一种抑制α-葡萄糖苷酶的活性肽的制备方法、纯化方法及应用与流程

一种抑制
α-葡萄糖苷酶的活性肽的制备方法、纯化方法及应用
技术领域
1.本发明属于酶解技术领域，具体地说，涉及一种抑制α-葡萄糖苷酶的活性肽的制备方法、纯化方法及应用，更具体的，涉及一种从火麻籽粕中提取得到抑制α-葡萄糖苷酶的活性肽的制备方法、纯化方法和应用。


背景技术：

2.α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase，gaa)主要位于小肠刷状缘细胞膜上，它是在生物糖代谢过程中起关键作用的酶，它能将双糖，如庶糖、麦芽糖等低聚糖水解成可被人体小肠部分吸收的单糖。α-葡萄糖苷酶的抑制剂有助于降低酶活性，降低低聚糖分解成葡萄糖的速度，阻碍肠道对葡萄糖的消化和吸收，降低餐后血糖峰值和降低血糖波动，减少高血糖对膜腺等脏器的刺激，将餐后血糖浓度维持在正常水平，从而达到改善餐后高血糖或者是改善患者糖耐受受损状况的目的。
3.目前有一些降血糖的药物已经上市，例如阿卡波糖、米格列醇和伏格列波糖等，它们通过抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性起作用，但持续使用这些药物通常会带来不良的副作用，例如肝毒性和出现消化系统不良反应的症状。近年来，国内外越来越多的研究从天然产物中筛选得到α-葡萄糖苷酶抑制剂，如苦瓜多肽、海藻多糖、槲皮素、肉桂多酚等。
4.酶解技术是一种比较温和绿色的方法，常用于活性肽的制备。例如，申请号为cn202011487041.x的中国专利公开了一种从茶籽粕中提取得到降血糖肽的方法，包括茶籽粕粉碎，茶籽粕脱脂，茶籽粕蛋白提取，茶籽粕粗肽制备，α-葡萄糖苷酶抑制肽分离及筛选，α-葡萄糖苷酶抑制肽的结构鉴定。申请号为cn201910432490.5的中国专利公开了一种降血糖的牡丹活性肽的制备方法，以带种皮的牡丹籽粕为原料，先萃取得到牡丹蛋白，向牡丹蛋白溶液中加入复合酶，所述复合酶为中性蛋白酶、胰蛋白酶、氨肽酶，酶解后得到的牡丹活性肽用环糊精进行包埋，去除辛辣味，牡丹蛋白内的肽键，在中性蛋白酶和胰蛋白酶这两类内肽酶作用下，从肽链内部将蛋白质水解为多肽。以上技术方案中，都是先从植物籽粕中提取植物蛋白，再对植物蛋白进行酶解得到多肽。
5.火麻，又名汉麻，我国主要集中在广西、云南、东北三省等地种植。火麻仁作为火麻的种子，2002年被列为药食同源的资源，其富含蛋白质、油脂、膳食纤维等营养成分。在国内，关于火麻仁研究更多的是火麻油、四氢大麻酚等成分，而火麻籽粕作为提取火麻油之后的副产物，常被作为饲料，从而导致了蛋白资源的浪费。目前还没有从火麻籽粕中制备抑制α-葡萄糖苷酶的活性肽的报道。
6.有鉴于此特提出本发明。


技术实现要素：

7.本发明要解决的技术问题在于克服现有技术的不足，提供一种抑制α-葡萄糖苷酶的活性肽的制备方法、纯化方法及应用。本发明制备方法直接采用带壳的火麻籽粕进行酶
解，不需要先提取火麻蛋白提取，既能够简化操作流程，还提高了火麻籽粕的生物活性利用率，制备的活性肽抑制α-葡萄糖苷酶的活性高，且更有利于人体消化吸收。
8.为解决上述技术问题，本发明采用技术方案的基本构思是：
9.本发明的第一目的是提供一种从火麻籽粕中提取抑制α-葡萄糖苷酶的活性肽的制备方法，包括：取火麻籽粕，粉碎，过筛，加水混匀，调节ph值，加入蛋白酶，在一定温度下酶解，灭酶，离心，收集上清液，冷冻干燥，制备得到抑制α-葡萄糖苷酶的活性肽的冻干粉。
10.本发明提供的制备抑制α-葡萄糖苷酶的活性肽的方法，直接采用带壳的火麻籽粕进行酶解，不需要先提取火麻蛋白提取，既能够简化操作流程，还提高了火麻籽粕的生物活性利用率，提高了蛋白回收率和α-葡萄糖苷酶抑制率。另外，本发明方法条件温和，简单可控，具有生产应用前景。
11.进一步的方案，调节后ph值为7～11，酶解温度为45～75℃，酶解时间为1～12h；
12.优选的，调节后ph值为8～9，酶解温度为45～65℃，酶解时间为3-6h。
13.进一步的方案，所述的蛋白酶选碱性蛋白酶37071、碱性蛋白酶ab8000、中性蛋白酶ab7089、碱性蛋白酶ay50c、胰酶、胰蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、复合蛋白酶中的一种或多种；
14.优选的，所述的蛋白酶选自复合蛋白酶、胰酶、碱性蛋白酶ab8000、碱性蛋白酶ay50c、碱性蛋白酶37071、中性蛋白酶ab7089中的一种或多种；
15.优选的，所述的蛋白酶选自碱性蛋白酶37071或胰酶。
16.进一步的方案，所述蛋白酶的添加量为火麻籽粕质量的0.1wt％～2.0wt％；
17.优选的，蛋白酶的添加量为火麻籽粕质量的0.5wt％～1.5wt％；更优选1.0wt％。
18.进一步的方案，所述火麻籽粕与水的质量体积比为1：5～20g/ml。
19.进一步的方案，过筛的条件为60～100目筛；
20.优选的，所述的灭酶条件为在90～100℃下水浴10～15min；
21.优选的，所述离心的条件包括：4℃下，8000～10000rpm，离心5～15min。
22.本发明的第二目的是提供一种如上所述的制备方法制备的活性肽的分离纯化方法，包括：向得到的抑制α-葡萄糖苷酶的活性肽的冻干粉中加入乙醇溶液，混合均匀，于4℃下静置，离心，收集上清液，冷冻干燥，得到纯化的抑制α-葡萄糖苷酶的活性肽。
23.进一步的方案，所述乙醇溶液的体积浓度为20％-80％；优选60％-80％。
24.本发明采用一定体积浓度的乙醇溶液对粗酶解产物进行分级纯化，乙醇分级后醇溶组分有更高的疏水性氨基酸，实验发现，乙醇浓度越高，其分级得到的肽段越小，有利于人体消化吸收。
25.进一步的方案，静置1-2h，离心的条件为：4℃下以8000rpm离心10min。
26.本发明的第三目的是提供一种由以上方案所述的制备方法或分离纯化方法制备得到的抑制α-葡萄糖苷酶的活性肽，分子量小于《1kda的片段的重量比占90％以上；
27.优选的，含有重量占比为3％-4.5％的arg-leu(rl)，2.5％-4.0％的phe-val(fv)，2％-3.5％的ala-phe(af)以及1.2％-2.4％的phe-ile(fi)。
28.本发明制备的α-葡萄糖苷酶的活性肽产品，活性多肽大部分都是小于1000da的小分子肽类，达到90％以上，更有利于人体消化吸收。
29.本发明的第四目的是提供一种由以上方案所述的制备方法或分离纯化方法制备
得到的抑制α-葡萄糖苷酶的活性肽在制备用于降血糖的保健品或药品中的应用。
30.采用上述技术方案后，本发明与现有技术相比具有以下有益效果：
31.1、本发明提供的制备抑制α-葡萄糖苷酶的活性肽的方法，直接采用带壳的火麻籽粕进行酶解，不需要先提取火麻蛋白提取，既能够简化操作流程，还提高了火麻籽粕的生物活性利用率，提高了蛋白回收率和α-葡萄糖苷酶抑制率。
32.2、本发明酶解得到的抑制α-葡萄糖苷酶的活性肽产品抑制活性高，粗酶解液在浓度为25mg/ml的α-葡萄糖苷酶抑制活性可达70％以上，经过分级之后的酶解液在10mg/ml的浓度下α-葡萄糖苷酶抑制活性可达70％以上。
33.3、本发明制备的α-葡萄糖苷酶的活性肽产品，活性多肽大部分都是小于1000da的小分子肽类，达到90％以上，更有利于人体消化吸收，可以应用于制备降血糖的保健品或药品中。
34.下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的描述。
附图说明
35.附图作为本发明的一部分，用来提供对本发明的进一步的理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但不构成对本发明的不当限定。显然，下面描述中的附图仅仅是一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。在附图中：
36.图1是本发明试验例1中采用不同蛋白酶酶解效果比较示意图；
37.图2是本发明不同酶解时间对火麻籽粕酶解的影响结果示意图；
38.图3是本发明不同ph对火麻籽粕酶解的影响结果示意图；
39.图4是本发明不同温度对火麻籽粕酶解的影响结果示意图；
40.图5是本发明不同酶添加量对火麻籽粕蛋白酶解的影响结果示意图；
41.图6是酶解产物的分子量分布示意图；
42.图7是酶解产物的α-葡萄糖苷酶抑制曲线；
43.图8是酶解产物的总的离子流图；
44.图9是arg-leu的二级质谱图；
45.图10是phe-val的二级质谱图；
46.图11是phe-ile的二级质谱图；
47.图12是ala-phe的二级质谱图。
48.需要说明的是，这些附图和文字描述并不旨在以任何方式限制本发明的构思范围，而是通过参考特定实施例为本领域技术人员说明本发明的概念。
具体实施方式
49.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
50.一、实验仪器：电子分析天平al204(梅特勒-托利多国际股份有限公司)，恒温培养振荡器thz-82(杭州虹约精密仪器制造有限公司)，旋涡混合器xw-80a(上海精科实业有限
公司)，冷冻干燥机scientz-18n(宁波新芝生物科技股份有限公司)，自动定氮仪kdn-103f(上海纤检仪器有限公司)，消化炉hyp-308(上海纤检仪器有限公司)，高速冷冻离心机gl-21m(浙江赛德仪器设备有限公司)，磁力加热搅拌器78-1(常州澳华仪器有限公司)，电子天平exd-2202b(深圳市衡科仪器有限公司)，全波长酶标仪spectra max 190(美国molecular devices)
51.二、实验试剂：风味蛋白酶、复合蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶37071、复合蛋白酶，购自诺维信(中国)生物技术有限公司；ay50c、木瓜蛋白酶、嗜热菌蛋白酶，购自日本天野酶制品株式会社的；ab7089、ab8000购自德国ab公司；胰酶，购自东恒华道生物科技有限责任公司；α-葡萄糖苷酶、pnpg购自麦克林生物技术有限公司。
52.三、检测方法：
53.(1)体外α-葡萄糖苷酶抑制活性的检测
54.α-葡萄糖苷酶抑制率的测定在96孔微孔板上进行，首先添加50μl 0.1m的磷酸盐缓冲液(ph6.8)，再加入20μl的酶解液和10μlα-葡萄糖苷酶(1u/ml)，在37℃孵育10min。孵育后，加入20μl 5mm对硝基苯-α-葡萄糖苷溶液(pnpg)在37℃孵育20min，最后加入50μl 1m碳酸钠停止反应，于405nm处测吸光值，对于所有测试进行三次取平均值。
55.α-葡萄糖苷酶抑制率＝[1-(od
a-odb)/(od
0-odc)]
×
100％
[0056]
其中，oda、odb、od0和odc分别代表样品组的吸光值、样品背景的吸光值、无样品的吸光值和无样品空白组的吸光值
[0057]
(2)液质联用法鉴定活性肽
[0058]
使用ultimate3000-qexative高分辨率液质联用仪对样品进行分离和鉴定。流动性采用0.1％(v/v)的甲酸水溶液(a)和乙腈(b)组成，洗脱方法为：0-2min 95％a，5％b，2-32.00min55％a和45％b，32-40.00min 10％a和90％b，40-50.00min 95％a和5％b，流速为0.05ml/min，，进样量为2μl。分离后的肽段经液相色谱分离后，分流通过电喷雾界面，采用esi正离子扫描模式，扫描范围在100 1500m/z。采用高纯度氮气作为雾化气和干燥气，干燥温度为180℃，干燥气流速为4.0l/min。
[0059]
特定肽的含量等于其峰面积与液相-质谱的总峰面积的比值
×
100％。
[0060]
实施例1
[0061]
制备方法：
[0062]
(1)热榨火麻籽粕粉碎过60目筛，后称重50g；
[0063]
(2)过筛后的火麻籽粕中加入250ml水混匀，调节ph值为8后加入0.25g碱性蛋白酶37071，45℃恒温酶解3.5h，90℃水浴15min灭酶后，以4℃，8000r/min的条件离心15min后取上清液冷冻干燥，得到酶解产物的冻干粉。
[0064]
分离纯化方法：
[0065]
向酶解产物的冻干粉中添加食品级冷(4℃)60％(v/v)乙醇溶液分级酶解液，混合均匀后置于4℃冰箱中静置1h，于4℃下以8000rpm离心10min，离心后取上清液，得到富含α-葡糖糖苷酶抑制肽的酶解液。
[0066]
鉴定：将富含α-葡糖糖苷酶抑制肽的酶解液进行液-质分析，其arg-leu、phe-val、ala-phe和phe-ile含量分别为3.88％、3.73％、2.59％和1.73％。
[0067]
检测：分级后的酶解液在10mg/ml浓度下对α-葡萄糖苷酶的抑制活性为72.85％。
[0068]
实施例2
[0069]
制备方法：
[0070]
热榨火麻籽粕粉碎，过80目筛后称重50g；过筛后的火麻籽粕中加入1000ml水混匀，调节ph值为9后加入0.5g碱性蛋白酶37071，55℃恒温酶解6h，100℃水浴15min灭酶后以4℃，8000r/min的条件离心10min后取上清液冷冻干燥得到冻干粉。
[0071]
分离纯化方法：
[0072]
向酶解产物的冻干粉中添加食品级冷(4℃)80％(v/v)乙醇溶液分级酶解液，混合均匀后置于4℃冰箱中静置1h，于4℃下以8000rpm离心10min，离心后取上清液，得到富含α-葡糖糖苷酶抑制肽的酶解液。
[0073]
鉴定：将富含α-葡糖糖苷酶抑制肽的酶解液进行液-质分析，其arg-leu、phe-val、ala-phe和phe-ile含量分别为4.21％、3.62％、2.31％和1.37％。
[0074]
检测：分级后酶解液在10mg/ml浓度下对α-葡萄糖苷酶的抑制活性为82.85％。
[0075]
实施例3
[0076]
制备方法：
[0077]
热榨火麻籽粕粉碎，过100目筛后称重50g；过筛后的火麻籽粕中加入750ml水混匀，调节ph值为10后加入0.75g碱性蛋白酶37071，65℃恒温酶解1h，95℃水浴15min灭酶后以4℃，8000r/min的条件离心10min后取上清液冷冻干燥得到冻干粉。
[0078]
分离纯化方法：
[0079]
向酶解产物的冻干粉中添加食品级冷(4℃)70％(v/v)乙醇溶液分级酶解液，混合均匀后置于4℃冰箱中静置1h，于4℃下以8000rpm离心10min，离心后取上清液，得到富含α-葡糖糖苷酶抑制肽的酶解液。
[0080]
鉴定：将富含α-葡糖糖苷酶抑制肽的酶解液进行液-质分析，其arg-leu、phe-val、ala-phe和phe-ile含量分别为3.57％、3.15％、2.77％、2.12％。
[0081]
检测：分级后酶解液在10mg/ml浓度下对α-葡萄糖苷酶的抑制活性为84.89％。
[0082]
实施例4
[0083]
制备方法:
[0084]
热榨火麻籽粕粉碎，过60目筛后称重50g；过筛后的火麻籽粕中加入500ml水混匀，调节ph值为10后加入0.5g碱性蛋白酶37071，55℃恒温酶解3h，100℃水浴15min灭酶后以4℃，8000r/min的条件离心15min后取上清液冷冻干燥得到冻干粉。
[0085]
分离纯化：
[0086]
向酶解产物的冻干粉中添加食品级冷(4℃)80％(v/v)乙醇溶液分级酶解液，混合均匀后置于4℃冰箱中静置1h，于4℃下以8000rpm离心10min，离心取上清液，得到富含α-葡糖糖苷酶抑制肽的酶解液。
[0087]
鉴定：将富含α-葡糖糖苷酶抑制肽的酶解液进行液-质分析，分析得到其arg-leu、phe-val、ala-phe和phe-ile含量分别为3.97％、3.4％、2.95％和1.69％。
[0088]
检测：分级后酶解液在10mg/ml浓度下对α-葡萄糖苷酶的抑制活性为87.52％。
[0089]
试验例1不同原料酶解效果比较
[0090]
以带壳火麻籽粕及其所提蛋白、脱壳火麻籽粕及其所提蛋白为原料，采用碱性蛋白酶37071进行酶解，条件为料液比1：10，ph8.5，温度55℃，酶添加量1％，酶解6h，其他灭
酶、离心等条件参照实施例1，比较不同原料酶解液的蛋白回收率和抑制率。不同原料酶解结果见表1。
[0091]
表1不同原料的酶解效果
[0092][0093]
由表1可知，虽然由火麻籽粕所提蛋白作为原料酶解其蛋白含量更高，但是其酶解液的抑制活性并没有直接火麻籽粕酶解液的抑制活性高，其可能的原因：一方面，籽粕体系成分更复杂，其中多酚、多糖这些组分可能也在抑制活性的作用；另一方面带壳籽粕经过高温热榨处理，其发生了很多反应，相对于脱壳籽粕其成分更复杂。因此选用带壳火麻籽粕做下一步酶解优化研究。
[0094]
试验例2不同种类的酶的筛选
[0095]
选取碱性蛋白酶37071、碱性蛋白酶ab8000、中性蛋白酶ab7089、碱性蛋白酶ay50c、胰酶、胰蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、复合蛋白酶等十种酶，在底物浓度为10％，酶添加量为0.5％，ph和温度为各种酶最适条件下进行酶解，酶解3h之后取出，100℃灭酶10～15min后离心取上清液，测定酶解产物的蛋白回收率和α-葡萄糖苷酶抑制率。
[0096]
不同蛋白酶酶解产物的蛋白回收率和α-葡萄糖苷酶抑制率见图1。如图1所示，综合考虑这十种蛋白酶酶解产物的α-葡萄糖苷酶抑制率和蛋白质回收率，胰酶对火麻籽粕的酶解效果最佳，碱性蛋白酶37071次之，复合蛋白粉、碱性蛋白酶ab8000、碱性蛋白酶ay50c和中性蛋白酶ab7089再次之。从生产角度来说，综合考虑到成本控制问题，本发明选用碱性蛋白酶37071作为后续酶解工艺优化的关键酶。
[0097]
试验例3火麻籽粕酶解单因素实验
[0098]
本试验例中均采用碱性蛋白酶ns37071进行酶解，100℃灭酶10～15min后离心取上清液。
[0099]
(1)酶解时间对酶解产物的蛋白回收率和α-葡萄糖苷酶抑制率的影响
[0100]
选取底物浓度为10％，调ph至8.0，酶添加量为0.50％，在酶解温度为55℃的条件下，对火麻籽粕分别进行酶解1h、3h、6h、9h、12h，待酶解结束后测定酶解产物的蛋白回收率和α-葡萄糖苷酶抑制率。
[0101]
由图2可知，随着时间的延长，α-葡萄糖苷酶抑制率和蛋白回收率都存在一个先上升后下降的趋势，在酶解6h的时候蛋白回收率和α-葡萄糖苷酶抑制率都达到了较好水平，虽然，在12h的酶解效果可以和6h相媲美，但是考虑到成本问题，优先选择6h为下一步优化的基础。
[0102]
(2)酶解ph对酶解产物的蛋白回收率和α-葡萄糖苷酶抑制率的影响
[0103]
选取底物浓度为10％，酶添加量为0.50％，酶解温度为55℃，将ph分别调至7.0，8.0，9.0，10.0，11.0，对火麻籽粕进行酶解处理3h，待酶解结束后测定火麻籽粕酶解产物的
蛋白回收率和α-葡萄糖苷酶抑制率。
[0104]
如图3所示，随着ph的升高，蛋白回收率也是逐渐升高，但是α-葡萄糖苷酶抑制率在ph≤8的时候随ph升高而升高，在ph在9～10的时候反而下降，ph11的时候又有所升高，其主要原因是当ph大于9之后，酶解液经过离心后仍然处于浑浊状态，在此ph下既影响酶解液的使用，也影响酶解液抑制活性的测定。综合考虑之下，选择ph8作为下一步优化的基础。
[0105]
(3)酶解温度对酶解产物的蛋白回收率和α-葡萄糖苷酶抑制率的影响
[0106]
选取底物浓度为10％，调ph至8.0，酶添加量为0.50％，分别在37℃、45℃、55℃、65℃和75℃条件下对火麻籽粕进行酶解处理3h，待酶解结束后测定火麻籽粕酶解产物的蛋白回收率和α-葡萄糖苷酶抑制率。
[0107]
由图4可知，随着温度的升高，蛋白回收率存在先升高后降低的趋势，在55℃的时候由最高的回收率，而α-葡萄糖苷酶抑制率来看，在45-75℃都有较高的抑制率，且不同温度之间没有显著性差异，因此，考虑到功耗损失，优先选择55℃作为下一步酶解优化的基础。
[0108]
(4)酶添加量对酶解产物的蛋白回收率和α-葡萄糖苷酶抑制率的影响
[0109]
选取底物浓度为10％，调ph至8.0，酶解温度为55℃，分别在酶添加量为0.10％，0.60％，1.00％，1.50％，2.0％的条件下对火麻籽粕进行酶解处理3h，待酶解结束后测定火麻籽粕酶解产物的蛋白回收率和α-葡萄糖苷酶抑制率。
[0110]
由图5可知，随着酶添加量的增加，α-葡萄糖苷酶抑制率呈现先增加后降低的趋势，这是因为并不是酶添加量越多越好，适度酶解增加酶解产物的抑制活性，过度酶解效果反而变差；蛋白回收率随酶添加量增加而增加，综合考虑两者，选用1％的酶添加量进一步的优化。
[0111]
试验例4火麻籽粕蛋白酶解工艺的正交优化
[0112]
以蛋白回收率和α葡萄糖苷酶抑制率为指标，分别研究ph值、温度、时间、酶添加量的影响，在单因素实验的基础上，设计四因素三水平的正交实验，其因素-水平正交实验表如表2所示。
[0113]
表2火麻籽粕酶解因素-水平正交实验表
[0114][0115]
正交实验结果如下表3所示。
[0116]
表3火麻籽粕酶解正交实验结果
[0117]
[0118][0119]
由上表可知，影响酶解效果因素的主次关系：ph＞温度＞酶添加量＞时间，所选优方案为a2b2c2d2，在已做实验方案中a2b1c2d3，a3b3c2d1的综合评分比较高，同时方案a2b2c2d2在9个实验方案种并没有涉及，因此对a2b1c2d3、a3b3c2d1和a2b2c2d2三种实验方案重复实验验证，实验结果如表4。
[0120]
表4正交实验验证实验结果
[0121][0122]
分析可知，方案a2b1c2d3的蛋白回收率显著低于其他两个方案，而a3b3c2d1和a2b2c2d2两种方案并没有显著差异。综合考虑到成本控制，选择a2b2c2d2最佳酶解工艺，即料液比1：10，ph8，温度55℃，酶解6h。
[0123]
试验例5火麻籽粕酶解产物表征及理化性质分析
[0124]
对实施例2制备得到的火麻籽粕酶解产物进行如下检测：
[0125]
(1)火麻籽粕酶解产物短肽含量测定
[0126]
采用三氯乙酸-可溶性氮法(tca-nsi)计算短肽得率，具体方法如下：
[0127]
精确称取0.5g左右固体样品，置于小烧杯中，加入10ml10％三氯乙酸，磁力搅拌，溶解，定容至50ml容量瓶中，静置沉降30min后，4000rpm离心15min，取适量上清液测定蛋白质含量，计算火麻籽粕酶解产物的短肽得率。
[0128][0129]
(2)火麻籽粕酶解产物蛋白含量及水解度的计算
[0130]
参考国标中凯氏定氮法测酶解产物的蛋白含量。
[0131]
采用甲醛滴定法测酶解液的水解度，计算公式如下：
[0132]
水解度(dh)＝上清液中氨态氮含量/原料中的总氮含量
×
100％。
[0133]
结果：火麻籽粕酶解产物的蛋白回收率、水解度、短肽得率等基础指标见表5。
[0134]
表5酶解产物的基础指标
[0135][0136]
由表5可知，酶解产物的短肽得率都超过了90％，这说明经过酶解后的所得到的酶解产物大部分都是小分子多肽，这也与肽分子量分布所得结果相印证。
[0137]
(3)火麻籽粕酶解产物分子量分布测定
[0138]
采用hplc法测定火麻籽粕酶解产物的分子量分布情况。具体方法如下：配制5mg/ml的火麻籽粕酶解产物，0.22μm针式滤头过膜。选择色谱柱tskgel 2000swxl(7.8
×
300mm，250mm)，检测波长220nm，柱温30℃。流动相配置为乙腈：水：三氟乙酸＝20：80：0.01(v/v)，以0.5ml/min等度洗脱。标准品为：牛血清蛋白(mw 68000)，细胞色素c(mw12384)，抑酞酶(mw 6511.53)，杆菌肽(mw 1422.69)，谷胱甘肽(氧化型和还原型，mw分别为612.63和307.32)和双甘肽(132.12)，以标准分子量对数为纵坐标，洗脱时间为横坐标做回归方程，计算酶解产物的分子量分布。
[0139]
结果：火麻籽粕蛋白肽的分子量分布如表6和图6所示，经过6h酶解之后，多数大分子量片段被水解成小分子肽段，分子量＜5kda占99％，主要集中在《1kda片段，占90％以上。
[0140]
表6酶解产物的分子量分布
[0141][0142]
(4)火麻籽粕酶解产物氨基酸组成测定
[0143]
参照gb 5009.124-2016《食品安全标准食品中氨基酸的测定》的方法测定酶解产物的氨基酸组成。结果：酶解产物的氨基酸组成分析见表7所示。
[0144]
表7火麻籽粕酶解产物的氨基酸组成
[0145][0146]
如表7所示，酶解产物的氨基酸组成与前期所提火麻蛋白的氨基酸组成相似，其中glu，asp和arg含量最高，其次是leu。酶解产物种疏水性氨基酸占比分别为31.78％；相应的，酶解产物的必须氨基酸占比分别为27.37％。
[0147]
(5)火麻籽粕酶解产物半数抑制浓度ic
50
的计算
[0148]
将实施例2所得的冷冻干燥的火麻籽粕酶解产物，配制一系列浓度梯度的样品溶液(40，20，10，5，2.5，1.25，0.625mg/ml)，计算各自的抑制率，利用graphpad进行非线性曲线拟合计算酶解产物的ic
50
值。
[0149]
结果：火麻籽粕酶解产物的α-葡萄糖苷酶抑制活性测定结果如图7，结果显示α-葡萄糖苷酶抑制活性随着浓度的增大而升高，有很好的计量效应，通过计算机拟合计算得到其ic50值为2.755mg/ml，有非常优秀的α-葡萄糖苷酶抑制效果。
[0150]
试验例6火麻籽粕酶解产物的肽段分析
[0151]
将实施例2制备的热榨火麻籽粕的酶解上清液，采用检测方法中的液质联用法鉴定活性肽。总的离子流图如图8所示。其中，arg-leu(rl)、phe-val(fv)、phe-ile(fi)和ala-phe(af)的含量最高。arg-leu(rl)、phe-val(fv)、phe-ile(fi)和ala-phe(af)的二级质谱图分别如图9-12所示。
[0152]
以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽
然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。

技术特征：
1.一种从火麻籽粕中提取抑制α-葡萄糖苷酶的活性肽的制备方法，其特征在于，包括：取火麻籽粕，粉碎，过筛，加水混匀，调节ph值，加入蛋白酶，在一定温度下酶解，灭酶，离心，收集上清液，冷冻干燥，制备得到抑制α-葡萄糖苷酶的活性肽的冻干粉。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，调节后ph值为7～11，酶解温度为45～75℃，酶解时间为1～12h；优选的，调节后ph值为8～9，酶解温度为45～65℃，酶解时间为3-6h。3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述的蛋白酶选自碱性蛋白酶37071、碱性蛋白酶ab8000、中性蛋白酶ab7089、碱性蛋白酶ay50c、胰酶、胰蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、复合蛋白酶中的一种或多种；优选的，所述的蛋白酶选自复合蛋白酶、胰酶、碱性蛋白酶ab8000、碱性蛋白酶ay50c、碱性蛋白酶37071、中性蛋白酶ab7089中的一种或多种；优选的，所述的蛋白酶选自碱性蛋白酶37071或胰酶。4.根据权利要求1-3任意一项所述的制备方法，其特征在于，所述蛋白酶的添加量为火麻籽粕质量的0.1wt％～2.0wt％；优选的，蛋白酶的添加量为火麻籽粕质量的0.5wt％～1.5wt％；更优选1.0wt％。5.根据权利要求1-4任意一项所述的制备方法，其特征在于，所述火麻籽粕与水的质量体积比为1：5～20g/ml。6.根据权利要求1-5任意一项所述的制备方法，其特征在于，过筛的条件为60～100目筛；优选的，所述的灭酶条件为在90～100℃下水浴10～15min；优选的，所述离心的条件包括：4℃下，8000～10000rpm，离心5～15min。7.一种如权利要求1-6任意一项所述的制备方法制备的活性肽的分离纯化方法，其特征在于，包括：向得到的抑制α-葡萄糖苷酶的活性肽的冻干粉中加入乙醇溶液，混合均匀，于4℃下静置，离心，收集上清液，冷冻干燥，得到纯化的抑制α-葡萄糖苷酶的活性肽。8.根据权利要求7所述的分离纯化方法，其特征在于，所述乙醇溶液的体积浓度为20％-80％；优选的，静置1-2h，离心的条件为：4℃下以8000rpm离心10min。9.一种由权利要求1-6任意一项所述的制备方法或由7或8所述的分离纯化方法制备得到的抑制α-葡萄糖苷酶的活性肽，其特征在于，分子量小于<1kda的片段的重量比占90％以上；优选的，含有重量占比为3％-4.5％的arg-leu(rl)，2.5％-4.0％的phe-val(fv)，2％-3.5％的ala-phe(af)以及1.2％-2.4％的phe-ile(fi)。10.一种由权利要求1-6任意一项所述的制备方法或由7或8所述的分离纯化方法制备得到的抑制α-葡萄糖苷酶的活性肽在制备用于降血糖的保健品或药品中的应用。

技术总结
本发明公开了一种抑制α-葡萄糖苷酶的活性肽的制备方法、纯化方法及应用，制备方法包括：取火麻籽粕，粉碎，过筛，加水混匀，调节pH值，加入蛋白酶，在一定温度下酶解，灭酶，离心，收集上清液，冷冻干燥，制备得到抑制α-葡萄糖苷酶的活性肽的冻干粉；纯化方法包括：向得到的抑制α-葡萄糖苷酶的活性肽的冻干粉中加入乙醇溶液，混合均匀，于4℃下静置，离心，收集上清液，冷冻干燥，得到纯化的抑制α-葡萄糖苷酶的活性肽。本发明的方法既能够简化操作流程，还提高了火麻籽粕的生物活性利用率，制备的活性肽抑制α-葡萄糖苷酶的活性高，且有利于人体消化吸收，具有广泛的工业应用前景。具有广泛的工业应用前景。具有广泛的工业应用前景。


技术研发人员：邹节明 贾成刚
受保护的技术使用者：桂林三金药业股份有限公司
技术研发日：2021.12.31
技术公布日：2023/7/13