivo performances of 3d printed porous fe-30mn biodegradable scaffolds(acta biomaterialia,2021,121,724-740)的方法制备。所用的铁基材料为fe-30mn。
39.实施例1
40.1)多孔fe-30mn支架的表面处理
41.多孔fe-30mn支架依次用无水乙醇，丙酮和去离子水各超声(温度25℃，超声功率120w，超声频率40khz)清洗15min后，放置高温干燥箱60℃烘干1h后用于后续表面改性。
42.2)多孔fe-mn/nacl支架的表面改性
43.将nacl和hcl按比例(na：h＝20:1)称取后放入烧杯内，添加去离子水充分搅拌10分钟配置成酸性氯化钠溶液；在室温下(25℃)使用电化学工作站，以多孔fe-30mn支架为工作电极，以3.33mol kcl溶液中的ag/agcl电极为参比电极，以铂板为对电极。将表面处理后的多孔fe-mn支架置于酸性氯化钠溶液中,通过开路电位(900s)和动电位极化曲线(动电位极化扫描速率为1mvs-1
)的测定，对fe-mn合金电化学性质进行了表征。得到临界电位后选择恒定电压-0.65v、温度25℃、进行30min的恒电位去合金化处理。
44.待电化学反应结束，取出试样，利用去离子水及乙醇轻微反复洗涤试样直至中性，再放于高温干燥箱60℃烘干1h得到fe-mn材料(fe-mn/nacl)。
45.实施例2
46.1)多孔fe-30mn支架的表面处理
47.多孔fe-30mn支架依次用无水乙醇，丙酮和去离子水各超声(温度25℃，超声功率120w，超声频率40khz)清洗15min后，放置高温干燥箱60℃烘干1h后用于后续表面改性。
48.2)多孔fe-mn/hcl支架的表面改性
49.将hcl用去离子水稀释，充分搅拌10分钟配置成1.5％hcl溶液。在室温下(25℃)使用电化学工作站，以多孔fe-30mn支架为工作电极，以3.33m kcl溶液中的ag/agcl电极为参比电极，以铂板为对电极。将表面处理后的多孔fe-mn支架置于1.5％hcl溶液中,通过开路电位(900s)和动电位极化曲线(动电位极化扫描速率为1mvs-1
)的测定，对fe-mn合金电化学性质进行了表征。得到临界电位后选择恒定电压-0.4v、温度25℃进行20min的恒电位去合金化处理。
50.待电化学反应结束，取出试样，利用去离子水及乙醇轻微反复洗涤试样直至中性，再放于高温干燥箱60℃烘干1h得到fe-mn材料(fe-mn/hcl)。
51.实施例1、2以及未经过处理的多孔铁基支架的扫描电镜结果如图1所示，接触角测试如图6所示，压应力测试结果如图12所示。
52.根据图1、6可知，经过去合金化处理后，多孔fe基支架的形貌及微纳结构发生明显改变，且接触角更小，亲水性更好。亲水性的表面有利于细胞的黏附生长。同时，图12压应力的测试结果表明，经过本发明表面改性的铁基支架，其压应力下降较小，即本发明的方法在提高了降解速率的同时，能够保持较好的力学性能，满足体内植入支架的要求。
53.实施例 不同去合金化条件对比
54.1.不同浓度介质溶液
55.1)多孔fe-30mn支架的表面处理
56.多孔fe-30mn支架依次用无水乙醇，丙酮和去离子水各超声(温度25℃，超声功率120w，超声频率40khz)清洗15min后，放置高温干燥箱60℃烘干1h后用于后续表面改性。
57.2)多孔fe-mn/hcl支架的表面改性
58.将hcl用去离子水稀释，充分搅拌10分钟分别配置成浓度为1.25％、2.5％、5％的hcl溶液。在室温下(25℃)使用电化学工作站，以多孔fe-30mn支架为工作电极，以3.33mol kcl溶液中的ag/agcl电极为参比电极，以铂板为对电极。将表面处理后的多孔fe-mn支架分别置于不同浓度hcl溶液中,通过开路电位(900s)和动电位极化曲线(动电位极化扫描速率为1mvs-1
)的测定，对fe-mn合金电化学性质进行了表征。得到临界电位后选择恒定电压-0.4v、温度25℃，进行20min的恒电位去合金化处理。
59.待电化学反应结束，取出试样，利用去离子水及乙醇轻微反复洗涤试样直至中性，再放于高温干燥箱60℃烘干1h得到不同浓度hcl介质溶液处理的fe-mn材料。其扫描电镜结果如图2所示。
60.2.不同去合金化时间
61.1)多孔fe-30mn支架的表面处理
62.多孔fe-30mn支架依次用无水乙醇，丙酮和去离子水各超声(温度25℃，超声功率120w，超声频率40khz)清洗15min后，放置高温干燥箱60℃烘干1h后用于后续表面改性。
63.2)多孔fe-mn/hcl支架的表面改性
64.将hcl用去离子水稀释，充分搅拌10分钟配置三组浓度为1.25％的hcl溶液。在室
温下(25℃)使用电化学工作站，以多孔fe-30mn支架为工作电极，以3.33mol kcl溶液中的ag/agcl电极为参比电极，以铂板为对电极。将表面处理后的多孔fe-mn支架分别置于不同浓度hcl溶液中,通过开路电位(900s)和动电位极化曲线(动电位极化扫描速率为1mvs-1
)的测定，对fe-mn合金电化学性质进行了表征。得到临界电位后选择恒定电压-0.4v、温度25℃，分别进行10min、20min、1h的恒电位去合金化处理。
65.待电化学反应结束，取出试样，利用去离子水及乙醇轻微反复洗涤试样直至中性，再放于高温干燥箱60℃烘干1h得到不同处理时间的fe-mn(hcl)材料。其扫描电镜结果如图3所示。
66.3.不同去合金化电流
67.1)多孔fe-30mn支架的表面处理
68.多孔fe-30mn支架依次用无水乙醇，丙酮和去离子水各超声(温度25℃，超声功率120w，超声频率40khz)清洗15min后，放置高温干燥箱60℃烘干1h后用于后续表面改性。
69.2)多孔fe-mn/hcl支架的表面改性
70.将hcl用去离子水稀释，充分搅拌10分钟配置三组浓度为1.25％的hcl溶液。在室温下(25℃)使用电化学工作站，以多孔fe-30mn支架为工作电极，以3.33mol kcl溶液中的ag/agcl电极为参比电极，以铂板为对电极。将表面处理后的多孔fe-mn支架分别置于不同浓度hcl溶液中,通过开路电位(900s)和动电位极化曲线(动电位极化扫描速率为1mvs-1
)的测定，对fe-mn合金电化学性质进行了表征。得到临界电位后分别选择恒定电压-0.4v,-0.3v,-0.2v，温度25℃，进行20min的恒电位去合金化处理。
71.待电化学反应结束，取出试样，利用去离子水及乙醇轻微反复洗涤试样直至中性，再放于高温干燥箱60℃烘干1h得到不同去合金化电流处理的fe-mn(hcl)材料。其扫描电镜结果如图4所示。
72.4.不同介质溶液种类
73.1)多孔fe-30mn支架的表面处理
74.多孔fe-30mn支架依次用无水乙醇，丙酮和去离子水各超声(温度25℃，超声功率120w，超声频率40khz)清洗15min后，放置高温干燥箱60℃烘干1h后用于后续表面改性。
75.2)多孔fe-mn/柠檬酸支架的表面改性
76.将柠檬酸用去离子水稀释，充分搅拌10分钟分别配置成1.25％、2.5％、5％柠檬酸溶液。在室温下(25℃)使用电化学工作站，以多孔fe-30mn支架为工作电极，以3.33mol kcl溶液中的ag/agcl电极为参比电极，以铂板为对电极。将表面处理后的多孔fe-mn支架置于1.5％柠檬酸溶液中,通过开路电位(900s)和动电位极化曲线(动电位极化扫描速率为1mvs-1
)的测定，对fe-mn合金电化学性质进行了表征。得到临界电位后选择电压-0.6v、温度25℃、进行1h的恒电位去合金化处理。
77.待电化学反应结束，取出试样，利用去离子水及乙醇轻微反复洗涤试样直至中性，再放于高温干燥箱60℃烘干1h得到fe-mn材料(fe-mn/柠檬酸)。其扫描电镜结果如图5所示。
78.根据图2、3、4可以看出，介质溶液浓度、去合金化时间、去合金化的电流强度等不同，其去合金化效果明显不同，当hcl介质溶液浓度大于5％时、去合金化时间为10min和1h时以及去合金化的电压为-0.3v和-0.2v时，得到的支架表面的结构分布不规则，没有形成
均匀的纳米结构，因此只有选择适宜的介质溶液浓度以及去合金化时间和电压，支架表面才能形成分布均匀的片层状纳米结构。
79.从图5与图2对比可以看出，当选择柠檬酸作为介质溶液，虽然能够实现去合金化，但无论如何调节其浓度，都无法形成分布均匀的片层状纳米结构，因此只有选择合适的介质溶液才能形成适宜的纳米结构。
80.实施例 降解速率测定
81.材料设置：对照组：未处理的多孔fe-mn支架组；实验组：实施例1去合金化处理fe-mn支架组(fe-mn/nacl)、实施例2去合金化处理fe-mn支架组(fe-mn/hcl)
82.通过电化学测试支架的耐蚀性，评估材料的降解速率，结果如图7所示，fe-mn/nacl和fe-mn/hcl的支架，其腐蚀电位明显低于对照的纯fe-mn支架，表明去合金化处理后的支架具有较低的电化学稳定性和更高的腐蚀倾向，在人体内更容易降解。
83.实施例 不同支架表面细胞形态观察和增殖实验
84.材料设置：对照组：无支架的空白对照；实验组：未处理的多孔fe-mn支架组、实施例1去合金化处理fe-mn支架组(fe-mn/nacl)
85.采用细胞：小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(mc3t3-e1)
86.培养方式：间接培养，细胞密度：2
×
104个/孔板
87.观察方式：细胞形态观察采用fda/pi双色荧光法对材料表面细胞进行染色后通过激光共聚焦观察；细胞增殖实验通过cck-8法进行测试。
88.从图8染色结果观察可知，mc3t3-e1在所有材料表面都生长良好且呈现了正常的细胞形态。随着培养时间的延长，三组材料表面接种mc3t3-e1的细胞密度都在逐渐增加，表明了去合金化处理fe-mn材料具有优良的细胞相容性。
89.图9为cck-8观察结果，整个共培养期内，两组材料细胞都有增殖趋势，显示细胞生长活力状态良好。但是相对于空白对照，其增殖要小于对照组。可能是因为fe-mn支架降解，产生fe
2+
、mn
2+
，并且局部离子浓度高，对细胞产生影响。
90.实施例 不同支架浸提液的细胞增殖以及成骨基因表达效果测试
91.材料设置：对照组：空白对照；实验组：实施例1去合金化处理fe-mn支架组(fe-mn/nacl)、实施例2去合金化处理fe-mn支架组(fe-mn/hcl)
92.采用细胞：小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(mc3t3-e1)
93.按照gb/t16886医疗器械生物学评价系列标准制备支架浸提液后，将其与mc3t3-e1细胞进行共培养。
94.如图10所示，尽管hcl组和nacl组支架具有不同的降解速率，但培养第5天后，两组材料浸提液的细胞增殖密度已与空白组无显著差异，说明本发明制备的表面改性的多孔铁基支架具有良好的生物相容性。
95.如图11所示，从不同支架浸提液与mc3t3-e1细胞共培养后的成骨相关基因表达结果可以看出，通过去合金化处理调控支架表面微纳形貌和结构后，能够促进成骨类细胞在其表面的增殖和分化。

技术特征：
1.一种表面改性的多孔铁基支架的制备方法，其特征在于，包括以下过程：在25℃-45℃，临界电压-0.85v～-0.2v范围内，对多孔铁基支架进行20min-120min的恒电位去合金化处理；其中，电解液为酸性氯化钠溶液或稀盐酸溶液。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述酸性氯化钠溶液中na：h＝10:1-20:1，稀盐酸溶液浓度为0.5％-5％。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述酸性氯化钠溶液中na：h＝20:1；稀盐酸溶液浓度为1.5％。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述多孔fe基支架为fe-mn合金、fe-mn-si合金中的任一种。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述多孔fe基支架为fe-30mn。6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述电解质溶液为稀盐酸溶液时，选择恒定电压-0.4v、温度25℃进行20min的恒电位去合金化处理。7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述电解质溶液为酸性氯化钠溶液时，选择恒定电压-0.65v、温度25℃、进行30min的恒电位去合金化处理。8.一种表面改性的多孔铁基支架，其特征在于，采用如权利要求1-7任一所述方法制备。9.权利要求8所述的表面改性的多孔铁基支架在骨修复材料中的应用。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述骨修复材料为用于骨缺损修复的辅助内植物。

技术总结
本发明涉及生物医学材料领域，特别涉及一种表面改性的多孔铁基支架及其制备方法和应用。本发明针对现有的多孔Fe基支架进行表面修饰改性，调控支架表面形貌结构，在不破坏其力学性能的前提下，降解速率更快，并且通过实验验证，其具有较好的生物相容性，能够促进成骨类细胞在其表面的增殖和分化，进而实现支架在体内降解速率和骨再生速率完美匹配。体内降解速率和骨再生速率完美匹配。体内降解速率和骨再生速率完美匹配。


技术研发人员：袁波 陈智坤 聂涌 彭华备 朱向东 张兴栋
受保护的技术使用者：四川大学
技术研发日：2021.12.31
技术公布日：2023/7/13