一步法检测25-OHVD含量的检测卡及试剂盒的制作方法

一步法检测25-oh vd含量的检测卡及试剂盒
技术领域
1.本发明涉及生物医学检测领域，尤其涉及一步法检测25-oh vd含量的检测卡及试剂盒。


背景技术：

2.维生素d是人体所必需的一种激素。维生素d通常是由暴露在紫外线b辐射下的皮肤或者从食物(包括补充剂)中获得的。在世界范围内，从天然膳食中获取的维生素d是有限的，因此对于大多数人来说，太阳光照射成为他们维生素d的主要产生方式，但这其中也有许多变量会影响到达皮肤的紫外线波长量及其有效性。基于上述原因，维生素d的缺乏是一个普遍现象。维生素d的缺乏不仅会影响人体对钙和磷酸盐的吸收，对骨骼的发育和重塑有直接和间接的影响，还会影响心血管系统(冠心病)、免疫系统(银屑病)、肌肉系统(肌萎缩症)、糖代谢(糖尿病)、生殖系统(多囊卵巢综合症)、神经系统(阿尔兹海默症)及肿瘤(主要是乳腺癌、前列腺癌和结肠癌)。
3.从食物中摄入的或在皮肤中产生的维生素d会被肝脏中的25-羟化酶转化为 25-羟基维生素d(25-oh vd)。25-oh vd是维生素d的主要活性代谢产物，也是维生素d在人体内的主要储存形式，因此，测量总的25-oh vd含量可以诊断及检测维生素d的缺乏。
4.由于25-oh vd的检测需求日益增加，这使得像体外诊断试剂这种方便快捷的检测方法的开发显得至关重要。目前，25-oh vd检测试剂盒所涉及的方法主要分为液相色谱-串联质谱法和免疫法(如，化学发光分析法、酶联免疫法、克隆酶供体免疫测定法、免疫层析法、胶乳免疫比浊法)两种。但是这两种检测方法，都存在各自的优劣势，具体如下：
5.1、液相色谱-串联质谱法是一种强大的分析技术，它将液相色谱的分离能力和质谱的高灵敏度选择性质量分析能力相结合，实现对复杂混合物更准确的定量和定性分析的方法。该方法测定干血点、血浆、血清样本中的25-oh vd，具有灵敏度高、分析快速、准确性好等特点，是临床监测维生素d的金标准。但是液相色谱-串联质谱法仪器昂贵，安装条件严格，需要场地较大；样品前处理复杂，检测通量比较低，比较难适应临床大批量样本的需求；手工操作比较复杂，操作人员需要经过比较专业的培训，因此难以得到推广。
6.2、化学发光分析法主要是依据化学发光检测体系中待测物浓度与体系的化学发光强度在一定条件下呈现线性定量关系的原理，利用仪器对体系化学发光强度进行检测，从而确定待测物含量的一种分析方法。化学发光分析法检测 25-oh vd具有检测周期短、灵敏度和自动化程度高等优点。但是该方法成本较高，且需要特定的化学发光仪，这导致其在25-oh vd的临床检测中应用范围较小。
7.3、酶联免疫法是将抗原和抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的检测方法。酶联免疫分析可分为直接法、间接法、双抗体夹心法和竞争法，一般采用竞争法原理对样本中的25-oh vd进行定量检测。酶联免疫法由于重复性不好，易出现假阳性，且操作繁琐，受干扰因素多等原因，而应用较少。
8.克隆酶供体免疫测定法是酶免疫分析技术自动化的成果，以竞争法的模式用于对
小分子物质的测定，即标记的抗原与样本中的抗原竞争结合特异性抗体，然后进行标记物的测定。该方法需要专用的全自动分析仪，因此也不适用于临床上的大规模推广。
9.4、胶乳免疫比浊法主要利用抗体标记的胶乳微球与抗原反应形成交联网结构，它会引起特定波长的吸光度发生改变，吸光度的变化与血清样本中的25-oh vd的含量呈正比。该方法参与反应的成分比较多，且是生物活性物质，如底物、酶、抗体等，由于涉及抗体和酶的相互作用，抗体和酶等关键原材料筛选对于方法的建立至关重要，另一方面，各成分之间的比例协调对方法的线性、灵敏度有很大的影响。因此该方法的原材料筛选及配方开发都有较大的难度。同时，由于相关的酶、抗体要求较高，原料本身的获取不易，而进入生产端的检验难度也相应提高，因此也加大了该方法的研发及制造成本。
10.5、荧光免疫层析技术多采用竞争法原理设计，将预处理后含有待测组分的样本与荧光物标记的25-oh vd单克隆抗体结合，形成荧光物-抗体-抗原的复合物，在层析作用下，该复合物沿着硝酸纤维膜向前层析至检测线(t区/t线)，与t区包被的25-oh vd-bsa修饰抗原竞争结合。游离的荧光标记抗体层析至质控去(c区/c线)，与c区包被的二抗结合，形成荧光条带。在激发光源的作用下，荧光物质发射特定波长的荧光信号，荧光免疫分析仪复活荧光信号。由于样品中的25-oh vd与t区的修饰抗原呈竞争关系，因而t区荧光强度与样本中的25-oh vd浓度呈反比。普通荧光免疫层析法反映时间短，检测成本较低，对检测人员的要求不高，方便在临床上推广，但是存在灵敏度低、重复性差等问题。


技术实现要素：

11.有鉴于此，本发明所要解决的问题在于提供一种样品检测无需稀释、检测时间短、灵敏度高、检测成本低，且可快速检测人血清、血浆及全血样本中25
‑ꢀ
羟基维生素d(25-oh vd)的检测卡及试剂盒。
12.本发明从两个方面给出技术方案。
13.本发明的技术方案一如下：
14.一步法检测25-oh vd含量的检测卡，包括卡壳以及适配收纳在所述卡壳内的试纸条；所述试纸条包括样品垫、结合垫、反应板、吸收垫及pvc底板，所述pvc底板为长条状构造；所述样品垫、结合垫、反应板和吸收垫由左至右沿长度方向依次排列设置在pvc底板上；所述结合垫设有抗25-oh vd荧光标记抗体和羊抗鸡igy荧光标记抗体；所述反应板设有包被25-oh vd-bsa修饰抗原的检测线和包被鸡igy抗体的质控线。
15.一实施例中，所述结合垫上的抗25-oh vd荧光标记抗体含量为0.5mg，所述结合垫上羊抗鸡igy荧光标记抗体为1mg；优选，所述抗25-oh vd荧光标记抗体上设置有镧系元素螯合物荧光的标记修饰。
16.一实施例中，所述样品垫还需由样品垫处理液进行预处理；所述预处理步骤如下：
17.首先，将玻璃纤维棉材质制备的样品垫放入容器中；
18.其次，将样品垫处理液倒入容器内浸泡所述样品垫；
19.最后，将处理好的样品垫取出，放置于洁净干燥平整的晾架上。
20.优选地，所述样品垫处理液由牛血清白蛋白1％、吐温-20 0.5％及0.2m硼酸硼砂缓冲液配制而成。
21.一实施例中，所述检测卡上，所述结合垫还需由标记抗体溶液进行预处理，所述预
处理的步骤如下：
22.首先，将玻璃纤维进行裁切，制得玻璃纤维材质的结合垫；
23.其次，制备包括检测线标记抗体溶液和质控线标记抗体溶液的标记抗体溶液；
24.最后，制作含标记抗体的结合垫。
25.一实施例中，所述检测卡上，所述反应板还需由包被工作液进行预处理；所述预处理包括步骤如下：
26.首先，轻轻揭开pvc底板上nc膜粘贴处的保护膜；
27.其次，用划膜仪将包被工作液在在反应板上划出检测线和质控线；
28.最后，反应板干燥后密封袋密封。
29.优选地，按照质量分数计，所述包被工作液中，除了25-oh vd-bsa修饰抗原和鸡igy抗体外，还包括pbs缓冲液和抗体包被稀释液，各组分及其配制工艺如下：
30.所述pbs缓冲液：氯化钠0.8％、氯化钾0.02％、磷酸氢二钠0.114％、磷酸二氢钾0.027％及余量纯化水配制成浓度为0.01m ph7.4的pbs缓冲液；
31.所述抗体包被稀释液：蔗糖1％及0.01m ph7.4pbs缓冲液配制。
32.一实施例中，所述检测卡上，所述检测线是由划膜仪将包被工作液划出；所述质控线是由划膜仪将质控线包被工作液划出；优选地，所述检测线包被线的制作步骤为：用抗体包被稀释液将25-oh vd-bsa修饰抗原稀释至1.0mg/ml，即得到检测线包被工作液；所述质控线包被工作液的制作步骤为：用抗体包被稀释液将鸡igy抗体稀释至1.0mg/ml，即得到质控线包被工作液。
33.本发明的技术方案二如下：
34.一步法检测25-oh vd含量的试剂盒，包括上述检测卡和检测芯片，所述检测芯片内存储有25-oh vd标定浓度与荧光强度标准曲线。
35.本发明提供一步法检测25-oh vd含量的试剂盒，具有检测范围宽 (5～100ng/ml)，灵敏度高(检测下限为5ng/ml)，准确度高(测定25-羟基维生素d国际标准品srm 972a，结果相对偏差不超过
±
15％，测定25-羟基维生素 d企业参考品，回收率不超过
±
15％)，检测时间短(15min)，且不需要对样品进行稀释，可直接进行检测等优点。
附图说明
36.图1为实施例1中检测卡的试纸条结构示意图；
37.图2为实施例1中检测卡的卡壳(已内含试纸条)条结构示意图。
具体实施方式
38.下面结合附图，对本发明的较佳实施例作进一步详细说明。
39.本发明提供的一步法检测25-oh vd含量的检测盒，通过时间分辨荧光免疫层析技术，采用一步法快速检测人血清、血浆及全血样本中25-羟基维生素d (25-oh vd)，无需进行样品稀释；其具有操作简单、检测时间段、灵敏度高、检测成本低等优点。本发明的检测基础是时间分辨荧光免疫层析技术的竞争法免疫反应。
40.具体实现技术方案如下。
41.一步法检测25-oh vd含量的试剂盒，包括检测卡和检测芯片；其中，检测卡由卡壳
及收纳于卡壳内的试纸条构成；检测芯片中内存检测25-oh vd含量的标准曲线数据。
42.如图1所示，上述检测卡中，所述试纸条包括样品垫1、结合垫2、反应板 3、吸收垫4、pvc底板5等组件构成。pvc底板5为长条状构造，是整个试纸条的基底；样品垫1、结合垫2、反应板3和吸收垫4由左至右沿长度方向依次排列设置在pvc底板5上；结合垫2设有抗25-oh vd荧光标记抗体和羊抗鸡igy 荧光标记抗体；反应板3设有包被25-oh vd-bsa修饰抗原的检测线6(又称t 线)和包被鸡igy抗体的质控线7(又称c线)，检测线6与质控线7间隔排列设置，并将反应板3分隔成三部分。
43.其中，样品垫1由玻璃纤维膜材质制得后，再由样品垫处理液处理；结合垫2由玻璃纤维膜材质制得后，再由标记抗体溶液处理；反应板3为硝酸纤维素膜材质制得，再由反应板3包被工作液处理；检测线由检测线包被工作液处理，质控线由质控线包被工作液处理。
44.上述样品垫包被处理液配制为：牛血清白蛋白1％，吐温-20 0.5％，0.2m硼酸硼砂缓冲液。样品垫的包被预处理具体操作如下：
45.首先，将玻璃纤维棉材质制备的样品垫放入容器中；
46.其次，将样品垫处理液倒入容器内浸泡所述样品垫；
47.最后，将处理好的样品垫取出，放置于洁净干燥平整的晾架上。
48.结合垫2上的25-oh vd抗体荧光微球上有镧系元素螯合物荧光标记修饰，荧光微球直径为200mm，激发波长为365nm，发射波长为610nm。
49.所述试纸条中，结合垫2上抗25-oh vd荧光标记抗体为0.5mg，羊抗鸡igy 荧光标记抗体为1mg。
50.本发明中，在制备结合垫2的过程中，需要将标记抗体溶液按照4.0μl/cm 的喷量，从喷金机中喷到结合垫2上。结合垫包被处理具体如下：
51.首先，将玻璃纤维8964进行裁切为(10
±
0.5)mm
×
(300
±
10)mm，制得玻璃纤维材质的结合垫；
52.其次，制备包括t线标记抗体溶液和c线标记抗体溶液的标记抗体溶液；
53.最后，制作含c线和t线的结合垫。
54.上述标记抗体溶液，如，抗25-oh vd荧光标记抗体和羊抗鸡igy荧光标记抗体分别由t线标记抗体溶液和c线标记抗体溶液1：1混合而成，除了含有抗 25-oh vd荧光标记抗体和羊抗鸡igy荧光标记抗体外，还包含有包括pbs缓冲液和抗体包被稀释液，各组分及其配制工艺如下：
55.所述0.2m硼酸硼砂溶液：由0.03m的硼砂和0.2m的硼酸按照3：7比例配制；
56.所述抗体包被稀释液：由蔗糖1％及0.01m ph7.4pbs缓冲液配制。
57.上述抗25-oh vd荧光标记抗体及羊抗鸡igy荧光标记抗体所涉及工作液中组分及其配制工艺如下：
58.所述标记缓冲液：2-吗啉乙磺酸(mes)1.067％及纯化水配制；
59.所述0.05m硼砂溶液：四硼酸钠1.907％及纯化水配制；
60.所述0.2m硼酸溶液：由硼酸1.237％及纯化水配制；
61.所述标记封闭液：血清白蛋白10％及纯化水配制；
62.所述标记活化液：1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(edc)2％及纯化水配制；
63.所述标记保存液：牛血清白蛋白2％、蔗糖2％、酪蛋白钠盐0.5％、海藻糖 5％、抑菌防腐剂(proclin 300)0.05％及0.2m 8.0tris缓冲液配制。
64.所述试纸条中，反应板3上检测线包被25-oh vd-bsa偶联抗原，质控线包被鸡igy抗体；25-oh vd-bsa偶联抗原浓度为1.0mg/ml，鸡igy抗体浓度为 1.0mg/ml。反应板的包被预处理具体如下：
65.首先，轻轻揭开pvc底板上nc膜粘贴处的保护膜；
66.其次，用划膜仪将包被工作液在反应板上划出检测线和质控线；
67.最后，反应板干燥后密封袋密封。
68.本发明实施例中，作为优选，样品垫1裁剪后的宽度应在22～24mm之间，长度应在290～310mm之间。结合垫2的宽度应在9.5～10.5mm之间，长度应在 290～310mm之间。反应板3的宽度应为25mm，长度应在295～305，mm之间。吸收垫4的宽度应为22～24mm之间，长度应在290～310mm之间。试纸条的宽度应在 3.80～3.90mm之间。
69.本发明中，在制备反应板3的过程中，除了检测线包被工作液和质控线包被工作液，反应板3上其他所用于包被工作溶液均以0.22μm孔径的微孔滤膜过滤。固体化学试剂溶解后发现细微杂质，若需加入其他液体成分，应以0.22μm 孔径的微孔滤膜过滤后再加入。
70.抗体包被稀释液：蔗糖1％，0.01m ph7.4pbs缓冲液配制。
71.上述试剂盒中，其内置的检测芯片上存储有25-oh vd标定浓度与荧光强度比值标准曲线，以国际标准品(编号：srm 972a)进行测试，建立标准曲线，对企业工作校准品赋值，用广州蓝勃生物科技有限公司的干式荧光免疫分析仪 (afs-1000)测试校准品，建立25-oh vd浓度标准曲线，输入到芯片内，用于 25-oh vd定量检测。本发明可实现单人份及小批量的检测，且每次无需重新制作标准曲线，无需大型仪器，不受场地限制，适合临床使用。
72.本发明提供的检测25-oh vd含量的试剂盒，具有检测范围宽(5～100ng/ml)，灵敏度高(检测下限为5ng/ml)，准确度高(测定25-羟基维生素d国际标准品 srm 972a，结果相对偏差不超过
±
15％，测定25-羟基维生素d企业参考品，回收率不超过
±
15％)，检测时间短(15min)，且不需要对样品进行稀释，可直接进行检测等优点。
73.下面以具体的实施例子来阐述本发明的细节，使本发明的目的、技术方法和优点更加清楚。
74.实例1
75.一步法检测25-oh vd的时间分辨荧光免疫层析检测卡
76.一步法检测25-oh vd含量的检测卡，包括试纸条，以及用于适配纳置试纸条的卡壳。
77.如图1所示，所述试纸条包括长条状的pvc底板5，在pvc底板5的上沿长度设置有样品垫1、结合垫2、反应板3和吸收垫4；其中，品垫1与结合垫2 的接触部分采用层叠扣压搭接，结合垫与反应板3一端的接触部分采用层叠扣压搭接；反应板3的另一端与吸收垫4接触部分采用层叠扣压搭接。
78.如图2所示，卡壳20的为长条状构造，与试纸条的构造相适配。该卡壳20 包括加样孔21和检测观察区22；加样孔21位于试纸条的样品垫1位置，而检测观察区22位于反应板3位置，用于观察试纸条检测后的变化状态。
79.试纸条中，各组件的具体制备如下。
80.1、样品垫制备与预处理
81.首先，采用玻璃纤维棉材质制得玻璃纤维棉材质构造的样品垫膜；
82.其次，开启浸纸压垫机电源，设置轮轴高度，左边千分尺的高度为9mm，右边千分尺的高度为9.5mm；其次将样本垫处理液倒入不锈钢储液容器内，溶液不能太满，以免溢出；其中，样品垫处理液由牛血清白蛋白1％、吐温-20 0.5％及 0.2m硼酸硼砂缓冲液配制而成；
83.最后，将处理好的样品垫取出，放置于洁净干燥平整的晾架上；将晾架放在温度(18～26)℃、相对湿度≤30％的环境，干燥过夜(16～24)h，裁剪后密封干燥保存。
84.2、结合垫制备与预处理
85.首先，将玻璃纤维8964裁为(10
±
0.5)mm
×
(300
±
10)mm，制得玻璃纤维材质的结合垫；其次，制备标记抗体溶液，包括t线标记抗体溶液和c线标记抗体溶液；最后，制作含c线和t线的结合垫。
86.t线标记抗体溶液：取一干净的2ml离心管，使用移液枪吸加入标记缓冲液mes 1ml；将荧光微球涡旋混匀，取固含量为1％的荧光微球100μl于标记缓冲液中，再次涡旋混匀；加入标记活化液100μl于上述离心管中，盖紧盖子，缓慢上下颠倒混匀10～20次；混匀完成后，将离心管按置于旋转混匀仪上旋转反应30min；待反应完成后，进行4℃离心；离心转速为10000rpm、离心时间为 30min；离心结束后，轻轻取出离心管，使用移液枪缓慢吸取上清；留取沉淀，使用移液枪吸取标记缓冲液mes 1000μl加入离心管中；用超声波细胞粉碎机按照90w超声，工作2s，间歇5s，重复3-5次的模式将其完全打散；加入50 μg抗25-oh vd标记抗体，然后上下颠倒混匀20次，置于旋转混匀仪上，旋转反应30min；旋转反应完成后，使用移液枪吸取标记封闭液100μl至上述离心管中，用超声波细胞粉碎机按照90w超声，工作2s，间歇5s，重复3-5次的模式将其完全打散；再次置于旋转混匀仪上，旋转反应2h；封闭完成后，进行4℃离心；离心转速为10000rpm、离心时间为30min；离心结束后，弃上清；留取沉淀，使用移液枪吸取标记保存液1ml加入离心管中，用超声波细胞粉碎机按照90w超声，工作2s，间歇5s，重复10次的模式将其完全打散；沉淀打散均匀后，将其移入10ml的离心管中，吸取标记保存液4ml清洗标记所用2ml离心管，清洗后将其移入10ml离心管中，涡旋混匀。
87.c线标记抗体溶液：取一干净的2ml离心管，使用移液枪吸取标记缓冲液 1ml；将荧光微球涡旋混匀，取固含量为1％的荧光微球100μl于标记缓冲液中，再次涡旋混匀；加入标记活化液100μl于上述离心管中，盖紧盖子，缓慢上下颠倒混匀10～20次；混匀完成后，将离心管按置于旋转混匀仪上旋转反应30min；待反应完成后，进行4℃离心；离心转速为10000rpm、离心时间为30min；离心结束后，轻轻取出离心管，使用移液枪缓慢吸取上清900μl-1000μl并弃去；留取沉淀，使用移液枪吸取标记缓冲液900μl-1000μl；用超声波细胞粉碎机超声3-5次将沉淀完全打散；加入80μg羊抗鸡igy标记抗体，然后上下颠倒混匀20次，置于旋转混匀仪上，旋转反应30min；旋转反应完成后，使用移液枪吸取标记封闭液100μl至上述离心管中，用超声波细胞粉碎机超声3-5次将沉淀完全打散；再次置于旋转混匀仪上，旋转反应2h；封闭完成后，进行4℃离心；离心转速为10000rpm、离心时间为30min；离心结束后，弃上清；留取沉淀，使用移液枪吸取标记保存液1ml加入离心管中，用超声波细胞粉碎机超声3-5次将沉淀完全打散；沉淀打散均匀后，将其移入10ml的离心管中，吸取标记保存液4ml清洗标记所用2ml离心管，清洗后将其移入10ml离心管中，涡旋混匀。然后将标记后的t、c线抗体按1：1(v：v)混合均匀，90w超声，工作2s，间歇5s，重复3次。
88.最后按照4.0μl/cm的喷量，将标记抗体溶液从喷金机中喷到剪裁后的结合垫上，并在温度(37
±
2)℃，湿度≤30％环境中里干燥过夜(16～24)h。取出干燥后的结合垫，放入适量干燥剂，密封于自封袋中。
89.3、反应板制备：首先，轻轻揭开pvc底板上nc膜(硝酸纤维素膜)粘贴处的保护膜，将反应板从左向右均匀推进，使其粘结牢固；其次，用包被工作液处理包被反应板；接着，用抗体包被稀释液将25-oh vd-bsa修饰抗原和鸡igy 分别稀释至1.0mg/ml，用划膜仪按照1μl/cm的划膜量，300mm的划膜长度在反应板3上划出t线6和c线7；t线6包被25-oh vd-bsa修饰抗原、c线7包被鸡igy。t线和c线的距离为(5
±
0.5)mm，c线与反应板3下缘的距离为 (10
±
0.5)mm，t线与反应板3上缘的距离为(10
±
0.5)mm，并在温度(37
ꢀ±
2)℃、湿度≤30％电热鼓风干燥箱中干燥(16～24)h。取出干燥后的反应板5，密封于自封袋中，放入适量干燥剂；其中，抗体包被稀释液是指用来稀释 25-oh vd-bsa修饰抗原和鸡igy抗体的溶液，而t线和c线包被工作液是指已用抗体包被稀释液稀释好25-oh vd-bsa修饰抗原(t线)和鸡igy抗体(c线) 的工作液。
90.4、试纸条组装：在温度(18～26)℃、湿度≤30％的环境下。将pvc低板5 平铺于工作台面上，轻轻揭开反应板3上吸收垫2粘贴处的保护膜，将吸收垫4 粘附于其上，粘贴时应轻轻操作并均匀滚动推进，避免产生划痕或气泡，确保吸收垫上方与底板的顶端对齐，另一侧则部分覆盖在反应板3(nc膜)上2～3mm。接着轻轻揭开pvc板5上方的结合垫2和样品垫1粘贴处的保护膜，将结合垫2 粘附于其上端，粘贴时应轻轻操作并均匀滚动推进，避免产生划痕或气泡，确保结合垫2正面朝上且结合垫一端覆盖在nc膜上1～2mm，将样品垫2粘附于结合垫2上，粘贴时应轻轻操作并均匀滚动推进，避免产生划痕或气泡，确保样品垫1下端与pvc底板5及样品垫1粘贴处对齐，并且确保样品垫1上端覆盖在结合垫2上。最后将粘贴好的试纸条适配纳入制作好的卡壳20内，制得检测卡，将该检测卡放入铝箔袋，并加入干燥剂，封口机封口。
91.5、裁切与封装：将准备好的检测卡切条，将每一试纸条装入荧光卡壳下盖中，装好后，盖上上盖，置于压卡机上，调整压壳机高度为3.5mm，使荧光卡壳上下盖紧密结合。
92.实例2
93.一种一步法检测25-oh vd含量的检测芯片的制备
94.1、所述芯片的制备：
95.准备曲线数据：取25-oh vd企业校准品(s1～s6)，按照试剂说明书进行操作；在蓝勃afs-1000干式荧光免疫实验管理工具上依次选择信号测试-重复性测试，点击新建重置页面，然后点击测试即可进行测试操作，将每一浓度的样本重复检测3次，计算测试得出t/c值的均值。将配制浓度与相对应的t/c均值作为线性数据。
96.2、配制芯片数据：
97.在蓝勃afs-1000干式荧光免疫实验管理工具上，选择项目参数，使用新建或编辑进行相关参数的设置，编辑完成确认无误后点击保存，项目参数设置完毕。在蓝勃afs-1000干式荧光免疫实验管理工具上，选择测试实验，点击新建，选择项目25-oh vd，填写实验编号，点击确定，完成新建实验。在蓝勃afs-1000 干式荧光免疫实验管理工具上，选择曲线生成，在左侧实验列表中选择上一步新建的实验；将第一步准备的曲线数据填入表格中，数据填入后依次点击自动选中-自动排序-保存；保存完成后选择反应值变换为取对数、小数位
数为4，选择浓度变换为取对数、小数位数为2，选择拟合算法为mmf model四参数增长曲线拟合，确认无误后，点击拟合；拟合后会在右边拟合结果处显示r值以及曲线，确定拟合结果准确后完成曲线制备。在蓝勃afs-1000干式荧光免疫实验管理工具上，选择生成id文件，在左侧项目列表中选择本次新建的项目，在基本参数区、子项参数区以及曲线数据处会自动显示上述步骤所设置完成的各项参数；审核各项参数确保无误后，在基本参数区依次设定生产年、生产月以及批次，设定完成后会在条形码处自动生成条形码，确认条形码是否准确；确认无误后点击生成id文件，弹出数据转移界面，点击确认，完成芯片数据配置
98.3、芯片烧制：
99.返回桌面，选中蓝勃afs-1000干式荧光免疫实验管理工具，点击鼠标右键，选择打开文件位置。双击item文件夹。在item文件中找到最新生成的与条码数据相对应的hex文件。将上述芯片数据文件于编程器中烧出2-3个芯片，在已开权限的蓝勃单通道荧光分析仪读取芯片数据，验证数据是否已成功写入以及确定以下信息是否有误。数据及参数确认无误后，即可大批量烧制芯片。
100.实例3
101.检测25-oh vd含量的试剂盒的操作方法
102.具体操作如下：
103.1)打开仪器，插入与试剂批号相同的芯片；
104.2)测试前试剂、样本应平衡至室温，测试应在室温下进行；
105.3)打开铝箔袋，取出检测卡，水平放置于桌面上；
106.4)用移液器吸取样本100μl，加入到检测卡的加样孔中；
107.5)在配套仪器上选择样本类型“血浆、血清”；
108.6)即时测试：待室温反应15min后，将检测卡放入仪器卡槽中，选择“即时测试”模式，点击“测试”；标准测试：将检测卡放入仪器卡槽中，选择“标准测试”模式，点击“测试”，仪器自动计时，计时结束后，自动测试并显示结果；
109.7)点击“打印”，可打印检测结果报告。
110.应当理解的是，上述针对本发明较佳实施例的表述较为详细，并不能因此而认为是对本发明专利保护范围的限制，本发明的专利保护范围应以所附权利要求为准。

技术特征：
1.一种一步法检测25－oh vd含量的检测卡，其特征在于，该检测卡包括卡壳以及适配收纳在所述卡壳内的试纸条；所述试纸条包括样品垫、结合垫、反应板、吸收垫及pvc底板，所述pvc底板为长条状构造；所述样品垫、结合垫、反应板和吸收垫由左至右沿长度方向依次排列设置在pvc底板上；所述结合垫设有抗25－oh vd荧光标记抗体和羊抗鸡igy荧光标记抗体；所述反应板设有包被25－oh vd－bsa修饰抗原的检测线和包被鸡igy抗体的质控线。2.根据权利要求1所述的检测卡，其特征在于，所述结合垫上的抗25－oh vd荧光标记抗体含量为0.5mg，所述结合垫上羊抗鸡igy荧光标记抗体为1mg。3.根据权利要求1所述的检测卡，其特征在于，所述样品垫还需由样品垫处理液进行预处理；所述预处理步骤如下：首先，将玻璃纤维棉材质制备的样品垫放入容器中；其次，将样品垫处理液倒入容器内浸泡所述样品垫；最后，将处理好的样品垫取出，放置于洁净干燥平整的晾架上。4.根据权利要求3所述的检测卡，其特征在于，所述样品垫处理液由牛血清白蛋白1％、吐温－20 0.5％及0.2m硼酸硼砂缓冲液配制而成。5.根据权利要求1所述的检测卡，其特征在于，所述结合垫还需由标记抗体溶液进行预处理，所述预处理的步骤如下：首先，将玻璃纤维进行裁切，制得玻璃纤维材质的结合垫；其次，制备包括检测线标记抗体溶液和质控线标记抗体溶液的标记抗体溶液；最后，制作含标记抗体的结合垫。6.根据权利要求1所述的检测卡，其特征在于，所述反应板还需由包被工作液进行预处理；所述预处理包括步骤如下：首先，轻轻揭开pvc底板上nc膜粘贴处的保护膜；其次，用划膜仪在将包被工作液在反应板上划出检测线和质控线；最后，反应板干燥后密封袋密封。7.根据权利要求6所述的检测卡，其特征在于，按照质量分数计，所述包被工作液中包括pbs缓冲液和抗体包被稀释液，各组分及其配制工艺如下：所述pbs缓冲液：氯化钠0.8％、氯化钾0.02％、磷酸氢二钠0.114％、磷酸二氢钾0.027％及余量纯化水配制成浓度为0.01m ph7.4的pbs缓冲液；所述抗体包被稀释液：由蔗糖1％及0.01m ph7.4pbs缓冲液配制。8.根据权利要求6所述的检测卡，其特征在于，所述检测线是由划膜仪将所述检测线包被工作液划出；所述质控线是由划膜仪将质控线包被工作液划出。9.根据权利要求8所述的检测卡，其特征在于，所述检测线包被线的制作步骤为：用抗体包被稀释液将25－oh vd－bsa修饰抗原稀释至1.0mg/ml，即得到检测线包被工作液；所述质控线包被工作液的制作步骤为：用抗体包被稀释液将鸡igy抗体稀释至1.0mg/ml，即得到质控线包被工作液。10.一步法检测25－oh vd含量的试剂盒，其特征在于，包括检测芯片及权利要求1至9任一所述的检测卡；所述检测芯片内存储有25－oh vd标定浓度与荧光强度比值标准曲线。

技术总结
本发明公开了一种一步法检测25－OH VD含量的检测卡及试剂盒；该检测卡所述试纸条包括样品垫、结合垫、反应板、吸收垫及PVC底板，PVC底板为长条状构造；样品垫、结合垫、反应板和吸收垫由左至右沿长度方向依次排列设置在PVC底板上；结合垫设有抗25－OH VD荧光标记抗体和羊抗鸡IgY荧光标记抗体；反应板设有包被25－OH VD－BSA修饰抗原的检测线和包被鸡IgY抗体的质控线；试剂盒包括检测卡和检测芯片；本发明试剂盒，具有检测范围宽，灵敏度高，准确度高，检测时间短，且不需要对样品进行稀释，可直接进行检测等优点。接进行检测等优点。接进行检测等优点。


技术研发人员：潘秀华 蒋析文 齐文闯 刘双 温润琪
受保护的技术使用者：广州达安基因股份有限公司
技术研发日：2021.12.31
技术公布日：2023/7/13