白血病相关标志物以及应用

s,honma t,tanaka a,shirouzu m,mikuni j,handa n et al:a pyrrolo-pyrimidine derivative targets human primary aml stem cells in vivo.sci transl med 2013,5(181)；pabst c,krosl j,fares i,boucher g,ruel r,marinier a,lemieux s,hebert j,sauvageau g:identification of small molecules that support human leukemia stem cell activity ex vivo.nat methods 2014,11(4):436-442)。1994年，lapido等率先从aml患者骨髓细胞中分离出cd34
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cd38-lscs亚群，并证实此亚群具有hscs样强大的自我更新和增殖能力(lapidot t,sirard c,vormoor j,murdoch b,hoang t,cacerescortes j,minden m,paterson b,caligiuri ma,dick je:a cell initiating human acute myeloid-leukemia after transplantation into scid mice.nature 1994,367(6464):645-648)。该亚群96％以上的细胞处于g0期，能逃逸化学药物的杀伤作用，导致耐药和易复发(ishikawa f,yoshida s,saito y,hijikata a,kitamura h,tanaka s,nakamura r,tanaka t,tomiyama h,saito n et al:chemotherapy-resistant human aml stem cells home to and engraft within the bone-marrow endosteal region.nat biotechnol 2007,25(11):1315-1321)。2014年，john e.dick等发现25％的aml病人具有dnmt3a基因突变，而该基因突变导致pre-lscs形成，其功能与正常hscs相似，但却异常生长(shlush li,zandi s,mitchell a,chen wc,brandwein jm,gupta v,kennedy ja,schimmer ad,schuh ac,yee kw et al:identification of pre-leukaemic haematopoietic stem cells in acute leukaemia.nature 2014,508(7496):420-420)。这些存在于骨髓的pre-lscs对化疗等疗法不敏感，可能最终获得其他一些改变而导致aml的复发。上述研究表明，lscs是aml发病、发展和复发的主要原因。因此，探索和发现有效抑制lscs活性的新分子靶点从而开发相应的治疗药物，有望从根本上达到控制白血病的最终目的。
5.大量研究表明，细胞表面分子在lscs的活性和aml的发生、发展中扮演着重要的角色(zheng jk,umikawa m,cui ch,li jy,chen xl,zhang cz,huynh h,kang xl,silvany r,wan x et al:inhibitory receptors bind angptls and support blood stem cells and leukaemia development.nature 2012,488(7413):684-684；majeti r,chao mp,alizadeh aa,pang ww,jaiswal s,gibbs kd,van rooijen n,weissman il:cd47 is an adverse prognostic factor and therapeutic antibody target on human acute myeloid leukemia stem cells.cell 2009,138(2):286-299；van rhenen a,van dongen gams,kelder a,rombouts ej,feller n,moshaver b,stigter-van walsumm,zweegman s,ossenkoppele gj,schuurhuis gj:the novel aml stem cell-associated antigen cll-1aids in discrimination between normal and leukemic stem cells.blood 2007,110(7):2659-2666；kikushige y,shima t,takayanagi s,urata s,miyamoto t,iwasaki h,takenaka k,teshima t,tanaka t,inagaki y et al:tim-3is a promising target to selectively kill acute myeloid leukemia stem cells.cell stem cell 2010,7(6):708-717；kang xl,lu zg,cui ch,deng m,fan yq,dong bj,han x,xie fc,tyner jw,coligan je et al:the itim-containing receptor lair1 is essential for acute myeloid leukaemia development.nat cell biol 2015,17(5):665-u286)，而在lscs中特异性表达的细胞表面分子可以作为靶向治疗aml的靶点。以细胞表面分子作为靶点的aml靶向治疗研究具有十分重要的现实临床意义：一方面，利用lscs中特异性表达的细胞表面分
子可以进行aml的病程监控和预后判断；另一方面，以lscs中特异性表达的细胞表面分子作为靶点可以开发更加有效、甚至靶向性治愈aml的新治疗方法。近年来，随着人们对lscs研究深入，发现cd33(hauswirth aw,florian s,printz d,sotlar k,krauth mt,fritsch g,schernthaner gh,wacheck v,selzer e,sperr wr et al:expression of the target receptor cd33 in cd34(+)/cd38(-)/cd123(+)aml stem cells.eur j clin invest 2007,37(1):73-82)、cd47(majeti r,chao mp,alizadeh aa,pang ww,jaiswal s,gibbs kd,van rooijen n,weissman il:cd47 is an adverse prognostic factor and therapeutic antibody target on human acute myeloid leukemia stem cells.cell 2009,138(2):286-299)、cd96(hosen n,park cy,tatsumi n,oji y,sugiyama h,gramatzki m,krensky am,weissman il:cd96 is a leukemic stem cell-specific marker in human acute myeloid leukemia.p natl acad sci usa 2007,104(26):11008-11013)、cd123(florian s,sonneck k,hauswirth aw,krauth mt,schernthaner gh,sperr wr,valent p:detection of molecular targets on the surface of cd34+/cd38-stem cells in various myeloid malignancies.leukemia lymphoma 2006,47(2):207-222；hwang k,park cj,jang s,chi hs,kimdy,lee jh,lee jh,lee kh,im hj,seo jj:flow cytometric quantification and immunophenotyping of leukemic stem cells in acute myeloid leukemia.ann hematol 2012,91(10):1541-1546；abdel-wahab o,mullally a,hedvat c,garcia-manero g,patel j,wadleigh m,malinge s,yao jj,kilpivaara o,bhat r et al:genetic characterization of tet1,tet2,and tet3 alterations in myeloid malignancies.blood 2009,114(1):144-147)、tim-3(kikushige y,shima t,takayanagi s,urata s,miyamoto t,iwasaki h,takenaka k,teshima t,tanaka t,inagaki y et al:tim-3is a promising target to selectively kill acute myeloid leukemia stem cells.cell stem cell 2010,7(6):708-717)和cll-1(van rhenen a,van dongen gams,kelder a,rombouts ej,feller n,moshaver b,stigter-van walsum m,zweegman s,ossenkoppele gj,schuurhuis gj:the novel aml stem cell-associated antigen cll-1aids in discrimination between normal and leukemic stem cells.blood 2007,110(7):2659-2666)等细胞表面分子的差异表达可以区分lscs与hscs。然而，上述细胞表面分子在lscs中或弱表达或部分表达，或者在hscs中也部分表达，使其作为治疗靶点存在一定局限性。因此，需要进一步探索更加有效的细胞表面分子作为新的靶点分子。
6.allergin-1，别称milr1，是一种属于免疫球蛋白样受体超家族的免疫抑制性受体，在人和小鼠主要表达于巨噬细胞、中性粒细胞、肥大细胞等髓系细胞中。allergin-1参与体内多种病理生理过程(hitomi k,tahara-hanaoka s,someya s,fujiki a,tada h,sugiyama t,shibayama s,shibuya k,shibuya a:an immunoglobulin-like receptor,allergin-1,inhibits immunoglobulin e-mediated immediate hypersensitivity reactions.nat immunol.2010,11(7):601-607)，然而，allergin-1在lscs和aml细胞中的表达特性，allergin-1在aml发生、发展中的生物学作用，以及以allergin-1作为生物标志物或分子靶点探讨aml的病程监控、预后判断、靶向治疗和免疫治疗可行性的研究，尚未见报道。
7.因此，急需深入研究allergin-1作为新的生物标志物对于白血病的生物学效应，以获得用于高特异性诊断白血病的方法和体系以及相关的靶向治疗和免疫治疗的靶点、方法和药物。


技术实现要素：

8.针对以上技术问题，我们发现：allergin-1在正常hscs中不表达，而在lscs和aml单核细胞中特异性异常高表达；在m4和m5亚型aml患者中allergin-1的表达水平与患者的生存率呈负相关，尤其在生存率极低的m5亚型中特异性异常高表达；allergin-1
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lscs自我更新能力显著高于allergin-1-lscs；allergin-1
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aml细胞晚期髓细胞晚期分化标志cd11b的表达水平显著底于allergin-1-aml细胞；ifn-γ促进aml细胞的增殖及allergin-1的表达水平；敲降allergin-1显著抑制aml细胞增殖能力、显著促进aml细胞cd11b的表达水平、显著抑制aml细胞的体内定植(或体内生长)；在体外，激发allergin-1抗体介导的效应细胞对aml细胞的细胞毒作用；在体内，allergin-1抗体可介导效应细胞消除aml的根源性lscs和aml单核细胞；allergin-1-aml细胞促进正常人外周血单核细胞来源cd3-cd56
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nk细胞的cd25(活化nk细胞标志)的表达水平，并促进cd3-cd56
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nk细胞的细胞毒作用。基于此，allergin-1作为生物标志物用于lscs的鉴别、白血病(尤其是aml)的诊断、病程监控、预后判断，是用于白血病尤其是aml靶向治疗和/或免疫治疗的靶标。
9.在本发明的一个方面，本发明涉及通过检测受试者或来自受试者的样本中的生物标志物allergin-1的表达或活性来鉴别lscs的方法，其中allergin-1在lscs中特异性异常高表达。
10.在本发明的一个方面，本发明涉及通过检测受试者或来自受试者的样本中的生物标志物allergin-1的表达或活性来诊断、病程监控和预后判断白血病(尤其是aml)或用于确定发生白血病(尤其是aml)的风险或用于确定白血病(尤其是aml)严重程度的的方法，其中在m4和m5亚型aml患者中allergin-1的表达水平与患者的生存率呈负相关，在lscs和aml单核细胞中allergin-1异常高表达。在一些实施方案中，allergin-1在aml患者中高表达，尤其在m5亚型中特异性异常高表达。
11.在本发明的一个方面，本发明涉及一种鉴别lscs的方法，所述方法包括通过检测受试者或来自受试者的样本中的生物标志物allergin-1的表达或活性来鉴别lscs；
12.任选地，通过检测所述样本中造血干细胞中的所述生物标志物allergin-1的表达或活性；
13.任选地，allergin-1在造血干细胞中的表达水平或活性显著高于正常造血干细胞中allergin-1的表达水平或活性，是造血干细胞为lscs的指示。
14.在上述方法中，所述allergin-1在造血干细胞中的表达水平或活性是正常造血干细胞中allergin-1的表达水平或活性的至少约3倍以上，是造血干细胞为lscs的指示，优选的，所述allergin-1在造血干细胞中的表达水平或活性是正常造血干细胞中allergin-1的表达水平或活性的约3倍-约100倍，更优选地，为约10-90倍、为约20-80倍、为约30-70倍，例如40倍、45倍、50倍、55倍、60倍。
15.在本发明的一个方面，本发明涉及检测样本中allergin-1表达水平或活性的试剂在制备鉴别lscs的产品中的应用。
id no：12、13、14、15、16或17所示的序列。
28.更优选的，所述抑制剂/或拮抗剂为特异性与allergin-1结合的抗体；优选的，例如，所述特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、中和抗体、抗原结合片段、偶联allergin-1抗体。
29.在本发明的一个方面，本发明提供了一种白血病(尤其是aml)的诊断、病程监控和预后判断的产品，所述产品包括检测allergin-1表达水平的芯片、制剂或检测试剂盒。进一步，所述试剂盒包括至少一对特异性扩增allergin-1基因的引物；优选的，所述引物具有seq id no：18、19、20、21、22或23所示的序列。
30.在本发明的一个方面，本发明提供了一种生物标志物组合，其包括allergin-1、cd34和cd38。
31.在本发明的一个方面，本发明提供了生物标志物组合allergin-1、cd34和cd38在鉴定lsc中应用。根据本发明的具体实施例，所述生物标志物中allergin-1阳性、cd34阳性和cd38阴性是lscs的指示。
32.本发明的一个方面，提供了具备引起免疫效应细胞对aml细胞毒性反应的、或对aml细胞功能性表达降低的抑制剂/拮抗剂如allergin-1单克隆抗体、allergin-1中和抗体、抗肿瘤药偶联allergin-1抗体、抗原结合片段，小分子化合物。
33.在本发明的一个方面，本发明提供了一种提高nk细胞活性或免疫治疗效果的方法，向受试者给予有效量的allergin-1表达或活性的抑制剂或拮抗剂。
34.在本发明的一个方面，本发明提供了生物标志物allergin-1在筛选治疗白血病(尤其是aml)的候选药物的方法。优选的，所述方法包括：用待筛选物质处理表达或含有allergin-1基因的体系；和检测所述体系中allergin-1基因的表达水平；其中，若所述待筛选的物质可以降低allergin-1基因的表达水平，则表明该待筛选物质是治疗白血病(尤其是aml)的候选药物。更优选的，上文所述的体系包括(但不限于)：细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系；所述候选药物包括(但不限于)：针对allergin-1基因或其上游或下游基因设计的干扰分子、核酸抑制物、小分子化合物。
附图说明
35.图1是检测allergin-1在aml患者中的表达情况图，其中：
36.图1a表明allergin-1的表达水平与aml患者的生存率呈负相关；
37.图1b表明allergin-1在m5亚型aml患者中异常高表达；
38.图2是检测allergin-1在健康脐带血细胞(hscs)和原发aml患者的lscs中的表达情况图，其中：
39.图2a和2c表明allergin-1在健康人脐带血cd34
+
cd38-，cd34
+
cd38
+
和cd34-细胞中的表达；
40.图2b和2d表明allergin-1在原发aml患者骨髓cd34
+
cd38-，cd34
+
cd38
+
和cd34-细胞中的表达；
41.图2e表明allergin-1在健康人和原发aml患者单核细胞中的表达；
42.图3是检测allergin-1阳性的lscs的自我更新能力的情况图；
43.图4是检测allergin-1的表达与aml细胞的增殖和分化相关性的情况图，其中：
44.图4a和图4b表明allergin-1阳性aml细胞的增殖能力显著高于allergin-1阴性aml细胞；
45.图4c和图4d表明allergin-1阳性aml细胞的cd11b表达水平显著低于allergin-1阴性aml细胞；
46.图5是检测shrna对allergin-1表达的干扰的效果图，其中：
47.图5a和图5b通过western blot法检测thp-1(a)和u937(b)细胞敲降效率；
48.图5c和图5d表明敲降allergin-1抑制thp-1(c)和u937(d)细胞的增殖；
49.图5e和图5f表明敲降allergin-1抑制thp-1(e)和u937(f)细胞的cd11b表达水平；
50.图5g和图5h通过瑞氏-吉姆萨染色检测敲降allergin-1对thp-1(g)和u937(h)细胞形态的影响；
51.图6是检测ifn-γ对aml细胞的allergin-1表达水平和增殖的影响的情况图，其中：
52.图6a和图6b表明ifn-γ促进aml细胞的增殖(图6a)和allergin-1的表达水平(图6b)；
53.图6c表明ifn-γ预处理的allergin-1
+
aml细胞的增殖显著高于对照组allergin-1-aml细胞；
54.图7是测定敲降allergin-1抑制aml细胞在小鼠体内的定植的情况图，其中：
55.图7a表明allergin-1敲降的thp-1细胞移植的小鼠肝脏及脾脏的重量显著小于对照组；
56.图7b表明allergin-1敲降的thp-1细胞在小鼠肝脏和脾脏细胞中的定植能力显著低于对照组细胞；
57.图8是检测allergin-1抗体依赖效应细胞对aml细胞的细胞毒作用(adcc)的情况图，其中：
58.左图通过流式细胞仪检测allergin-1在thp-1细胞的表达；右图表明allergin-1抗体介导的外周血单核细胞(pbmcs)对thp-1细胞的细胞毒作用显著高于对照组igg1抗体；
59.图9是检测allergin-1抗体在nod/scid小鼠体内消除原发aml患者骨髓细胞的效果图，其中，
60.图9a是allergin-1抗体处理原发aml患者骨髓细胞移植的人鼠异种移植模型小鼠示意图；
61.图9b表明allergin-1抗体处理组小鼠肝脏细胞中人cd45
+
细胞所占比例显著少于对照组igg1抗体处理组；
62.图9c-图9d表明allergin-1抗体处理组小鼠骨髓细胞中：人cd45
+
细胞(图d左上)，人cd45
+
细胞中cd34
+
细胞(图c上，图d右上)，人cd45
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细胞中的cd34
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cd38-细胞(图c下，图d左下)和人cd45
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细胞中allergin-1
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细胞(图c中，图d右下)所占比率显著少于对照组igg1抗体处理组；
63.图10是检测allergin-1抗体对健康人脐带血cd34阳性细胞在nod/scid小鼠体内造血重建能力的影响图，其中：
64.图10a是allergin-1抗体处理cd34
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健康人脐带血细胞移植的人鼠异种移植模型小鼠示意图；
65.图10b-图10d表明，与对照组igg1抗体处理组相比allergin-1抗体处理组小鼠骨髓细胞中：人cd45
+
细胞(图10b)，人cd45
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细胞中cd19
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或cd33
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细胞(图10c)所占比例无显著差异；allergin-1抗体处理组小鼠骨髓的人cd45
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细胞中allergin-1
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cd33
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细胞所占比率明显减少于对照组igg1抗体处理组(图10d)；
66.图11是检测allergin-1抑制健康人外周血单核细胞来源nk细胞的活性及细胞毒作用的效果图；
67.图11a-d表明，与allergin-1-thp-1细胞共培养的cd3-cd56
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nk细胞的cd25的表达水平(图11a-c)及细胞毒作用(图11d)显著高于与allergin-1
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thp-1细胞共培养的cd3-cd56
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nk细胞；
68.图12为allergin-1基因的序列；
69.图13是本发明实施例所使用的原发aml患者骨髓样本信息；
70.图14是以allergin-1基因为靶点的shrna序列；
71.图15是扩增allergin-1基因的引物序列。
具体实施方式
72.定义
73.除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解相同的含义，但如有冲突，则以本说明书中的定义为准。
74.如说明书和权利要求书中所用，单数形式“一”、“一个”和“该(所述)”包括复数形式，除非上下文另有明确说明。
75.如无特殊说明，本说明书中的百分比(％)均为重量百分比(重量％)。
76.在说明书和权利要求书中使用的涉及组分量、工艺条件等的所有数值或表述在所有情形中均应理解被“约”修饰。术语“约”当指数量或数值范围时，意思是所指数量或者数值范围是试验变异性内(或统计学实验误差内)的近似值，因此该数量或者数值范围可以在所述数量或数值范围的例如+5之间变化。
77.涉及相同组分或性质的所有范围均包括端点，该端点可独立地组合。由于这些范围是连续的，因此它们包括在最小值与最大值之间的每一数值。还应理解的是，本技术引用的任何数值范围预期包括该范围内的所有子范围。
78.当本发明针对物理性质例如分子量或者针对化学性质以范围定义时，应包括范围的所有组合和亚组合以及其内的具体实施方式。术语“包含”(以及相关术语例如“含有”或“含”或“具有”或“包括”)包括这样一些实施方式，该实施方式为例如，物质、组合物、方法或过程等的任何组合，其“由所描述的特征组成”或者“基本上由所描述的特征组成”。
79.本说明书和权利要求中使用的“和/或”，应当理解为相关联的组分“二者择一或二者”，即组分在一些情况中联合存在而在另一些情况中分开存在。多个用“和/或”列出的组分应当以同样的方式理解，即“一种或多种”相关联的组分。除了“和/或”从句具体确定的组分，其它组分可任选地存在，无论与那些具体确定的组分相关还是不相关。因此，作为非限制性实例，提及“a和/或b”，当用于连接开放式结尾的文字如“包括”，在一个实施方案中，可仅指a(任选地包括除b外的组分)；在另一实施方案，可仅指b(任选地包括除a外的组分)；在再一实施方案中，指a和b(任选的包括其它组分)等。
80.应当理解，除非明确地相反指示，否则在本文要求保护的包括多于一步或一个行为的任何方法中，该方法的步骤和行为的顺序不必限制于所叙及的方法的步骤和行为的顺序。
81.本发明使用的缩写具有在化学、生物学和药学领域的通常含义。
82.术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以提供希望的生物结果的试剂的量。该结果可为疾病的征兆、症状或原因的减少和/或减轻，或任何其它希望的生物系统的变化。例如，治疗用途的“有效量”是指包含作为本发明活性成分的化合物的临床上显著减少疾病所需要的组合物的量。在任何个案中，适当的“有效”量可由本领域普通技术人员使用常规实验来测定。因此，表达方式“有效量”通常是指活性物质具有治疗效果时的量。
83.本技术使用的术语“治疗(treat)”或“处置(treatment)”与术语“预防(prevent)”同义，意在表示推迟疾病发展、防止疾病发展和/或降低将会发展或预期会发展的所述症状的严重性。因此，这些术语包括改善已有的疾病症状、预防另外的症状、改善或预防症状的潜在的代谢原因、抑制障碍或疾病，例如，阻止障碍或疾病的发展、减轻障碍或疾病、使障碍或疾病退行、减轻由疾病或障碍导致的病症，或使疾病或障碍的症状停止。
[0084]“疾病”、“障碍”和“病症”在本文中可互换地使用。
[0085]
除非另作说明，否则，本文使用的术语“治疗”包括受试者患有具体疾病、障碍或病症时所发生的作用，它降低疾病、障碍或病症的严重程度，或延迟或减缓疾病、障碍或病症的发展(“治疗性治疗”)，还包括受试者开始患有具体疾病、障碍或病症之前发生的作用(“预防性治疗”)。
[0086]
术语“药用的”、“药理上可接受的”或“药学上可接受的”在本文中定义为那些在合理医学判断范围内适合接触个体(例如哺乳动物或人)的组织而不会产生过量毒性、刺激过敏性反应和其他并发症问题且具有与之相称的合理的效益/风险比的化合物、材料、试剂、组合物和/或剂型。
[0087]“施用”或“给药”在其应用于动物、人类、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与受试者、细胞、组织、器官或生物流体的接触。
[0088]
本文中所使用的术语“共同施用”或“组合施用”定义为涵盖向单个患者施用所选治疗剂，且意指包括药物不一定通过相同途径施用或同时施用的治疗方案。
[0089]
本技术使用的术语“受试者”包括哺乳动物和非哺乳动物。哺乳动物的实例包括但不限于哺乳动物纲的任何成员：人、非人灵长类如黑猩猩及其它猿类和猴类；农场动物如牛、马、绵羊、山羊、猪；家养动物如兔、狗和猫；实验室动物，包括啮齿类动物如大鼠、小鼠和豚鼠等。非哺乳动物的实例包括但不限于鸟、鱼等。在本发明一个实施方案中，哺乳动物为人。
[0090]
优选的，所述“受试者”包括人(即，任何年龄组的男性或女性，例如，儿科受试者(例如，婴儿、儿童、青少年)或成人受试者(例如，年轻的成人、中年的成人或年长的成人)和/或非人的动物，例如，哺乳动物，例如，灵长类(例如，食蟹猴、恒河猴)、牛、猪、马、绵羊、山羊、啮齿动物、猫和/或狗。在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，受试者是非人动物。本文可互换使用术语“人”、“患者”和“受试者”。
[0091]
术语“allergin-1”是一种属于免疫球蛋白样受体超家族的免疫抑制性受体，又称
为milr1，其与程序性死亡分子1(pd-1)同属于免疫检查点分子。allergin-1与pd-1有许多相似的特征，如表达模式、免疫受体酪氨酸抑制基序(itim)模式、可与酪氨酸磷酸酶shp-1结合和可通过磷酸化及去磷酸化作用来调节细胞的信号传导等。shp-1及其下游信号通路的活化对肿瘤的发展和维持肿瘤干细胞的特性具有重要作用。
[0092]
milr1是位于人17号染色体上。本发明中的milr1包括野生型、突变型或其片段。代表性的milr1基因序列如目前国际公共核酸数据库genebank中milr1基因(nc_000017.11)所示。milr1基因序列也可如下文seq id no:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或11所示。
[0093]
》xr_002957990.1milr1[生物体＝智人][基因id＝284021][转录物＝x4]
[0094]
ttggtcgaacaaaccagtattatgcaaacctcatccaaaccctctgatttccttaacttggctaagaaaaagaggaagttctccgagttactcaccactgtggttctactatgccttctgaccccgtcttggacttcaactgggagaatgtggagccatttgaacaggctcctcttctggagcatattttcttctgtcacttgtagaaaagctgtattggattgtgaggcaatgaaaacaaatgaattcccttctccatgtttggactcaaagactaaggtggttatgaagggtcaaaatgtatctatgttttgttcccataagaacaaatcactgcagatcacctattcattgtttcgacgtaagacacacctgggaacccaggatggaaaaggtgaacctgcgatttttaacctaagcatcacagaagcccatgaatcaggcccctacaaatgcaaagcccaagttaccagctgttcaaaatacagtcgtgacttcagcttcacgattgtcgacccggtgacttccccagtgctgaacattatggtcattcaaacagaaacagaccgacatataacattacattgcctctcagtcaatggctcgctgcccatcaattacactttctttgaaaaccatgttgccatatcaccagctatttccaagtatgacagggagcctgctgaatttaacttaaccaagaagaatcctggagaagaggaagagtataggtgtgaagctaaaaacagattgcctaactatgcaacatacagtcaccctgtcaccatgccctcaacaggcggagacagctgtcctttctgtctgaagctactacttccagggttattactgttgctggtggtgataatcctaattctggctttttgggtactgcccaaatacaaaacaagaaaagctatgagaaataatgtgcccagggaccgtggagacacagccatggaagttggaatctatgcaaatatccttgaaaaacaagcaaaggaggaatctgtgccagaagtgggatccaggccgtgtgtttccacagcccaagatgaggccaaacactcccaggagctacagtatgccacccccgtgttccaggaggtggcaccaagagagcaagaagcctgtgattcttataaatctggatatgtctattctgaactcaacttctgaaatttacagaaacaaactacatctcaggtgagtactaaaacttgatcatcaattacagagccattttgactaatatggaaagttcatggagggccagttgcaatccccaagatccagcaagactgcctcgcctttccacccgacacctgttttgaagcatgaaatcgtgaagcataccgtgaagaaggttctcccgtagtttcccagaagtttttaatacgttctcaagaaatgctacta(seq id no：1)
[0095]
》xr_002957989.1milr1[生物体＝智人][基因id＝284021][转录物＝x2]
[0096]
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[0110]
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[0115]
术语“aml”亚型：1976年，法，美，英(fab)白血病分类协作组提出的急性白血病分型标准已作为该病诊断分型的基本方法，以后又作了多次补充和修改，aml的fab分型是目
前最常用的类型。aml可分成8种类型，分别为m0(急性髓系白血病微分化型)，m1(急性粒细胞白血病未分化型)，m2(急性粒细胞性白血病部分分化型)，m3(急性早幼粒细胞白血病)，m4(急性粒单核细胞白血病)，m5(急性单核细胞白血病)，m6(红白血病)，m7(急性巨核细胞白血病)。
[0116]
aml单核细胞：aml患者骨髓液中分离的单核细胞(mononuclear cells)为aml单核细胞。例如，可利用ficoll-paque分离液，行骨髓穿刺术抽取aml患者骨髓液进行分离单核细胞。
[0117]
正常单核细胞：正常健康机体血液中的单核细胞为正常单核细胞。例如，可利用ficoll-paque分离液在足月健康新生儿脐带血中分离获得。
[0118]
白血病干细胞(leukemia stem cells，lscs)又称为白血病起始细胞(leukemia initiating cells，lics)是一群具有自我更新能力，并能产生异质性白血病细胞群体的白血病细胞。1994年，tsvee lapidot等率先从aml患者骨髓细胞中分离出cd34
+
cd38-lics亚群，并发现该亚群具有hscs样强大的自我更新能力，并可在免疫缺陷小鼠体内重建白血病。2007年，fumihiko ishikawa等发现lscs能逃逸化学药物的杀伤作用，导致耐药和易复发。
[0119]
术语“抑制剂”是指能够抑制或下调物质表达或活性的调节剂。例如，可为能够特异性敲降或沉默allergin-1的sirna或能够特异性结合和抑制allergin-1活性的抗体。
[0120]
术语“拮抗剂”是指能够拮抗allergin-1活性，降低或抑制allergin-1与allergin-1配体相互作用的调节剂。例如，可为allergin-1配体的竞争结合剂。
[0121]“抗体”是能够经由至少一个位于免疫球蛋白分子的可变区中的抗原识别位点特异性结合至靶标诸如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽的免疫球蛋白分子。如本文中所使用，该术语不仅涵盖完整多克隆或单克隆抗体，而且涵盖其片段(诸如fab、fab’、f(ab’)2、fv)、单链(scfv)和结构域抗体(包括例如鲨鱼和骆驼抗体)以及包含抗体的融合蛋白，和包含抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其他修饰的构型。抗体包括任何类别的抗体，诸如igg、iga或igm(或其亚类)，且该抗体不必为任何特定类别。根据其重链的恒定区的抗体氨基酸序列，免疫球蛋白可被归为不同类别。存在五种主要类别的免疫球蛋白：iga、igd、ige、igg和igm，且这些中的几种可进一步分成亚类(同种型)，例如iggl、igg2、igg3、igg4、igal和iga2。对应于不同种类的免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是众所周知的。
[0122]
如本文中所使用，术语“抗体”包括完整抗体和任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或其单链。“抗体”是指包含至少两条重链(h)和两条轻链(l)并通过二硫键相互连接的，或其抗原结合部分的蛋白质。每条重链由重链可变区(本文缩写为vh)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域，ch1、ch2和ch3组成。每条轻链由轻链可变区(本文缩写为vl)和轻链恒定区的。轻链恒定区由一个结构域cl组成。vh和vl区可以进一步细分成高变区，称为互补决定区(cdr)，与更保守的称为构架区(fr)的区域散布。每个vh和vl由三个cdr和四个fr组成，从氨基末端到羧基末端以下面的顺序排列：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。
[0123]
术语“抗体”，在本技术中所用的是指免疫球蛋白或其片段或它们的衍生物，并且包括其包含的抗原结合位点的任何多肽，而不管其是否是在体外或体内产生。该术语包括，但不限于，多克隆、单克隆、单特异性的、多特异性的、非特异性的、人源化、单链的、嵌合的、
合成的、重组的、杂合的、突变的、嫁接的抗体。术语“抗体”还包括抗体片段例如fab、f(ab')2、fv、scfv、fd、dab和其它保留抗原结合功能的抗体片段，即，能够与pd-1的特异性结合。通常情况下，这样的片段将包括抗原结合片段。
[0124]
如本文所使用的术语抗体的“抗原结合片段”或“抗原结合部分”是指保留与给定抗原特异性结合的能力的完整抗体的一个或多个片段。抗体的抗原结合功能可由完整抗体的片段执行。涵盖在术语抗体的“抗原结合片段”内的结合片段的实例包括fab；fab’；f(ab’)2；由vh结构域和ch1结构域组成的fd片段；由抗体的单臂的vl结构域和vh结构域组成的fv片段；单结构域抗体(dab)片段(ward等人，nature 341:544-546,1989)和分离的互补决定区(cdr)。术语“抗原结合片段”、“抗原结合结构域”和“结合片段”是指一种抗体分子，其包含负责具体的抗体和抗原之间的结合的氨基酸。例如，其中的抗原是大的，抗原结合片段只结合抗原的一部分。即抗原分子中负责与抗原结合片段特异性相互作用的部分被称为“表位”或“抗原决定簇”。
[0125]
抗原结合片段通常包括抗体轻链可变区(vl)和抗体重链可变区(vh)，然而，它不一定必须包括两者。例如，一个所谓的fd抗体片段仅由vh结构域组成，但仍保留了完整抗体的一些抗原结合功能。
[0126]
术语“同源性”是指当两个多肽序列最佳比对时在两个序列之间的序列相似性。当两个比较的序列的两者中的位置由相同氨基酸单体亚单位占据时，例如如果两个不同ab的轻链cdr中的位置由丙氨酸占据时，贝两个ab在该位置处同源。同源性百分比是由两个序列共有的同源性位置的数目除以所比较的位置的总数目x 100。例如，如果当序列最佳比对时，两个序列中的10个位置中的8个位置匹配或同源，则该两个序列是80％同源的。通常，在两个序列被比对以产生最大同源性百分比时进行比较。例如，比较可通过blast算法进行，其中该算法的参数被选择以在各参考序列的完整长度上的各序列之间产生最大匹配。
[0127]
在本发明中，术语“芯片”、“微阵列”、“阵列”可以等同替代，包括但不限于：dna微阵列(例如，cdna微阵列和寡核苷酸微阵列)、蛋白质微阵列、组织微阵列、转染或细胞微阵列、化学化合物微阵列和抗体微阵列。通常称为基因芯片、dna芯片或生物芯片的dna微阵列是微观dna点的集合，这些点连接到固体表面(例如，玻璃、塑料或硅芯片)上，形成用于对数千种基因同时进行表达谱分析或表达水平监测的阵列。固定的dna片段称为探针，其数千个可用于单个dna微阵列中。微阵列可用于通过比较疾病和正常细胞中的基因表达而识别疾病基因或转录本(例如，ncrna)。微阵列可使用多种技术加以制造，包括但不限于：用细尖针印刷到载玻片上、使用预制的掩模进行光刻、使用动态微镜器件进行光刻、喷墨印刷或微电极阵列上的电化学方法。
[0128]
如在本文中使用的，术语“生物标志物”是指能够特异性标记细胞或指示疾病状态的物质。在旨在特异性标记细胞的本发明的上下文中，生物标志物组合allergin-1、cd34和cd38可作为lsc特异性标记。在旨在诊断白血病的本发明的上下文中，“生物标志物”是指指示诊断、病程监控和预后判断白血病(尤其是aml)的物质。“生物标志物”包括多肽和糖蛋白，与正常的健康受试者相比，allergin-1在aml患者中特异性异常高表达。
[0129]
在本发明中，术语“样本”、“样品”或“生物样品”可以等同替代，包括但不限于：多种从个体得到的样品类型，并且可用于诊断或监测测试。生物流体样品涵盖了血液、脑脊液(csf)、尿和其它生物来源的液体样品。例如，本发明所述的生物样品可为血液。如果需要，
样品可预先进行处理，例如浓缩或分离。
[0130]
应当理解本文采用的术语用于描述具体实施方案的目的，而不意在进行限制。此外，在本发明的实践或试验中可以使用与本文描述的那些类似或等价的任何方法、装置和材料，下文描述了优选的方法、装置和材料。
[0131]
疾病的诊断、病程监控和/或预后判断的方法、应用和产品
[0132]
方法和/或应用
[0133]
如前所述，本发明提供了通过检测或定量allergin-1表达或活性来诊断、监测和评价白血病诸如aml的方法。在本发明的一个方面，本发明涉及通过检测受试者或来自受试者的样本中的生物标志物allergin-1的表达或活性来鉴别lscs的方法，其中allergin-1在lscs中特异性异常高表达。
[0134]
在本发明的一个方面，本发明涉及通过检测受试者或来自受试者的样本中的生物标志物allergin-1的表达或活性来诊断、病程监控和预后判断白血病(尤其是aml)或用于确定发生白血病(尤其是aml)的风险或用于确定白血病(尤其是aml)严重程度的方法，其中allergin-1在aml患者中特异性异常高表达。在一些实施例中，所述受试者造血干细胞中allergin-1的的表达水平或活性显著高于正常造血干细胞中allergin-1的表达水平或活性，是受试者患有白血病的指示或是受试者处于白血病疾病状态的指示或是受试者处于白血病疾病高发风险的指示或是受试者患有严重白血病的指示。在一些实施方案中，allergin-1在aml患者中高表达，尤其在m4或m5亚型中异常高表达。
[0135]
在本发明的一个方面，本发明涉及检测样本中allergin-1表达水平的试剂在制备鉴别lscs的产品中的应用。优选的，所述检测样本中allergin-1表达水平或活性的试剂与一种或多种其他试剂组合；更优选的，所述一种或多种其他试剂为ifn-γ。
[0136]
在本发明的一个方面，本发明涉及检测样本中allergin-1表达水平的试剂在制备用于白血病(尤其是aml)的诊断、病程监控和预后判断的产品中的应用。优选的，所述检测样本中allergin-1表达水平或活性的试剂与一种或多种其他试剂组合；更优选的，所述一种或多种其他试剂为ifn-γ。
[0137]
在本发明的一个方面，本发明涉及用于检测allergin-1和至少一种生物标志物的组合的试剂在制备用于鉴别lscs的产品中的应用。在一些实施方案中，所述allergin-1和至少一种生物标志物的组合为allergin-1
+
cd34
+
cd38-。
[0138]
在本发明的一个方面，本发明涉及用于检测allergin-1和至少一种生物标志物的组合的试剂在在制备用于白血病(尤其是aml)的诊断、病程监控和预后判断的产品中的应用。在一些实施方案中，所述allergin-1和至少一种生物标志物的组合为allergin-1
+
cd34
+
cd38-。
[0139]
在上述方法或应用的实施方案中，术语检测、确定或诊断包括物理地测定、物理地确定或物理地诊断白血病诸如aml的生物标志物的水平或量的步骤。也就是说，该方法包括以下步骤：利用对于测定水平或量有用的已知方法测定allergin-1的生物标志物的水平或量，和使用所述测定的水平或量相应地确定或诊断。在一个优选实施方式中，生物标志物以其肽或蛋白的形式加以确定。然而，也可以在核酸水平，例如基于生物样品中的mrna水平或量测定allergin-1生物标志物的水平或量。
[0140]
在上述方法或应用的实施方案中，对受试者的疾病的进展可以通过测量对应于诸
如allergin-1等一个或多个生物标志物的mrna，或所编码的蛋白质表达水平或其活性来检测。allergin-1的mrna或蛋白质表达水平可以在体内检测，或在取自例如，血液、骨髓样品中检测。对应于基因的mrna和/或蛋白质的表达水平可以通过如上所述的标准方法检测。通过将受试者的把标蛋白质或rna水平与该受试者靶标蛋白质或rna基线水平比较，可以监测受试者的疾病状态(例如，疾病的改善、加剧或复发)。例如，第一时间检测的受试者的allergin-1表达水平可以与后来的第二时间受试者的allergin-1表达水平比较。allergin-1mrna或蛋白质的表达水平随时间的升高是白血病疾病进展的指征。allergin-1mrna或蛋白质的表达水平随时间的降低是白血病疾病减轻的指征。
[0141]
在上述方法或应用的实施方案中，受试者中例如allergin-1蛋白质或rna的水平也可用于监测治疗效果。通常，获得受试者目的蛋白质或rna的基线水平(例如治疗前的)，并且与在治疗后或治疗期间的多个时间点(例如治疗后1天或更多天、数周或数月)测得的目的蛋白质或rna的水平相比较。比较的结果可表明过去治疗的效果，并可由此对未来的治疗作出相应的修改。
[0142]
根据本发明，本文中公开的方法分别涉及体外和/或体内方法。优选地，所述方法是基于获自个体的和体外提供的样品的体外方法。
[0143]
目的基因转录物可以用多种本领域已知的技术检测。一些有用的核酸检测系统包括准备纯化的样品的核酸组分，以及对样品进行直接检测，或扩增过程之后进行检测，例如检测骨髓或血液组织样本中的allergin-1mrna。可以通过例如聚合酶链式反应(pcr)、反转录酶(rt)和偶联的rt-pcr进行扩增。核酸的检测可以通过例如用与目的核酸杂交的探针探测纯化的核酸组分来达成，许多情况下还会涉及扩增。northern印迹、点印迹、微阵列、定量pcr和定量rt-pcr都是用于检测样本中核酸的众所周知的方法。核酸扩增也可以通过连接酶链反应、链置换扩增、自主序列复制或基于核酸序列的扩增进行。核酸也可以通过测序检测，测序可以采用对目的核酸特异的引物(例如allergin-1cdna序列)或针对接到目的核酸的接头序列的引物。随机选择的mrna或cdna序列的测序可以提供对生物标志物的相对表达量的表征，这通过所有测序的含有对应于该生物标志物的核酸序列(例如allergin-1的cdna或mrna序列)的转录物的百分比来表征。或者，核酸可以原位检测而不经提取或纯化，例如通过杂交来检测。
[0144]
在上述方法或应用的实施方案中，通过已知方法进行根据本发明的生物标志物的水平或量的测定。例如，在蛋白水平确定水平或量的情况下，进行免疫试验，例如elisa、ria、放射免疫扩散、蛋白印迹、奥克特洛尼免疫扩散、火箭免疫电泳、免疫组化染色、免疫沉淀试验、补体结合试验、facs和蛋白质芯片试验以及免疫荧光试验、多重免疫试验、线性试验或斑点印迹试验。
[0145]
根据本发明的方法或应用，在一个优选实施方式中，进行elisa。用于测定生物标志物的水平或量的测定工具的典型实例包括蛋白特异性抗体。特定的分子抗体在本领域是已知的或者可基于本领域描述的方法容易地制备。测定蛋白水平意味着通过使用与蛋白特异结合的测定工具如抗体测定蛋白的量。所述测定方法可限定为上述方法中的任一种。通常，所述方法包括形成抗原抗体复合物和通过已知方法确定该复合物。
[0146]
通过测定生物标志物蛋白的测定标签或表达标签的信号大小，可以确定抗原-抗体复合物形成的量。也就是说，抗体可贴上本领域已知的检测标签，所述检测标签包括但不
限于酶、荧光标志物、配体、发光体、微粒子和氧化还原分子。可用作检测标签的酶的实例包括但不限于d-葡萄糖苷酶、脲酶、过氧化物酶、碱性磷酸酶、乙酰胆碱酯酶、葡萄糖氧化酶、己糖激酶、gdp酶、rna酶、萤光素酶、磷酸果糖激酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、天冬氨酸氨基转移酶和磷酸烯醇丙酮酸脱羧酶。荧光标志物的实例包括但不限于异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白和荧光胺。配体的实例包括但不限于生物素、亲和素以及生物素和亲和素的衍生物。
[0147]
在上述方法或应用的实施方案中，例如，靶蛋白可以用一个或多个抗体免疫检测。在免疫检测中，可以直接或间接标记对生物标志物有特异结合亲和性的抗体，或与该抗体结合的第二抗体。抗体不需要是完整的：抗体可变结构域或其人工模拟物(如单链抗体)即可。合适的标记物包括但不限于，放射性核素(例如，1251、1311、35s、3h、32p、33p或14c)、荧光基团(例如，荧光素、fitc、多曱藻(黄)素叶绿素蛋白、罗丹明或pe)、发光基团、吸收确定波长光的化合物或酶(如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶)。可以通过与生物素结合然后用采用上述分子标记的亲和素或链霉素检测而间接标记抗体。根据标记的性质检测或定量标记物的方法是本领域已知的。检测器的例子包括但不限于x光片、辐射计数器、闪烁计数器、分光光度计、色度计、荧光计、光度计和光密度计。可以使用本领域熟悉的这些方法的组合(包括“多层”检测)来提高检测的灵敏度。
[0148]
在上述方法或应用的实施方案中，例如，检测目标蛋白质的免疫学检验可以以各种已知方式进行，包括夹心法、竞争法(竞争ria)，或桥免疫测定。检测目标蛋白质的方法一般包括将生物学样本与结合该蛋白质的抗体接触，并检测该蛋白质与该抗体的结合。例如，可以通过本领域已知的各种方法中的任何方法将对allergin-1有特异性结合亲和力的抗体固定在固体基质上，然后将该抗体暴露给该生物学样本。
[0149]
在其他实施方案中，使用捕获抗体被固定于固体基质的“夹心”检测法来检测目的蛋白质的水平。该固体基质可以与生物学样本接触，从而使得该样本中的任何目的蛋白质能够结合到该固定化的抗体上。可以利用对目的蛋白质有特异性结合亲和性的“检测”抗体来测定结合到上述捕获抗体的目的蛋白质的水平，方法如上所述。应了解，在这些夹心检验法中，捕获抗体不应该结合到与检测抗体所结合的抗原表位相同的抗原表位上(或在使用多克隆抗体的情况下，捕获抗体结合的抗原表位的范围不该与检测抗体所结合的抗原表位的范围相同)。因此，如果一种单克隆抗体用作捕获抗体，检测抗体可以是另一种单克隆抗体，它结合的抗原表位或者与该捕获单克隆抗体结合的抗原表位在物理上完全分隔，或者仅仅与其部分重叠；检测抗体也可以是多克隆抗体，其结合到非捕获单克隆抗体结合的抗原表位上或结合到除捕获单克隆抗体结合的抗原表位以外的抗原表位上。如果多克隆抗体作为捕获抗体，检测抗体可以是单克隆抗体，它结合的抗原表位或者与该捕获多克隆抗体结合的任何抗原表位在物理上完全分隔，或者与其部分重叠；检测抗体或也可以是多克隆抗体，其结合到非捕获多克隆抗体结合的抗原表位上，或结合到除捕获多克隆抗体结合的抗原表位以外的抗原表位上。夹心检测可以作为夹心elisa法、夹心蛋白质印迹检测或夹心免疫磁性检测法来实施。
[0150]
适用的抗体(如捕获抗体)可以结合的固体基质包括但不限于，微孔板、管、如尼龙膜或硝酸纤维素膜等的膜、和珠子或颗粒(如，琼脂糖、纤维素、玻璃、聚苯乙烯，聚丙烯酰胺、磁性的、或可磁化珠或颗粒)。当使用自动免疫检测系统时，特别适用磁性颗粒或可磁化
颗粒。
[0151]
检测目标多肽的其他技术包括质谱-分光光度技术，例如电喷射离子化(esi)和基质辅助激光解吸电离(maldi)。
[0152]
在上述方法或应用的实施方案中，优选的，上文所述的试剂包括但不限于：适于通过rt-pcr、实时定量pcr、免疫检测(例如elisa、ria、多重免疫实验、免疫荧光实验、蛋白印记、或斑点印记实验)、原位杂交或芯片技术检测allergin-1表达水平用的试剂。更优选的，所述试剂包括针对allergin-1基因的引物/探针、分子信标、rnai、或针对allergin-1蛋白的抗体和/或配体、锌指、以及小分子化合物。
[0153]
在上述方法或应用的实施方案中，优选的，上文所述的产品包括但不限于：芯片、试剂、试纸、制剂、试剂盒或高通量筛选平台。
[0154]
在上述方法或应用的实施方案中，优选的，在一个实施方式中，根据本发明的方法或应用包括以下步骤：
[0155]
a)收集受试者生物样品，优选骨髓细胞；
[0156]
b)检测在上述生物样品中cd34
+
cd38-细胞中allergin-1的表达水平；
[0157]
c)将所述生物样品中测定的allergin-1生物标志物的水平或量与生物标志物的参比水平或量进行比较。
[0158]
优选的，所述参比标签是：1)从未患有白血病例如aml的群体获得的平均标签；和/或2)来自包括白血病例如aml患者的个体的组的平均或中值水平。
[0159]
应理解，采用上述技术中的一种或多种可以容易地检测根据本发明的任何目的基因转录物或目的蛋白质的表达。
[0160]
诊断或病程监控产品
[0161]
在本发明的一个方面，本发明提供了一种白血病(尤其是aml)的诊断、病程监控和预后判断的产品，所述产品包括检测allergin-1表达水平的芯片、制剂或检测试剂盒。
[0162]
优选的，本发明提供了一种白血病(尤其是aml)的诊断、病程监控和预后判断的检测试剂盒。进一步，所述检测试剂盒包括至少一对特异性扩增allergin-1基因的引物；优选的，所述引物具有表3所示的seq id no：18、19、20、21、22或23的序列。
[0163]
表3：allergin-1q-pcr引物(5`
→
3`)
[0164][0165]
优选的，用于检测生物标志物的本发明的检测试剂盒包含对以上蛋白有特异性的抗体，并且可还包含与用于与底物的显色反应的标签例如酶偶联的第二抗体；诱发与标签的显色反应的显色底物溶液；洗液；和酶反应停止液。其可还包含合适的微孔板、标准溶液和方案。对上文和下文描述的生物标志物有特异性的(第一)抗体可自身代替与标签偶联的第二抗体而与标签偶联。
[0166]
用于检测生物标志物的本发明的检测试剂盒可通过经抗原-抗体结合反应定性地或定量地分析抗原而诊断白血病，并且抗原-抗体结合反应可通过常规方法如elisa(酶联免疫吸附试验)或夹心试验进行测定。例如，用于检测如上文或下文所述的检测生物标志物的检测试剂盒可以设置为以下方式：通过使用表面涂布有分析物和对照的96孔微量滴定板进行用于与重组单克隆抗体蛋白反应的elisa。作为抗原-抗体结合反应的接受器，可以使用聚乙烯树脂或聚苯乙烯树脂，硝基纤维素膜，或载玻片。进行显色反应的常规标签如hrp(辣根过氧化物酶)，碱性磷酸酶，胶体金，荧光标签，如荧光素，fitc(聚l-赖氨酸-异硫氰酸荧光素)或ritc(异氰酸罗丹明-b)或染料可优选用作第二抗体偶联物的标签或者用作第一抗体偶联物的标签。也考虑确定生物标记物的量的其它方法，特别是ria(放射免疫检测)，聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白印迹，免疫印迹和免疫组化染色。如本领域众所周知的，针对考虑用于生物标志物的定量确定的特定方法调整检测试剂盒。
[0167]
如上指出的，在蛋白水平确定生物标志物的水平或量的情况下，试剂例如是抗体。可选地，在核酸水平检测水平或量的情况下，试剂可以是核酸分子。
[0168]
优选的，在上述产品的实施方案中，本发明中的检测试剂盒可用于检测allergin-1的表达，优选的，所述的试剂盒包括检测有效量的检测allergin-1基因的试剂，选自下组的一种或多种物质：容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂。例如用于混悬或固定细胞的溶液，可检测的标签或标记，使核酸易于杂交的溶液，用于裂解细胞的溶液，或用于核酸纯化的溶液。
[0169]
更优选的，本发明的试剂盒中还可附有试剂盒的使用说明书，其中记载了如何采用试剂盒进行检测，和如何利用检测结果对白血病发展进行判断、对治疗方案进行选择。
[0170]
在上述产品的实施方案中，采用本发明的试剂盒，可通过选自下组的各种方法(包括但不限于)检测allergin-1：实时定量反转录pcr、生物芯片检测法、dna印迹法、或rna印迹法或原位杂交法。本领域普通技术人员可根据实际条件和需要对检测方式进行调整和改变。
[0171]
在本发明的一个方面，用于检测生物标志物的本发明的阵列可以是微量滴定板。
[0172]
此外，本发明涉及诊断白血病或确定发生白血病的风险的计算机实施的方法，所述方法包括以下步骤：
[0173]
a)获得如本文中限定的白血病生物标志物，即allergin-1在受试者和任选对照的生物样品中的测定水平或量的数据；
[0174]
b)通过将所述样品中的生物标志物的水平或量与从数据库获得的界限值或作为界限对照的测定水平或测定量获得的界限值进行比较而对步骤a)的数据进行运算；
[0175]
c)分析和鉴定其水平或量升高或降低至界限水平之上或之下的生物标志物。
[0176]
任选地，所述方法还包括在输出单元将每一种生物标志物的结果或仅仅阳性或阴性诊断或风险评估的结果以例如有色和突出显示的形式展示呈现的步骤。例如，通过主成分分析进行分析。所述分析可伴有误差分析。
[0177]
本发明还涉及计算机介质或计算机程序产品，其具有用于执行根据本发明的方法的步骤的计算机可执行的指令。
[0178]
在一些实施方式中，测定值和参比值的比较包括计算测定值和参比值之间的倍数差异，从而相应地鉴定测定值是否在界限值之上或之下。
[0179]
治疗和/或缓解疾病的方法和/或应用
[0180]
本发明提供了在受试者中治疗和/或缓解白血病(例如，aml)疾病的方法或应用。具体而言通过调节allergin-1在lscs和aml细胞中的表达来影响上述细胞的增殖、分化和体内定植(或体内生长)，从而应用于白血病(例如，aml)疾病的治疗和/或缓解。在本发明的一个方面，本发明涉及试剂在制备用于治疗受试者的白血病(尤其是aml)的产品中的应用。优选的，所述试剂为allergin-1表达或活性的的调节剂(例如抑制剂/拮抗剂)。优选的，所述产品为药物或药物组合。
[0181]
在上述方法或应用的实施方案中，调节allergin-1的表达或活性可通过allergin-1表达或活性的调节剂(例如抑制剂/拮抗剂)来达成，例如降低编码allergin-1的核酸的表达、降低allergin-1蛋白质水平，或抑制allergin-1的活性。例如，降低allergin-1蛋白的活性、降低allergin-1基因或蛋白的稳定性、下调allergin-1的表达、减少allergin-1蛋白有效作用时间、或抑制allergin-1的转录和翻译的物质。
[0182]
优选的，上文所述的调节剂(例如抑制剂/拮抗剂)包括但不限于：核酸抑制物、蛋白抑制剂、蛋白水解酶、蛋白结合分子；及其组合。其中核酸抑制物选自：以allergin-1或其转录本为靶序列、且能够抑制allergin-1基因表达或基因转录的干扰分子，包括：shrna(小发夹rna)、小干扰rna(sirna)、dsrna、微小rna，或能表达或形成所述shrna、小干扰rna、dsrna、微小rna的构建物。蛋白结合分子选自：与allergin-1蛋白特异性结合的物质，如能够抑制allergin-1蛋白活性的抗体或配体；allergin-1配体结合位点的竞争剂，包括allergin-1受体与其配体结合片段、可溶性截短的allergin-1受体、可溶性allergin-1受体融合蛋白，例如包含igg免疫球蛋白的fc部分的allergin-1融合蛋白、配体融合蛋白；拟肽；肽抑制剂；小分子化合物；及其组合。
[0183]
更优选的，本发明还涉及使用rna干扰(rnai)抑制allergin-1的表达。任何类型的rna干扰序列都可用于本发明。其非限制性的例子包括短干扰rna(sirna)分子或短发夹rna(shrna)。可用多种算法进行rnai序列设计。更优选的，所述调节剂(例如抑制剂/拮抗剂)为shrna；尤其优选的，所述shrna序列如表2中的seq id no：12、13、14、15、16或17所示的序列。
[0184]
表2：shrna序列
[0185][0186]
此外，目的序列可以选择为具有与其他变种或基因序列同源性低的序列。可以通过在表达目的基因产物的细胞中引入或表达该rnai序列来对rnai分子的效果进行评估。目的基因产物的mrna或蛋白质水平的实质改变是rnai分子在抑制该基因表达中的有效性的指征。在细胞中表达rnai分子的方法为本领域所公知，其中包括，例如，慢病毒载体。
[0187]
更优选的，所述调节剂(例如抑制剂/拮抗剂)为配体结合竞争剂。allergin-1信号也可以通过给予结合allergin-1配体的竞争剂来抑制。这可以例如通过给予allergin-1细胞外结构域的可溶性片段来达成，其可选择地偶联到载体蛋白(如本领域已知的igg免疫球蛋白)上。例如，已经公开了给予用allergin-1片段和人iggl的fc部分形成的allergin-1-fc融合蛋白。融合蛋白的igg fc部分可来自任何igg亚类(如iggl，igg2，igg3和igg4)。重要的是，对人的治疗并不一定需要给予野生型的人allergin-1片段：也可以使用来自其他哺乳动物的其他allergin-1片段，而且其中可以引入一个或多个氨基酸取代，只要该片段还保有与内源性人allergin-1竞争与配体结合的能力即可。
[0188]
在上述方法或应用的实施方案中，治疗白血病例如aml的其他手段包括给予结合剂，如蛋白质，肽和/或抗体或其部分(例如，fab,f(ab’)2，fv或单链fv片段)，这种结合剂与治疗靶点相互作用，例如结合和/或中和治疗靶点。对白血病例如aml患者给予抗allergin-1结合剂，例如抗allergin-1抗体，可以通过抑制和/或拮抗allergin-1而减轻疾病的症状。该抗体可以是分离的抗体。在一个实施方案中，该抗体是拮抗性抗体。在另一实施方案中，
该抗体是中和抗体。在进一步的实施方案中，抗体调节、降低和/或抑制一个或多个allergin-1相关的活性，包括但不限于调节、降低和/或抑制allergin-1与allergin-1配体相互作用；调节、降低和/或抑制allergin-1介导的信号转导；和调节、降低和/或抑制allergin-1激活的基因的表达。本发明的抗allergin-1抗体可以包括，例如，特异性结合allergin-1的抗体和/或结合allergin-1受体的膜结合形式而不激活allergin-1受体的抗体。本发明的抗allergin-1抗体也可包括来自任何物种的单结构域抗体。也可以使用替代的结合结构域多肽来抑制和/或拮抗allergin-1活性或allergin-1信号转导。
[0189]
更优选的，所述调节剂(例如抑制剂/拮抗剂)为特异性与allergin-1结合的抗体；优选的，例如，所述特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、中和抗体、抗原结合片段、偶联allergin-1抗体。
[0190]
在上述方法或应用的实施方案中，优选的，所述治疗为免疫治疗。
[0191]
在上述方法或应用的实施方案中，优选的，所述治疗为基因治疗。例如，可直接将allergin-1的调节剂(例如抑制剂/拮抗剂)通过诸如注射等方法给药于受试者；或者，可通过一定的途径将携带allergin-1的调节剂(例如抑制剂/拮抗剂)的表达单位(比如表达载体或病毒等，或sirna或shrna)递送到靶点上，并使之表达活性的allergin-1调节剂(例如抑制剂/拮抗剂)，具体情况需视所述的抑制剂的类型而定，这些均是本领域技术人员所熟知的。
[0192]
在上述应用的实施方案中，用于治疗白血病的方法还包括向所述受试者施用治疗有效量的allergin-1表达或活性的调节剂(例如抑制剂/拮抗剂)与一种或多种治疗剂的组合。
[0193]
优选的，所述一种或多种治疗剂为ifn-γ。
[0194]
在本发明的一个方面，本发明涉及调节剂在制备药物、制剂或治疗试剂盒中的应用，所述药物、制剂或治疗试剂盒用于调节allergin-1在lscs和aml细胞中的表达来影响上述细胞的增殖、分化和体内定植(或体内生长)，从而应用于白血病(例如，aml)疾病的治疗和/或缓解。
[0195]
优选的，在上述应用的实施方案中，所述药物包含上文所述的allergin-1表达或活性的的调节剂(例如抑制剂/拮抗剂)或其药学上可接受衍生物或功能类似物和药学上可接受的辅料、赋形剂、载体、溶媒或它们的组合。
[0196]
也应认识到，本发明公开的上述调节剂(例如抑制剂/拮抗剂)或功能类似物可以以游离形式存在用于治疗，或者如果适当可以以其药学上可接受的衍生物的形式存在。
[0197]
药学上可接受衍生物的一些非限制性的实施方案包括药学上可接受的前药，盐，酯，这些酯的盐，或者对有需要的患者给药时能直接或间接提供本发明所述上述激动剂、促进剂、拮抗剂或抑制剂或功能类似物或其代谢产物或残留物的任何另外的加合物或衍生物。
[0198]
可以施用有效量的上文中所述的调节剂(例如抑制剂/拮抗剂)以预防或治疗疾病。上文中所述的调节剂(例如抑制剂/拮抗剂)，例如抗allergin-1抗体或其抗原结合片段适当剂量可以根据待治疗的疾病类型，调节剂(例如抑制剂/拮抗剂)的类型，疾病的严重程度和病程，治疗的严重程度、个体的临床症状，个体的临床病史和对治疗的反应来确定。在一些实施方案中，用上文中所述的调节剂(例如抑制剂/拮抗剂)与其他药物的联合治疗是
协同的，因此相对于单独的调节剂(例如抑制剂/拮抗剂)的有效剂量而言，降低了组合中的有效剂量。
[0199]
一般而言，本文提供给人的调节剂(例如抑制剂/拮抗剂)，例如allergin-1抗体或其抗原结合片段的治疗有效量为约0.0001mg/kg至约100mg/kg(例如，约0.01mg/kg、约0.1mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg)的患者体重，无论是一次还是多次给药。在一些实施方案中，所使用的抗体或其抗原结合片段是约0.01mg/kg、约0.015mg/kg、约0.1mg/kg、约0.15mg/kg、约0.2mg/kg、约0.3mg/kg、约0.4mg/kg、约0.5mg/kg、约0.6mg/kg、约0.7mg/kg、约0.8mg/kg、约0.9mg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg、约50mg/kg、约55mg/kg、约60mg/kg、约65mg/kg、约70mg/kg、约75mg/kg、约80mg/kg、约85mg/kg、约90mg/kg、约95mg/kg或约100mg/kg。在一些实施方案中，以约50mg/kg或更少、10mg/kg或更少、5mg/kg或更少、1mg/kg或更少、0.5mg/kg或更少、或小于或等于0.1mg/kg的剂量施用抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所使用的抗体或其抗原结合片段是约0.01mg/kg-0.2mg/kg。
[0200]
本发明公开的上述调节剂(例如抑制剂/拮抗剂)或其功能类似物可制备并包装为散装形式，其中可提取安全有效量，然后以粉末或糖浆形式给予患者。或者，本发明公开的上述调节剂(例如抑制剂/拮抗剂)可制备并包装为单位剂型，其中每个物理上离散的单位含有安全有效量。当以单位剂型制备时，本发明公开的上述调节剂(例如抑制剂/拮抗剂)例如，allergin-1抗体或其抗原结合片段以约1mg至约100mg的单位剂量，优选以约5mg、约10mg、15mg、20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg的单位剂量施用。
[0201]
在一些实施方案中，施用剂量可以在治疗过程中改变。例如，在一些实施方案中，初始施用剂量可以高于随后的施用剂量。在一些实施方案中，取决于受试者的反应，给药剂量可以在治疗过程中变化。
[0202]
上述调节剂(例如抑制剂/拮抗剂)或者一种多种其他药物/治疗剂可以多次间隔施用特定剂量，例如每天一次，每天两次或更多次；每周一次，每周两次或三次或更多次；每月一次，两次或更多次；每周一次，每两周一次，每三周一次，每月一次或每两个月一次，或者更少。在一些实施方案中，施用的剂量可以随治疗过程而变化。例如，在某些实施方案中，施用的初始剂量可以高于随后的剂量。在某些实施方案中，根据治疗对象的反应，在治疗过程中调节给药剂量。可以调整剂量方案以达到最佳应答(例如治疗应答)。例如，可以在一段时间内施用单剂量或多次分剂量施用。
[0203]
本发明公开的上述“药学上可接受的辅料、赋形剂、载体、溶媒”意指与给药剂型或药物组合物一致性相关的药学上可接受的材料，混合物或溶媒。每种辅料在混合时必须与药物组合物的其它成分相容，以避免对患者给药时会大大降低本发明公开的上述调节剂(例如抑制剂/拮抗剂)的功效的相互作用和会导致不是药学上可接受的药物组合物的相互作用。此外，每种辅料必须是药学上可接受的，例如，具有足够高的纯度。
[0204]
合适的药学上可接受的“药学上可接受的辅料、赋形剂、载体、溶媒”会依所选具体剂型而不同。此外，可根据它们在组合物中的特定功能来选择药学上可接受的辅料。例如，可选择能有助于生产均一剂型的某些药学上可接受的辅料。可选择能有助于生产稳定剂型的某些药学上可接受的辅料。可选择对患者给药时有助于携带或运输本发明公开化合物从身体的一个器官或部分到身体的另一个器官或部分的某些药学上可接受的辅料。可选择增
强患者依从性的某些药学上可接受的辅料。
[0205]
用于本文公开的“药学上可接受的辅料、赋形剂、载体、溶媒”可包括例如药学上可接受的液体、凝胶或固体载体、水性介质、非水性介质、抗微生物材料、渗透材料、缓冲剂、抗氧化剂、麻醉剂、悬浮/分散剂、螯合剂、稀释剂、佐剂或无毒辅助物质，本领域已知的其他组分或上述的各种组合。
[0206]
合适的组分可以包括例如抗氧化剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、缓冲剂、防腐剂、润滑剂、增香剂、增稠剂、着色剂、乳化剂或稳定剂，例如糖和环糊精。合适的抗氧化剂可以包括例如甲硫氨酸、抗坏血酸、edta、硫代硫酸钠、铂、过氧化氢酶、柠檬酸、半胱氨酸、巯基甘油、巯基乙醇酸、脱水山梨醇、丁基茴香醚、丁基化羟基甲苯和/或没食子酸丙酯。
[0207]
此外，药学上可接受的赋形剂或载体可包括例如水性媒介物，例如氯化钠注射剂、林格氏注射剂、等渗右旋糖注射剂、无菌水注射剂或右旋糖和乳酸林格氏剂注射剂，非水媒介物例如固定油。植物来源、棉籽油、玉米油、芝麻油或花生油、抑菌或抑菌浓度的抗菌剂、等渗剂(例如氯化钠或葡萄糖)、缓冲剂(例如磷酸盐或柠檬酸盐缓冲剂)、抗氧化剂(例如硫酸氢钠)、局部麻醉剂作为盐酸普鲁卡因、悬浮剂和分散剂，例如羧甲基纤维素钠，羟丙基甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮、乳化剂，例如聚山梨酯80(tween-80)，螯合剂或螯合剂，例如edta(乙二胺四乙酸)或egta(乙二醇四乙酸)、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、钠氢氧化物、盐酸、柠檬酸或乳酸。可用作载体的抗微生物剂可以在多剂量容器中添加到药物组合物中，该容器包括苯酚或甲酚、汞、苯甲醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和丙基对羟基苯甲酸酯、硫柳汞、苯扎氯铵和苄索氯铵。合适的赋形剂可包括例如水、盐水、右旋糖、甘油或乙醇。合适的无毒辅助物质可以包括，例如，润湿剂或乳化剂、ph缓冲剂、稳定剂、溶解度增强剂、或诸如乙酸钠、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯或环糊精的试剂。
[0208]
优选的，合适的药学上可接受的辅料包括以下类型的辅料：稀释剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、造粒剂、包衣剂、润湿剂、溶剂、共溶剂、助悬剂、乳化剂、甜味剂、矫味剂、掩味剂、着色剂、防结块剂、保湿剂、螯合剂、塑化剂、增粘剂、抗氧化剂、防腐剂、稳定剂、表面活性剂和缓冲剂。技术人员可认识到，某些药学上可接受的辅料可提供不止一种功能，并提供可供选择的功能，这取决于制剂中存在多少该辅料和制剂中存在哪些其他辅料。
[0209]
本发明公开的上述调节剂(例如抑制剂/拮抗剂)或其功能类似物通常被配制成适合于通过所需途径对患者给药的剂型。例如，剂型包括那些适合于以下给药途径的剂型：(1)口服给药，例如片剂、胶囊剂、囊片剂、丸剂、含片剂、粉剂、糖浆剂、酏剂、混悬剂、溶液剂、乳剂、颗粒剂和扁囊剂；(2)胃肠外给药，例如无菌溶液剂、混悬剂和冻干粉末剂；(3)透皮给药，例如透皮贴片剂；(4)直肠给药，例如栓剂；(5)吸入，例如气雾剂、溶液剂和干粉剂；和(6)局部给药，例如乳膏剂、油膏剂、洗剂、溶液剂、糊剂、喷雾剂、泡沫剂和凝胶剂。
[0210]
在一些实施方案中，上述调节剂(例如抑制剂/拮抗剂)或其功能类似物例如allergin-1抗体或其抗原结合片段通过植入、通过吸入、鞘内、心室内或鼻内静脉内、肌内、皮下、局部、口服、经皮、腹膜内、眶内、口服给药，优选静脉内给药。
[0211]
在一些实施方案中、上述方法或应用可以进一步包括另外的疗法。附加疗法可以是放射疗法、手术、化学疗法、基因疗法、dna疗法、病毒疗法、rna疗法、免疫疗法、骨髓移植、纳米疗法、单克隆抗体疗法或前述的组合。附加疗法可以采取辅助或新辅助疗法的形式。在
一些实施方案中，另外的疗法是小分子酶抑制剂或抗转移剂的施用。在一些实施方案中，另外的疗法是施用副作用限制剂(例如，旨在减轻治疗副作用的发生和/或严重性的试剂，例如抗恶心剂等)。在一些实施方案中，另外的疗法是放射疗法。在一些实施方案中，该另外的疗法是手术。在一些实施例中，附加疗法是放射疗法和手术的组合。在一些实施方案中，另外的疗法是伽马辐射。
[0212]
本发明的治疗方法或应用可以在手术之前或之后用于去除肿瘤，并且可以在放射疗法之前，之中或之后使用。在一些实施方案中，将本发明治疗方法或应用施用于先前未曾用生物治疗剂或化学治疗剂治疗过的患者。在其他实施方案中，将本发明治疗方法或应用施用于在用生物治疗剂或化学治疗剂(即经历过治疗)的先前治疗后未能实现持续应答的患者。
[0213]
药物、药物组合和/或药物筛选方法
[0214]
在本发明的一个方面，本发明提供了一种治疗白血病的药物、组合物或治疗试剂盒，其中，药物、组合物或治疗试剂盒包括allergin-1功能性表达的调节剂(例如抑制剂/拮抗剂)，和/或与所述调节剂(例如抑制剂/拮抗剂)配伍的其他类药物以及药学上可接受的辅料、赋形剂、载体、溶媒或它们的组合。
[0215]
优选的，在上述药物或组合物实施方案中，所述调节剂(例如抑制剂/拮抗剂)如上文“治疗和/或缓解疾病的方法和/或应用”部分中所限定。
[0216]
优选的，在上述药物或组合物实施方案中，所述药学上可接受的辅料、赋形剂、载体、溶媒或它们的组合如上文“治疗和/或缓解疾病的方法和/或应用”部分中所限定。
[0217]
优选的，所述其他类药物为ifn-γ。
[0218]
优选的，本发明的药物或组合物还可以与其他治疗白血病的药物联用，其他治疗性药物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。还可以以单独的组合物或与主要的活性成分不同的剂量形式单独给予其它治疗性药物。
[0219]
在本发明的一个方面，本发明提供了生物标志物allergin-1在筛选治疗白血病(尤其是aml)的候选药物的方法。优选的，所述方法包括：用待筛选物质处理表达或含有allergin-1基因的体系；和检测所述体系中allergin-1基因的表达水平；其中，若所述待筛选的物质可以降低allergin-1基因的表达水平，则表明该待筛选物质是治疗白血病(尤其是aml)的候选药物。更优选的，上文所述的体系包括(但不限于)：细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系；所述候选药物包括(但不限于)：针对allergin-1基因或其上游或下游基因设计的干扰分子、核酸抑制物、小分子化合物。
[0220]
本领域技术人员通过上下文说明以及通过实施例可明了本发明的其他目的。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。在以下实施例中的定量试验中，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0221]
在以下实施例中，抗人allergin-1抗体(克隆#767727，小鼠igg1)购自美国r&d systems公司。使用噬菌体展示技术制备了针对人allergin-1l(allergin-1长形式，genbank：人allergin-1l，ab542950)的全人allergin-1抗体(人igg1)。
[0222]
实施例1
[0223]
target(therapeutically available research to generate effective treatments)数据库分析
[0224]
实验方法:
[0225]
基于target数据库(https://ocg.cancer.gov/programs/target/,accessed december 9,2019)中的aml患者rna sequencing数据(fpkm)分析allergin-1表达水平与aml预后的相关性及allergin-1在aml患者各亚型中的表达。依据allergin-1表达值的中位数将87位m4/m5亚型aml患者分为高表达组与低表达组，进行不同组aml患者的kaplan-meier生存分析。
[0226]
实验结果：
[0227]
通过target aml数据库进行分析细胞表面生物标志物在aml患者中的表达情况，发现在m4/m5亚型aml患者中allergin-1表达与aml患者生存率之间存在明显的相关性，预后差的患者中allergin-1的表达显著升高(图1a)，且在m5亚型aml患者中其表达高于其他亚型患者(图1b)。其中，图1b中，allergin-1在m5亚型aml患者中高表达，m0-m5，*p＝0.028；m1-m5，****p《0.0001；m2-m5，****p《0.0001；m4-m5，****p《0.0001；m5-m6，*p＝0.0274；m5-m7，***p＝0.0005；m5-nos，**p＝0.0045；m5-unknown，**p＝0.0092。error bars,s.e.m。
[0228]
结果提示allergin-1可应用于aml病程监控和预后判断。
[0229]
实施例2
[0230]
检测hscs、lscs、患者原代aml细胞和aml细胞系细胞的allergin-1表达以及检测lscs自我更新
[0231]
实验方法:
[0232]
原发aml患者骨髓样本(详见表1)和足月健康新生儿脐带血由相关医院提供，所有样本，经伦理委员会的许可，将相关事项告知志愿者并知情同意后纳入实验。
[0233]
表1:本发明所使用的8例aml患者样本
[0234][0235]
hl-60、thp-1、mv4-11和u937均购于atcc。通过ficoll-paque细胞密度梯度分离液(pharmacia biotech,uppsala,sweden)分离脐带血和aml患者骨髓的单个核细胞。流式细胞仪检测allergin-1在富集正常hscs或lscs的cd34
+
cd38-脐带血和原代aml患者骨髓细胞中的表达水平。将人aml细胞系细胞常规培养于dmem完全培养基(含10％fbs、100u/ml青霉素和100u/ml链霉素)，置于37℃、5％co2及饱和湿度的培养箱中培养，每3-4天传代1次。流式细胞仪检测上述aml细胞系细胞中allergin-1的表达水平。原代aml患者骨髓细胞中分选出3000个cd34
+
cd38-allergin-1
+
和cd34
+
cd38-allergin-1-细胞与人造血集落甲基纤维素培养基(m3534,stem cell technologies，vancouver，bc，canada)充分混合后加入到35mm细胞培养皿中，置37℃、5％co2及饱和湿度的培养箱中培养。6天后通过倒置显微镜计数其中》50个细胞集落形成单位。检测上述细胞的自我更新能力。使用的抗体分别是human allergin-1antibody，pe或fitc-conjugated anti-human cd34(cone#8g12，becton dickinson company，bd biosciences)和pe-cyanine7-conjugated anti-human cd38
(clone#hit2，ebioscience)。
[0236]
实验结果：
[0237]
cd34
+
cd38-细胞中富集hscs或lscs，因此本发明收集健康人脐带血和原发aml患者骨髓细胞(表1)，检测在上述cd34
+
cd38-细胞中allergin-1的表达水平。发现allergin-1在健康人脐带血cd34
+
cd38-细胞中不表达(图2a和2b)，而在原发aml患者骨髓cd34
+
cd38-细胞中却异常显著高表达(图2c和2d)，提示allergin-1可应用于正常hscs与lscs的鉴别。
[0238]
根据图2c和2d可知，所述allergin-1在造血干细胞中的表达水平或活性是正常造血干细胞中allergin-1的表达水平或活性的约3倍-约100倍，平均为约57倍。
[0239]
从原发aml患者骨髓细胞中分选出cd34
+
cd38-allergin-1
+
和cd34
+
cd38-allergin-1-细胞进行cfu形成实验。发现上述cd34
+
cd38-allergin-1
+
细胞的cfu形成能力显著高于cd34
+
cd38-allergin-1-细胞(图3，(n＝3)，*p《0.05)，提示cd34
+
cd38-allergin-1
+
细胞的自我更新能力显著高于cd34
+
cd38-allergin-1-细胞。
[0240]
实施例3
[0241]
检测allergin-1对aml细胞增殖和分化的影响
[0242]
实验方法:
[0243]
构建allergin-1敲降质粒和转染aml细胞：合成3对靶向allergin-1基因的特异性干扰序列(详见表14)及1对非特异性干扰序列，转染thp-1和u937细胞。病毒颗粒标记绿色荧光蛋白(gfp)。转染72小时后，用流式细胞仪分选gfp
+
细胞，使用抗allergin-1抗体(ab177744，abcam)通过western blot实验验证thp-1和u937细胞的allergin-1的敲降效率。
[0244]
绘制细胞生长曲线和检测细胞分化：转染shrna 72h后从上述细胞中分选gfp阳性thp-1和u937细胞置于96孔u型板中(corning incorporated costar 3799，corning，ny，usa)，每孔容量为0.2ml，含细胞3000个，连续培养6天或12天，每48或72h收集细胞计数并分析allergin-1对thp-1和u937细胞增殖的影响。流式细胞仪检测thp-1(12天)和u937细胞(培养6天)中cd11b(clone#m1/70，biolegend)表达水平来探讨allergin-1对thp-1和u937分化的影响。
[0245]
实验结果：
[0246]
检测allergin-1
+
或allergin-1-aml细胞系thp-1和u937细胞的增殖和分化指标。发现allergin-1
+
aml细胞的增殖能力显著高于对照组allergin-1-细胞，(n＝3)，*p《0.05(图4a和4b)，而allergin-1
+
aml细胞中髓细胞晚期分化标志cd11b的表达水平显著低于对照组allergin-1-细胞，(n＝3)，*p《0.05(图4c和4d)。
[0247]
检测靶向人allergin-1基因特异性干扰序列或非特异性干扰序列对aml细胞增殖、分化和体内定植的影响。发现allergin-1敲降组与对照组相比显著抑制aml细胞的增殖，同时显著促进aml细胞cd11b的表达水平，(n＝3)，*p《0.05(图5a-5h)。
[0248]
实施例4
[0249]
检测ifn-γ对aml细胞的allergin-1表达和增殖的影响
[0250]
实验方法:
[0251]
hl-60、thp-1、mv4-11和u937细胞(3
×
104个)在dmem完全培养基或含30ng/ml recombinant human ifn-γ(catalog#300-02，peprotech)的dmem完全培养基中培养2天
后，通过流式细胞仪和细胞计数检测ifn-γ对allergin-1表达及aml细胞增殖的影响。进一步，hl-60、thp-1、mv4-11和u937细胞在含ifn-γ(30ng/ml)的dmem完全培养基中培养2天后，流式细胞仪分选1
×
103个allergin-1阳性或allergin-1阴性细胞，继续在dmem完全培养基中培养6天，通过细胞计数检测ifn-γ预处理细胞对aml增殖的影响。
[0252]
实验结果：
[0253]
检测ifn-γ对aml细胞增殖和allergin-1表达的影响。发现ifn-γ促进aml细胞的增殖(图6a)和allergin-1的表达水平(图6b)，(n＝3)，*p《0.05，且ifn-γ预处理aml细胞后allergin-1
+
细胞的增殖能力显著高于对照组allergin-1-细胞(图6c)，(n＝3)，*p《0.05。
[0254]
实施例5
[0255]
检测allergin-1对aml细胞体内定植的影响
[0256]
实验方法:
[0257]
shrna预处理细胞进行异种移植实验：gfp阳性allergin-1敲降的thp-1细胞经眼窝静脉丛移植至npg小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司，beijing vital river laboratory animal technology co.,ltd.)，设立实验组和阴性对照组，每组6只。实验组接种allergin-1shrna预处理的gfp阳性thp-1细胞，1
×
106/只；阴性对照组接种非特异性干扰序列预处理的gfp阳性thp-1细胞，1
×
106/只。移植12周后，流式细胞仪检测小鼠脾脏和肝脏细胞中gfp阳性细胞所占比例来评价移植细胞的定植能力。
[0258]
实验结果：
[0259]
进一步发现移植allergin-1敲降thp-1细胞的小鼠肝脏及脾脏重量显著小于对照组(图7a)，(n＝3)，*p《0.05；且allergin-1敲降thp-1细胞在小鼠肝脏和脾脏细胞中的定植能力与对照组细胞相比显著降低(图7b)，(n＝3)，*p《0.05。
[0260]
实施例6
[0261]
评估allergin-1抗体选择性清除aml细胞的可行性
[0262]
实验方法:
[0263]
使用外周血单核细胞(pbmc)作为效应细胞，aml细胞系thp-1细胞(atcc(american type culture collection),tib-202)作为靶细胞来检测allergin-1抗体的adcc效果。使用ficoll-paque细胞密度梯度分离液(pharmacia biotech，uppsala，sweden)分离外周血单核细胞，在含15ng/ml重组人il-2(货号#200-02，peprotech)的dmem完全培养基中将分离的外周血单核细胞培养18小时。收集thp-1细胞作为靶细胞。将实验组的allergin-1抗体和同型对照组的igg1抗体分别加入到靶细胞中，抗体终浓度为2μg/ml，在37℃下孵育30分钟。然后将靶细胞悬浮液加入96孔u型板中，50μl/孔。以效/靶比为10：1加入效应细胞，50μl/孔，总体积为100μl/孔。在37℃，5％co2培养箱中培养5小时后，使用celltiteraqueous非放射性细胞增殖检测试剂盒(cytotoxnon-radioactive cytotoxicity assay，货号：g1780，promega)显色读数。
[0264]
在nod/scid小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司，beijing vital river laboratory animal technology co.,ltd.)体内检测allergin-1抗体对健康脐带血cd34
+
细胞的重建造血能力或原代aml患者骨髓细胞生长的影响：健康脐带血cd34
+
细胞(1
×
106/只)或原代aml患者骨髓细胞(1
×
106/只)经眼窝静脉丛分别移植至nod/scid小鼠体内24h后，用allergin-1或igg抗体(静脉注射)处理小鼠，每周处理一次，每只小鼠每次用15μg抗
体，持续4周。移植五周后，流式细胞仪检测小鼠骨髓细胞中hcd45
+
(clone#j33，beckman coulter)细胞所占比例，检测hcd45
+
细胞中cd34
+
cd38-，cd34
+
，allergin-1
+
，cd33
+
(clone#him3-4，ebioscience inc.)，cd19
+
(clone#hib19，ebioscience)或allergin-1
+
cd33
+
细胞所占比例。
[0265]
实验结果：
[0266]
在体外，aml细胞系thp-1细胞和allergin-1抗体与外周血单核细胞混合作用之后，检测allergin-1抗体介导的外周血单核细胞对aml细胞的细胞毒作用(adcc)。发现allergin-1抗体介导的外周血单核细胞对aml细胞的细胞毒作用显著高于对照组(图8)，(n＝3)，*p《0.05。
[0267]
allergin-1在lscs和aml单核细胞中高表达，而在正常hscs中不表达和正常单核细胞中低表达(图2a-2d)。因此，在体内检测allergin-1抗体介导的免疫效应细胞对原发aml患者骨髓细胞的细胞毒作用。原发aml患者骨髓细胞经眼窝静脉丛移植至nod/scid小鼠体内，建立人异种移植aml小鼠模型。模型小鼠用igg1(阴性对照)或allergin-1抗体处理，移植5周后流式细胞仪检测不同处理组小鼠肝脏或骨髓中人aml细胞所占比例(图9a)。发现allergin-1抗体处理组小鼠肝脏细胞中人cd45
+
细胞所占比例显著低于对照组igg1抗体处理组(图9b)。进一步发现allergin-1抗体处理组小鼠骨髓中人cd45
+
细胞，人cd45
+
细胞中cd34
+
aml细胞，人cd45
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细胞中cd34
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cd38-和人cd45
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细胞中allergin-1
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细胞所占比例均显著低于igg1抗体处理对照组(图9c和9d)，尤其是allergin-1抗体处理组小鼠骨髓细胞中几乎检测不到人cd34
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cd38-的lscs(图9c下-9d左下)，(n＝3)，*p《0.05，提示allergin-1抗体可以根本上消除aml的根源性lscs。而allergin-1抗体不影响脐带血cd34
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细胞的体内造血重建和定植能力(图10a-10d)，(n＝3)，*p《0.05，提示allergin-1抗体的安全性。
[0268]
实施例7
[0269]
检测allergin-1对nk细胞活性及细胞毒作用的影响
[0270]
实验方法:
[0271]
通过allergin-1
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或allergin-1-aml细胞与健康人外周血单核细胞来源cd3-cd56
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nk细胞共培养来检测allergin-1对nk细胞活性的影响。从健康人外周血单核细胞中分离cd3-cd56
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nk细胞，调整细胞浓度为1
×
106/ml。收集allergin-1
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或allergin-1-thp-1细胞，调整细胞浓度为2
×
105/ml。将100μl的nk细胞与100μl的allergin-1
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或allergin-1-thp-1细胞悬浮液充分混合后加入96u孔板中，总容积为200μl/孔。含100ng/ml recombinant human il-2和1ng/ml recombinant human il-3(catalog#200-03，peprotech)的dmem完全培养基中培养2天后，流式细胞仪检测活化nk细胞的标志cd25。使用的抗体分别是anti-human cd25-pe(clone：1d4b，biolegend)，anti-human cd56-pc5.5(clone：pk136，biolegend)和anti-human cd3e-fitc(clone：145-2c11，ebioscience.)。
[0272]
实验结果：
[0273]
在体外将allergin-1
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或allergin-1-thp-1细胞与健康人外周血单核细胞来源的cd3-cd56
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nk细胞在体外共培养2天后，检测allergin-1对nk细胞活性的影响。发现与allergin-1-thp-1细胞共培养的nk细胞的cd25(活化nk细胞标志)表达水平显著高于与allergin-1
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thp-1细胞共培养的nk细胞，且与allergin-1-thp-1细胞共培养的nk细胞的细胞毒作用显著高于与allergin-1
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thp-1细胞共培养的nk细胞(图11)，(n＝3)，*p《0.05。以
上发现提示n k细胞的活化与共培养aml细胞的allergin-1表达相关，因此，在aml细胞中降低allergin-1的表达或/和allergin-1的活性有助于更加有效的清除a m l细胞。
[0274]
本说明书中公开的所有特征可以以任何组合进行组合。本说明书中公开的每个特征可以由具有相同，等同或相似目的的替代特征代替。因此，除非另有明确说明，否则所公开的每个特征仅是一系列等同或相似特征的示例。根据以上描述，本领域技术人员可以容易地确定本发明的基本特征，并且在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明进行各种改变和修改以使其适应各种用途和条件。因此，其他实施例也在所附权利要求的范围内。

技术特征：
1.检测allergin-1的表达水平或活性的试剂在制备用于鉴别lscs的产品中的应用，所述试剂用于检测受试者或来自受试者的样本中allergin-1的表达水平或活性；任选地，所述样本包含造血干细胞；任选地，allergin-1在造血干细胞中的表达水平或活性显著高于正常造血干细胞中allergin-1的表达水平或活性，是造血干细胞为lscs的指示；任选地，所述allergin-1在造血干细胞中的表达水平或活性是正常造血干细胞中allergin-1的表达水平或活性的至少3倍以上，是造血干细胞为lscs的指示，优选的，所述allergin-1在造血干细胞中的表达水平或活性是正常造血干细胞中allergin-1的表达水平或活性的3倍-100倍，更优选地，为20-50倍。2.检测allergin-1的表达水平或活性的试剂在制备用于白血病的诊断、病程监控和预后判断或用于确定发生白血病的风险或用于确定白血病严重程度的产品中的应用，所述试剂用于检测受试者或来自受试者的样本中allergin-1的表达水平或活性；任选地，所述样本包含造血干细胞或单核细胞；任选地，所述allergin-1在造血干细胞中的表达水平或活性是正常造血干细胞中allergin-1的表达水平或活性的至少3倍以上，是造血干细胞为lscs的指示，优选的，所述allergin-1在造血干细胞中的表达水平或活性是正常造血干细胞中allergin-1的表达水平或活性的3倍-100倍，更优选地，为20-50倍；任选地，所述allergin-1在单核细胞中的表达水平或活性是正常单核细胞中allergin-1的表达水平或活性的至少2倍以上，是单核细胞为aml单核细胞的指示，优选的，所述allergin-1在单核细胞中的表达水平或活性是正常单核细胞中allergin-1的表达水平或活性的2倍-45倍；任选地，在m4和m5亚型aml患者中allergin-1的表达水平与患者的生存率呈负相关，尤其在生存率极低的m5亚型中特异性异常高表达。3.allergin-1表达或活性的调节剂(例如抑制剂/拮抗剂)在制备用于治疗白血病的受试者病症的产品中的应用。4.allergin-1表达或活性的调节剂(例如抑制剂/拮抗剂)与一种或多种治疗剂在制备用于治疗白血病的受试者病症的产品中的应用，优选的，所述一种或多种治疗剂为ifn-γ。5.allergin-1表达或活性的调节剂(例如抑制剂/拮抗剂)在制备用于治疗白血病的受试者病症的药物中的应用，其中所述调节剂(例如抑制剂/拮抗剂)与一种或多种治疗剂组合，优选的，所述一种或多种治疗剂为ifn-γ。6.一种组合物，药物，制剂或治疗试剂盒，其包含allergin-1表达或活性的调节剂(例如抑制剂/拮抗剂)，任选地，所述调节剂与一种或多种其他治疗剂组合使用，用于治疗白血病的受试者病症，优选的，所述一种或多种治疗剂为ifn-γ。7.一种组合物，药物，制剂或治疗试剂盒，其包含allergin-1表达或活性的调节剂(例如抑制剂/拮抗剂)和一种或多种药学上可接受的辅料、赋形剂、载体和/或溶媒。8.一种用于检测lscs的检测试剂盒，其包含检测allergin-1表达水平或活性的试剂。9.一种筛选治疗白血病的候选药物的方法，所述方法包括：用待筛选物质处理表达或
含有allergin-1基因的体系；和检测处理前后所述体系中allergin-1基因和/或蛋白的表达水平或活性；任选地，处理后所述体系中allergin-1基因和/或蛋白的表达水平或活性低于处理前所述体系中allergin-1基因/或蛋白的表达水平或活性，指示该待筛选物质是治疗白血病的受试者病症的候选药物。10.有效量的allergin-1表达或活性的抑制剂或拮抗剂在制备用于消除lscs和/或aml细胞和/或提高正常nk细胞活性或免疫治疗效果的药物中的应用。11.权利要求1-10中任一项的方法、应用、组合物、药物、制剂、治疗试剂盒或检测试剂盒，其中，所述白血病为急性髓性白血病aml。12.权利要求1-11中任一项的方法、应用、组合物、药物、制剂、治疗试剂盒或检测试剂盒，其中，allergin-1在aml患者中高表达，优选的，在m5亚型中异常高表达。13.权利要求1-12中任一项的方法、应用、组合物、药物、制剂、治疗试剂盒或检测试剂盒，其中，所述allergin-1和至少一种生物标志物组合，优选的，所述组合为allergin-1
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cd34
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cd38-。14.权利要求1-13中任一项的方法、应用、组合物、药物、制剂、治疗试剂盒或检测试剂盒，其中，所述产品包括：芯片、试剂、试纸、药物、制剂、试剂盒或高通量筛选平台。15.权利要求1或2所述的应用或权利要求8所述的试剂盒，其中，所述试剂是适于通过rt-pcr、实时定量pcr、免疫检测(例如elisa、ria、多重免疫实验、免疫荧光实验、蛋白印记、或斑点印记实验)、原位杂交或芯片技术检测allergin-1表达水平或活性的试剂，优选的，所述试剂包括针对allergin-1基因的引物/探针、分子信标、或针对allergin-1蛋白的抗体和/或配体以及小分子化合物，尤其优选的，所述针对allergin-1基因的引物具有seq id no：18、19、20、21、22或23所示的序列。16.权利要求1-15中任一项的方法、应用、组合物、药物、制剂、治疗试剂盒或检测试剂盒，其中，所述抑制剂或拮抗剂与ifn-γ组合使用；或者所述组合物、药物、制剂、治疗试剂盒、检测试剂盒包含ifn-γ。17.权利要求1-16中任一项的方法、应用、组合物、药物、制剂、治疗试剂盒或检测试剂盒，其中，所述抑制剂和/或拮抗剂是指任何可降低编码allergin-1的核酸的表达、降低allergin-1蛋白质水平，或抑制allergin-1的活性的物质，优选为降低allergin-1蛋白的活性、降低allergin-1基因或蛋白的稳定性、下调allergin-1的表达、减少allergin-1蛋白有效作用时间、或抑制allergin-1的转录和翻译的物质。18.权利要求1-17中任一项的方法、应用、组合物、药物、制剂、治疗试剂盒或检测试剂盒，其中，所述allergin-1表达或活性的调节剂(例如抑制剂/拮抗剂)包括：核酸抑制物、蛋白抑制剂、蛋白水解酶、蛋白结合分子；及其组合。19.权利要求1-18中任一项的方法、应用、组合物、药物、制剂、治疗试剂盒或检测试剂盒，其中，所述allergin-1表达或活性的调节剂(例如抑制剂/拮抗剂)选自：以allergin-1或其转录本为靶序列、且能够抑制allergin-1基因表达或基因转录的干扰分子，优选的，包括：shrna(小发夹rna)、小干扰rna(sirna)、dsrna、微小rna，锌指，和crispr/cas9的至少之一。20.权利要求18所述的方法、应用、组合物、药物、制剂、治疗试剂盒或检测试剂盒，其
中，所述蛋白结合分子选自：与allergin-1蛋白特异性结合的物质，如能够抑制allergin-1蛋白活性的抗体或配体；allergin-1配体结合位点的竞争剂，包括allergin-1受体与其配体结合片段、可溶性截短的allergin-1受体、可溶性allergin-1受体融合蛋白，例如包含igg免疫球蛋白的fc部分的allergin-1融合蛋白、配体融合蛋白；拟肽；肽抑制剂；小分子化合物；及其组合。21.权利要求20所述的方法、应用、组合物、药物、制剂、治疗试剂盒或检测试剂盒，其中，所述allergin-1表达或活性的调节剂(例如抑制剂/拮抗剂)为shrna；尤其优选的，所述shrna序列具有seq id no：12、13、14、15、16或17所示的序列。22.权利要求21所述的方法、应用、组合物、药物、制剂、治疗试剂盒或检测试剂盒，其中，所述allergin-1表达或活性的调节剂(例如抑制剂/拮抗剂)为特异性与allergin-1结合的抗体；优选的，例如，所述特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、中和抗体、抗原结合片段、偶联allergin-1抗体，更优选的，所述抗体为单克隆抗体和/或中和抗体。23.权利要求1-22中任一项的方法、应用、组合物、药物、制剂、治疗试剂盒或检测试剂盒，其中，所述allergin-1表达或活性的调节剂(例如抑制剂/拮抗剂)以约0.01mg/kg至约100mg/kg，例如，约0.01mg/kg-0.2mg/kg、约0.1mg/kg-10mg/kg、约0.5mg/kg-5mg/kg、或约1mg/kg-约2mg/kg给药；优选的，所述allergin-1表达或活性的调节剂(例如抑制剂/拮抗剂)的单位剂量为约1mg至约100mg的单位剂量，优选为约5mg-50mg、约10mg-40mg、15mg-30mg、或20mg-25mg。

技术总结
本发明涉及白血病干细胞特异性表达生物标志物Allergin-1及其应用。具体而言，涉及白血病尤其是急性髓系白血病(AML)的诊断产品、治疗药物或组合物、检测标志物Allergin-1的检测试剂在制备用于白血病的诊断、病程监控和预后判断的产品中的应用、治疗剂/调节剂在制备用于白血病治疗的药物中的用途。用于白血病治疗的药物中的用途。


技术研发人员：崔昌浩
受保护的技术使用者：大连理工大学
技术研发日：2021.12.31
技术公布日：2023/7/13