一种通用型CAR-T细胞的制备方法及其应用与流程

一种通用型car-t细胞的制备方法及其应用
技术领域：
：1.本发明属于细胞生物学、分子生物学以及药物研发
技术领域：
：，具体涉及通用型car-t细胞的制备方法及其应用。
背景技术：
：：2.car-t免疫疗法通过基因工程改造患者自体t淋巴细胞，使其表达嵌合抗原受体，能够有效克服肿瘤细胞通过下调mhc分子表达以及降低抗原递呈等免疫逃逸，使得肿瘤细胞无处逃逸。目前，两种国内获批的带有嵌合抗原受体(car)的t细胞产品均来自自体t细胞，这些被批准用于临床的自体car-t细胞必须在定制的基础上产生。但由于昂贵的生产费用和漫长的生产过程，这种自体t细胞生产平台仍然是大规模临床应用的重要限制因素，此外还存在生产失败等风险。同时，个性化、定制的自体car-t细胞生产过程也限制了在不同肿瘤类型上的广泛应用。因此，需要通用型同种异体t细胞来制备通用型car-t细胞，这些细胞可以作为“现成的”即用型治疗剂，用于大规模临床应用。通用型car-t细胞能够显著缩短治疗周期同时降低成本，移植物排斥相关反应与疗效问题通过基因编辑技术与干细胞移植供体来源t细胞等策略亦能逐步解决，因此未来的市场竞争也更有优势。3.通用型car-t细胞是以健康供者的外周血中提取的t细胞为起始样品，利用基因编辑技术解决同种异体之间的免疫排斥问题，并同时在t细胞上装上特异靶向癌症靶点的car结构，最终可用于回输到同种异体癌症患者体内特异性靶向肿瘤细胞的一种异体移植活细胞药剂。基因组编辑技术，包括zfn(锌指核酸酶)，talen(转录激活因子样效应核酸酶)和crispr相关技术被用于制备通用t细胞。目前行业内常规操作方法大同小异，均以基因编辑的形式敲除同种异体t细胞中可引起强烈免疫排斥反应的tcr分子及/或mhc相关分子，达到解决免疫排斥的问题；此外，大多数机构为提高治疗效果或安全性，在此类基因编辑的基础上，进一步敲除pd-1、ctla-4、cd52或加入car自杀基因开关等。4.这种操作形式理论上可行性较强，但目前没有任何相关文献详细解析出缺失trc或mhc分子后的t细胞在细胞存续和功能上的影响。这也是目前行业内均面临的一大困境的原因之一，这种制备方式生产的通用型car-t细胞体内存续较差，即使加大回输剂量或增加回输次数也很难达到理想的治疗效果，而自体car-t细胞回输剂量相对低一些，且缓解率更高，造成这种结果的可能因素很多，tcr作为t细胞进行免疫相关各种机能的关键基因，是否在t细胞的其他功能上起到关键性或决定性的辅助作用，暂无相关研究明确指出。但通用型car-t细胞可以实现的即用型、现货类、治疗成本低等优势是自体car-t细胞无法实现的。因此，制备通用型t、car-t很有必要。技术实现要素：5.本发明的目的之一在于提供一种t细胞，所述的t细胞为car-t细胞的制备提供一种新思路。6.为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：7.t细胞，所述t细胞的cd4基因和/或cd8基因被敲除和/或失活。8.发明中部分所用靶点序列如seqidno.1-11展示，该序列不仅限于此处展示的序列，且包含人体12号染色体上cd4基因:6,789,528-6,820,799forwardstrand中,人体2号染色体上cd8a基因:86,784,610-86,808,396reversestrand中以及人体2号染色体cd8b基因:86,815,339-86,861,924reversestrand中；基因编辑靶点所在位置表1(table1)展示所包含的任一区域内可对基因本身造成缺失的靶点序列。9.进一步，所述t细胞经过基因编辑获得。10.进一步，所述t细胞经过天然分离获得。11.进一步，所述的t细胞还使β2-微球蛋白、和/或hla-i类分子共同亚基、和/或ciita的基因失去功能或缺失。12.进一步，所述t细胞为同种异体t细胞。13.进一步，所述的t细胞还表达hla-e和/或hla-g和/或hla-f。14.本发明的目的之二在于提供制备t细胞的方法及该方法下所得的细胞。15.为实现上述目的，本发明的技术方案为：16.所述的t细胞的制备方法，利用基因编辑技术敲除和/或失活t淋巴细胞中的cd4基因或/和cd基因。17.进一步，所述制备方法中，所述t细胞为活化的和/或非活化的t淋巴细胞。18.进一步，所述制备方法中，所述的t细胞中的cd4基因和/或cd8基因的敲除或失活时机为：在t细胞扩增之后，或在t细胞扩增之前。19.进一步，所述制备方法中，所述的基因编辑技术是通过电转的方式或非电转的方式改造t细胞。20.进一步，所述基因编辑技术包括cas9、zfn、talen。21.同时，技术方案中保护目的之二的制备方法下所得的t细胞。22.本发明的目的之三在于提供一类供治疗的car-t细胞。23.为实现上述目的，本发明的技术方案为：24.由所述的t细胞制备的car-t细胞。25.进一步，所述的car-t细胞中car包含有胞外域、跨膜域和胞内信号域。26.进一步，所述car-t细胞为同种异体car-t细胞。27.进一步，所述car-t细胞还表达膜结合的il15。28.进一步，所述car-t细胞还表达分泌细胞因子，所述细胞因子包括il2、il7、il12、il21、il15。29.进一步，所述car-t细胞还表达且可识别肿瘤微环境中分子的融合蛋白，所述融合蛋白的胞外结构识别pd1、pdl1、sirpγ、sirpδ、tigit。30.进一步，所述car-t细胞中所述car结构可被调控活化或失活，所述调控活化或失活的结构包括peptideneo-epitope(pne)、fluorescein(fitc)、10aminoacids(5b9tag)、fitc-hm-3bifunctionalmolecule(fhbm)andscfv、leucinezipfvlinkedtoantibody、streptavidin2(msa2)biotin-bindingdomain，这些分子可以被连接到car的抗体或zipcar结构识别，导致car-t细胞的信号通路的诱导和激活。这类系统通过改变与抗体相连的开关分子的数量来控制car-t细胞的活性。31.进一步，所述car-t细胞可以识别实体瘤、血液系统肿瘤细胞/组织；所述car-t细胞的抗原识别区可以识别包含抗原：cd19、cd20、cd22、cd33、cll-1(clec12a)、cd7、cd5、cd70、cd123、ceacam5、ceacam6、ceacam7、mesothelin、muc1、cldn18.2、cdh17、trop2、bcma、nkg2d、pdl1、egfr、egfrviii、psca、psma、muc16、cd133、gd2、il13r2、b7h3、her2、cd30、slamf7、cd38、gpc3、wt1或tag-72。32.本发明中car-t细胞结构的铰链区序列可以来源于：igg、cd8、cd7、cd4。33.本发明中所述car-t结构中的跨膜区序列可以来源于：cd8、cd28、cd3ε、cd4、cd16、cd137、cd80以及cd86。34.本发明中所述car-t结构中的胞内信号区可来源于：cd3、cd137、cd28、cd27、ox40、icos、gitr、cd2、cd40、pd-1、pd1l、b7-h3、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1)、icam-1、cd7、nkg2c、cd83、cd86以及cd127。35.本发明所述抗原识别区可以为识别靶抗原的配体/受体；scfv可以是鼠源抗体或全人源抗体或人鼠嵌合抗体的scfv，也可以是鲨鱼、羊驼或骆驼抗体等单域抗体，也可以是双特异性抗体，也可以是人工设计的识别特定靶点的靶点特异性纤连蛋白iii型(fn3)结构域组合。36.本发明的目的之四在于提供制备car-t细胞的方法，该方法操作简单。37.所述的car-t细胞的制备方法，选用以下两种任一方法获得目的细胞：38.方法1：活化敲除或失活cd4和或cd8基因的t细胞后感染包含car结构的病毒，对感染car结构后的t细胞进行rnp电转，最后获得目的细胞；或39.方法2：活化敲除或失活cd4和或cd8基因的t细胞后电转rnp该t细胞后，再感染包含car结构的病毒，最后获得目的细胞。40.本发明的目的之五在于提供重组载体，该重组载体可以用于制备car-t细胞。41.为实现上述方案，本发明的技术方案为：42.制备(感染)所述的car-t细胞的重组载体，所述重组载体包含car结构。43.进一步，所述重组载体包含cd44基因功能片段。44.进一步，所述重组载体中选用表达载体为慢病毒表达载体、逆转录病毒表达载体、腺病毒表达载体、腺相关病毒表达载体、dna载体、rna载体、质粒中的任一种。45.本发明的目的之六在于提供细胞组合物，该组合物中聚集了较多的功能细胞。46.为实现上述目的，本发明的技术方案为：47.含有所述的t细胞或所述的car-t细胞的细胞组合物。48.进一步，所述细胞组合物中含有的所述t细胞或所述car-t细胞的比例以数量计不低于60％。49.进一步，所述细胞组合物中含有的所述t细胞或所述car-t细胞的比例以数量计不低于70％。50.进一步，所述细胞组合物中含有的所述t细胞或所述car-t细胞的比例以数量计不低于80％。51.进一步，所述细胞组合物中含有的所述t细胞或所述car-t细胞的比例以数量计不低于90％。52.进一步，所述的细胞组合物可以是经过活化诱导的cik细胞或nkt细胞。53.进一步，所述细胞组合物中失活cd4基因和cd8基因的t淋巴细胞表达嵌合抗原受体。54.进一步，所述细胞组合物中t淋巴细胞包含nkt细胞。55.本发明的目的之七在于提供所述t细胞、所述的重组载体或所述car-t细胞或所述细胞组合物的应用，该应用为临床治疗疾病提供了新的思路。56.为实现上述目的，本发明的技术方案为：57.所述的t细胞、所述的car-t细胞、或所述的细胞组合物在制备细胞治疗药物中的应用。58.进一步，所述的应用中，所述的t细胞、所述的car-t细胞、或所述的细胞组合物在制备治疗急性淋巴样白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胰腺癌、肺癌、肾癌、肝癌、脑癌和/或皮肤癌的药物中的应用。59.制备治疗性t-细胞或car-t细胞时，cd4基因的抑制剂、敲除剂和/或cd4基因的抑制剂、敲除剂作为细胞增殖剂、活力提升剂、表型分布改良剂、衰竭标志物表达抑制剂中的应用。60.本发明所述car结构可以是常规的第一代、第二代、第三代car结构，也可以是改进的双car、可调控car结构(如frb/fkbp12调控)等新型car结构。61.本发明所述car结构包含天然杀伤细胞受体(nkr)的一种或多种组分，因而形成nkr-car。nkr组分可以是来自以下任何天然杀伤细胞受体的跨膜结构域、铰链结构域或胞质结构域：杀伤细胞免疫球蛋白样受体(kir)，例如kir2dl1、kir2dl2/l3、kir2dl4、kir2dl5a、kir2dl5b、kir2ds1、kir2ds2、kir2ds3、kir2ds4、dir2ds5、kir3dl1/s1、kir3dl2、kir3dl3、kir2dp1和kir3dp1；天然细胞毒性受体(ncr)，例如，nkp30、nkp44、nkp46；免疫细胞受体的信号传导淋巴细胞活化分子(slam)家族，例如，cd48、cd229、2b4、cd84、ntb-a、cra、blame和cd2f-10；fc受体(fcr)，例如，cd16、和cd64；和ly49受体，例如，ly49a、ly49c。所述的nkr-car分子可以与衔接分子或胞内信号结构域(例如，dap12)相互作用。62.本发明中的car-t可以采用专利201710305078.8、201710613317.6、201710618293.3、201510304389.3、201510648252.x、201810207761.2、201810934637.6、201811125906.0、201910407001.0、202010257762.5、202010259458.4、202010260805.5、202010260849.8、202010559366.8、202110556147.9以及其他公开的car-t结构中，此类双阴性通用型car-t细胞疗法的应用可适用于任意一种car结构或靶点，即不受car靶点、结构的限制，均不表达cd4和cd8基因的t细胞都不影响任何car结构的表达。63.本发明所述慢病毒载体选自基本上由以下组成的群组：人免疫缺陷病毒1(hiv-1)、人免疫缺陷病毒2(hiv-2)、维斯纳-梅迪病毒(visna-maedivirus，vmv)病毒、山羊关节炎-脑炎病毒(caev)、马传染性贫血病毒(eiav)、猫免疫缺陷病毒(fiv)、牛免疫缺陷病毒(biv)和猿猴免疫缺陷病毒(siv)。64.本发明中所使用的基因编辑技术包含且不仅限于：crispr系列技术(cas9、cpf1)、zfn、talen，文中所述双阴性通用型t细胞可通过任意一种基因编辑技术获取。65.本发明中的同种异体t细胞是指经过基因编辑技术使cd4和cd8基因失活的并且可用于同种异体治疗特定适应症的t细胞。66.本发明中的药物组合物，可与化疗类药物、其他肿瘤靶点单克隆抗体类药物、抗体-药物偶联物(adc)、免疫检查点抑制剂类药物、小分子药物中的一种或多种组合用药。67.本发明中的du-car-t指的是敲除或cd4和或cd8基因的通用型car-t细胞68.本发明的有益效果在于：69.1、本发明提供的du-car-t细胞(所述t细胞)，不仅可以有效地表达于t淋巴细胞，而且能够加强car-t细胞的活性，增强car-t有效性，并且使car-t细胞有更优的表型，更低的衰竭表达，提高car-t细胞针对肿瘤靶细胞的杀伤，能够用于肿瘤的靶向治疗。70.2、本发明提供了一种可选择的通用型car-t细胞候选细胞，不仅可以在体内、外有效杀伤肿瘤靶细胞，用于肿瘤的靶向治疗，并且有高于传统自体car-t细胞和传统通用型car-t细胞的抗肿瘤效果。71.3、本发明提供的通用型car-t细胞，与传统通用型car-t细胞一样，在体外仅发生较低的gvh反应，可以用于制备同种异体car-t治疗，对car-t的临床应用以及肿瘤联合治疗新策略的开发具有重要的指导意义。72.4、本发明提供的方法制备的du-car-t细胞与天然的dn-t或由其制备的dn-car-t细胞比，我们发明的du-car增值能力更强，活力更高、表型分布更良好、衰竭标志物表达更低、体外药效更优，有极其显著性统计学差异；同时我们的细胞也易于获取，同样起始量的pbmc，最终获取的有效细胞远高于dn-car-t细胞，这大大缩减了生产成本，为其临床应用提供了更多可能性。附图说明73.图1为敲除率检测结果；74.图2为car阳性率检测结果；75.图3为体外药效学检测结果；76.图4为流式细胞仪检测结果；77.图5为衰竭标志物检测结果；78.图6为gvh强度检测结果；79.图7为体内药效检测结果；80.图8为流式检测结果；81.图9为流式检测结果；82.图10为体外药效学检测结果；83.图11为因子检测结果；84.图12为增值和活力检测结果；85.图13为表型检测结果；86.图14为衰竭标志物检测结果；87.图15为活化标志物检测结果。具体实施方式88.本实施例中的磁珠分选采用生物素标记的cd4和cd8抗体并偶联抗生物素的microbeads，或采用cd4和cd8阳性磁珠，过柱分选，此外，采用流式分选仪器或其他可获得需要部分的方式进行分选均可，最后选择需要部分即可。流式检测敲除效率和分选纯度所用抗体：cd3：pe-cy7、cd4：fitc、cd8：bv510。89.本专利中所使用的car的结构：胞外识别区(抗cd19scfv)-cd8来源铰链-cd8来源跨膜-胞内信号(cd137-cd3)，氨基酸序列如seqidno:12所示。90.缩写序列为[0091]“diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqdiskylnwyqqkpgkaprlliyhtsrlhsgvpsrfsgsgsgtdytltisslqpedfatyycqqgntlpytfgggtrleikgstsgsgkpgsgegstkgqvqlqesgpglvkpsqtlsltctvsgvslpdygvswirqppgkalewlgviwgsettyynsslktrltiskdnsknqvvltmtnmdpvdtatyycakhyyyggsyamdywgqgssvtvssletttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr”[0092]实施例1.t细胞中的cd4基因和cd8基因敲除结果[0093]采用lonza电转仪器或neon等其他电转仪器，选择适合电转t细胞电转程序。cas9蛋白：sgrna摩尔比例为1:2或其他适合比例均可，rnp需体外孵育数分钟，并与电转buffer重悬的适量t细胞混合均匀转入电转杯，进行电转；完成电转并转入含适量培养基的培养瓶中继续培养。电转后72h即可孵育带可检测荧光标记的cd4或cd8流式抗体并进行流式检测敲除效率。图1为展示的所用靶点中，部分敲除效率的展示，不同条件下其他靶点亦可能产生较好敲除效果或更好的敲除效果，敲除cd4和cd8的基因区域内的可对基因本身造成缺失的靶点序列都可以。[0094]发明中部分所用靶点序列如seqidno.1-11展示，该序列不仅限于此处展示的序列，任何敲除cd4和cd8的基因区域内的可对基因本身造成缺失的靶点序列都可以，且包含人体12号染色体上cd4基因:6,789,528-6,820,799forwardstrand中,人体2号染色体上cd8a基因:86,784,610-86,808,396reversestrand中以及人体2号染色体cd8b基因:86,815,339-86,861,924reversestrand中；基因编辑靶点所在位置表1展示及以下展示所包含的任一区域内可对基因本身造成缺失的靶点序列，cd4和cd8的基因图谱信息如表3表4和表5。[0095]table1[0096]序列id序列名称序列seoidno.1sg4-1tgaaccggggagtcccttttseoidno.2sg4-2cccttttaggcacttgcttcseoidno.3sg4-3agtggtgctgggcaaaaaagseoidno.4sg4-4tctggttggagtttttccagseoidno.5sg4-5tcagggaaagaaagtggtgcseoidno.6sg4-6ctcctcccagcagccactcaseoidno.7sg8-1gaccgccttgctcctgccgcseoidno.8sg8-2ggcaggagcaaggcggtcacseoidno.9sg8-3tcacggagcagcaaggccagseoidno.10sg8-4ggccagcggcaggagcaaggseoidno.11sg8-5caaggccagcggcaggagca[0097]table2[0098][0099]table3[0100][0101][0102]table4[0103][0104]table5[0105][0106][0107]实施例2.du-19car的制备(以下两种方法都可以制备)[0108]1、本发明的技术方法制备的du-19car的获取方法：起始样品为健康人外周血。用磁珠或流式分选cd4/cd8单阳性t细胞，用包含cd3、cd28的抗体的dynabeads进行持续刺激，感染含car的慢病毒，电转靶向cd4和cd8的sgrna和cas9蛋白的rnp混合物，电转后进行流式或磁珠分选出du-car-t细胞，培养液可用加适量因子，或其他任意适合培养t细胞的培养基和细胞因子组合即可。[0109]2、获取cd4和/或cd8单阳性t细胞，活化数小时后电转rnp该t细胞后，培养数小时后感染包含car结构的病毒，继续培养并分选出目的细胞。[0110]实施例3du-19car的评价[0111]1、car阳性率检测方法：pe标记的pl抗体。由图2可知，对19car上的cd4和cd8进行基因编辑，用磁珠分选出高纯度双阴性car-t细胞。未进行基因编辑组cd4与cd8比例分别为53.46％和43.43％，基因敲除后dt占比高达89.93％，磁珠分选后得到纯度高达99.94％的双阴性car-t细胞。并且这种操作不影响car结构在t细胞上的表达，du-19car阳性表达量与19car组均在85％左右，而传统通用型cu-19car表达量为76％。[0112]2、体外药效评价杀伤方法：采用固定效靶比铺板：e:t＝car-t:肿瘤细胞，在1640完全培养基中培养固定时间，采用荧光素酶裂解法检测靶细胞存活比例，并算出细胞毒性效率。干扰素-γ因子分泌水平检测用可用于检测该因子水平的试剂盒即可，详细操作参考各厂家生产的试剂盒说明书。[0113]如图3体外药效学评价结果显示，du-19car体外杀伤与传统的通用型cu-19car相当，其杀伤效率均可达90％左右；但我们发明的新型通用型du-19car组因子分泌水平是传统通用型cu-19car组的两倍，这说明我们的发明方法提高了其杀伤肿瘤的能力，有利于更强劲得攻击肿瘤细胞。[0114]3、表型检测方法：流式细胞仪检测；抗体：ccr7：apc、cd45ra：bv421、cd45ro：percp5.5；表型分类标准：t记忆干细胞：tscm(cd45ra+cd45r0-ccr7+)、类t记忆干细胞：tscm-like(cd45ra+cd45r0+ccr7+)、效应记忆t：tem(cd45ra-cd45r0+ccr7-)、中央记忆t：tcm(cd45ra-cd45r0+ccr7+)、效应t：te(cd45ra+cd45r0-ccr7-)、其他(100％-tscm-tscm-like-tem-tcm-te)。如图4，表型检测结果显示，与传统自体19car相比，通用型du-19car各组分型分布比较接近，tscm略低，但te略高，有利于瞬时杀伤肿瘤细胞。[0115]4、衰竭标志物检测方法：流式细胞仪检测；抗体：pd-1：apc、lag-3：bv421、tim-3：percp5.5。如图5所示，在衰竭标志物检测表达量数据结果看，两组car均不表达tim-3，但相较于传统自体19car，我们发明的通用型du-19car上pd-1和lag-3表达均更低，这也提示了我们发明的通用型du-19car具有更持久的持续性，从而有利于提高抗肿瘤能力。[0116]5、gvh强度测定方法：采用微球绝对计数的方法测定混合淋巴反应(mlr)，配置固定比例：供体细胞(car-t)：受体细胞(与供体细胞不同hla分型的健康人pbmc)混合体系，用1640基础培养基进行培养8天，分别于0天和8天流式检测细胞绝对计数，根据细胞数目变化算出gvh相对强度。[0117]检测结果如图6显示，我们发明的双阴性du-19car可引起的gvh反应强度与传统通用型car-t细胞cu-19car相当，均明显弱于对照组自体car-t细胞19car和ct组。这一结果说明，我们的发明方法制备的du-19car与传统通用型car-t细胞一样，可用于同种异体car-t免疫治疗。[0118]6、体内药效学评价方法：于11day引进小鼠，对小数进行检疫等系列检测操作，完成并许可入组；于-3day进行5e5nalm6-luc-gfp靶细胞尾静脉注射；于day0进行随机分组后按照car-t有效细胞数量为2e6回输car-t细胞；之后每隔7天进行活体成像观察小鼠体内肿瘤清除情况。[0119]体内药效结果如图7显示，19car和du-19car组及cu-19car组与controlt组相比体内有明显的肿瘤抑制作用。du-19car组和cu-19car组从荧光值曲线数据分析表明du-19car组相比cu-19car组体内药效明显更优，而我们发明的du-19car体内药效略优于自体组19car，这说明我们发明的新型通用型car-t细胞体内抗肿瘤效果不仅远优于传统通用型car-t细胞，并且相对传统自体car-t细胞也更好，这也是该发明的意外收获之一。[0120]综上所述，本发明中设计的du-19car进行体内外药效学评价、表型检测、衰竭marker检测，均证明我们的du-19car在各方面均优于传统通用型car-t细胞；并且采用微球绝对计数的方法测定混合淋巴反应(mlr)，结果显示本发明中设计的新型通用型du-19car可引起的gvh反应程度与传统通用型car-t细胞(cu-19car)相当，可用于同种异体回输治疗。[0121]实施例4.自然dnt或由其制备的dn-car-t(dn-19car：天然的cd4-cd8-t细胞)与本发明中技术制备的通用型du-car-t(du-19car：经过基因编辑获得的cd4-cd8-t细胞)比较[0122]自然dnt是指人体外周血中天然的不表达cd4和cd8的双阴性t细胞，这种细胞抗原提呈途径不受mhc限制，亦在同种异体应用中引起同种排斥的几率极低(占外周血总淋巴细胞1-5％)，但这部分细胞在人体外周血中存在比例极低，体外扩增难度高，针对适应症的治疗效果不可观。本发明中技术制备的通用型双阴性细胞最初来源是人体外周血中cd4单阳性或cd8单阳性t细胞(占外周血中总淋巴细胞40-80％)，这种细胞抗原提呈过程依赖于mhc限制性，无法直接用于同种异体应用，需要进一步操作使其不发生同种排斥反应，本发明通过基因编辑技术失活cd4和cd8，从而获得cd4-cd8-双阴性的t细胞，我们已在本发明中展示了这种细胞与传统通用型t细胞一样具备可应用于同种异体治疗的必备条件，见gvh相关数据。[0123]1、自然dnt获取方法：起始样品：健康人外周血。①用磁珠去除cd4/cd8spt细胞(cd4或cd8细胞)，持续刺激，接着进行富集培养。②用流式分选的方式分选出cd3+cd4-/cd8-t细胞，持续刺激24-48h，接着用培养基进行富集培养。[0124]2、dn-19car获取方法：获得自然dnt，培养24h感染含car慢病毒。我们采集了6批不同来源健康人外周血，并将其pbmc分离出来，通过检测筛选了其中dnt含量最高的3批，筛选指标：cd3+cd4-cd8-，我们需要用来制备du-19car的初始细胞为spt，筛选指标：cd3+、cd4+/cd8+；结果如表6所示。[0125]table6[0126]donor编号555556557558559560dnt百分比(％)4.972.93.1913.88.0716.85spt百分比(％)94.8296.6796.3885.7991.5682.68[0127]分别以起始量为1e8计算，在细胞活化第6天，我们获取到的car-t细胞数目统计如表7展示。从图12表格数据可见，同样起始量pbmc，在筛选dnt较高比例批次后，可获取的du-19car细胞至少是dn-19car细胞的3倍，最高可达到35倍以上。而在活化6天开始监测的增殖数据，由table7可知，在后期的增殖中，dn-19car细胞远不如du-19car细胞。由此可见du-19car细胞的应用范围更广，能够满足各种应用的需求，尤其是临床用用这种对细胞量要求较高的领域。由图8可知，du-car-t细胞car阳性率为60％以上，远高于n-dn-car-t细胞的25.4％，即其有效细胞比例高，更有利于杀伤肿瘤细胞。[0128]table7[0129][0130]3、du-19car获取方法：制备同前，磁珠分选采用生物素标记的cd4和cd8抗体，并偶联抗生物素的microbeads，过柱分选，如图9所示，选择阴性部分即可。流式检测敲除效率和分选纯度所用抗体：cd3：pe-cy7、cd4：fitc、cd8：bv510。[0131]由图9可知，du-19car细胞纯度比例高达100％，分选纯度高；dn-car-t细胞dnt比例为96.6％，这说明富集的方法获取的dnt纯度较高，但略低于我们的发明方法，这提示在安全性方面，我们的发明方法获取的du-car-t细胞具有更大的优势。[0132]4、如图10所示，效靶比为1:8时，杀伤结果显示我们发明的du-19car与传统自体19car有统计学差异，同时我们发明的du-19car与天然dnt制备的dn-19car有极其显著性统计学差异。这说明我们发明的du-car-t细胞杀伤能力明显强于dn-car-t细胞，并且优于自体car-t细胞组。[0133]5、因子检测结果，如图11所示，采用任一可用于检测干扰素γ的试剂盒检测即可，检测杀伤后的上清培养基，方法参考各试剂说明书。结果显示我们发明的du-19car与传统自体19car有显著性统计学差异，并且我们发明的du-19car与天然dnt制备的dn-19car有极其显著性统计学差异。这从因子分泌的水平反映了我们发明的双阴性通用型car-t细胞具有更强的体外药效。[0134]6、增殖和活力监测，从磁珠分选出高纯度双阴性du-19car(活化day5或day6)开始监测。监测方法：各组取固定相同起始量(如1e6)细胞进行监测，之后每隔2-3天进行监测，一直到监测到有一组细胞不再继续增殖，且活力开始下降，整个监测过程中不可丢弃细胞。如图12所示，我们发明的通用型du-car-t增殖能力和细胞活力均明显优于自然双阴性dn-controlt或由其制备的双阴性dn-19car细胞，这说明我们发明的制备方法获取的通用型du-19car细胞增殖和活力均不会受到影响，甚至有令人惊喜的效果，而自然dnt增殖较差，难以快速达到治疗需求量，生产成本也大大提高，这意味着其临床转化利用较难。[0135]7、表型、衰竭标志物、活化标志物检测：[0136]1)表型检测结果，如图13显示，我们发明的du-19car组te比例明显高于dn-19car组，由于car-t作用时间较短，瞬时杀伤能力是药效的重要体现指标，因此在我们的杀伤结果中也体现为我们发明的du-19car杀伤能力更强。[0137]2)衰竭标志物检测结果，如图14显示，我们发明的du-19car中三种衰竭分子表达量均低于dn-19car，这一结果提示我们发明的du-19car具有更强的持续性，凋亡速度更慢，因此可以更好地发挥其抗肿瘤药效。[0138]3)活化标志物检测方法：流式细胞仪检测；抗体：cd25：fitc、cd44：bv421、cd95：bv4711。活化标志物检测结果，如图15显示，除cd25体现少量差异外，cd95、及cd44均呈现相似表达。当前第1页12当前第1页12
技术特征：
1.t细胞，其特征在于，所述t细胞的cd4基因和/或cd8基因被敲除和/或失活。2.根据权利要求1所述的t细胞，其特征在于，所述t细胞经过基因编辑获得。3.根据权利要求1所述的t细胞，其特征在于，所述t细胞经过天然分离获得。4.根据权利要求1-3任意一项所述的t细胞，其特征在于，所述的t细胞的β2-微球蛋白、和/或hla-i类分子共同亚基、和/或ciita的基因失去功能或缺失。5.根据权利要求1-4任意一项所述的t细胞，其特征在于，所述t细胞为同种异体t细胞。6.根据权利要求1-5任意一项所述的t细胞，其特征在于，所述的t细胞还表达hla-e和/或hla-g和/或hla-f。7.权1-6任意一项所述的t细胞的制备方法，其特征在于，利用基因编辑技术敲除和/或失活t淋巴细胞中的cd4基因或/和cd8基因。8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述t细胞为活化的和/或非活化的t淋巴细胞。9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述的t细胞中的cd4基因和/或cd8基因的敲除或失活时机为：在t细胞扩增之后，或在t细胞扩增之前。10.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述的基因编辑技术是通过电转的方式或非电转的方式改造t细胞，优选的，所述基因编辑技术包括cas9、zfn、talen。11.权利要求7-10任一所述的制备方法所得的t细胞。12.由权利要求1-6任意一项或11所述的t细胞制备的car-t细胞。13.根据权利要求12所述的car-t细胞，其特征在于，car-t细胞中的car包含有胞外域、跨膜域和胞内信号域。14.根据权利要求12所述的car-t细胞，其特征在于，所述car-t细胞为同种异体car-t细胞。15.根据权利要求12所述的car-t细胞，其特征在于，所述car-t细胞还表达膜结合的il15。16.根据权利要求12所述的car-t细胞，其特征在于，所述car-t细胞还表达分泌细胞因子，所述细胞因子包括il2、il7、il12、il21、il15。17.根据权利要求12所述的car-t细胞，其特征在于：所述car-t细胞还表达且可识别肿瘤微环境中分子的融合蛋白，所述融合蛋白的胞外结构识别pd1、pdl1、sirpγ、sirpδ、tigit。18.根据权利要求12项所述的car-t细胞，其特征在于：所述car结构可被调控活化或失活，所述调控活化或失活的结构包括peptide neo-epitope(pne)、fluorescein(fitc)、10amino acids(5b9 tag)、fitc-hm-3bifunctional molecule(fhbm)and scfv、leucine zipfv linked to antibody、streptavidin2(msa2)biotin-binding domain。19.根据权利要求12-18任意一项述的car-t细胞，其特征在于，所述car-t细胞可以识别实体瘤、血液系统肿瘤细胞/组织；所述car-t细胞的抗原识别区可以识别包含抗原：cd19、cd20、cd22、cd33、cll-1(clec12a)、cd7、cd5、cd70、cd123、ceacam5、ceacam6、ceacam7、mesothelin、muc1、cldn18.2、cdh17、trop2、bcma、nkg2d、pdl1、egfr、egfrviii、psca、psma、muc16、cd133、gd2、il13r2、b7h3、her2、cd30、slamf7、cd38、gpc3、wt1或tag-72。20.权利要求12所述的car-t细胞的制备方法，其特征在于，选用以下两种任一方法获
得目的细胞：(1)活化敲除或失活cd4和或cd8基因的t细胞后感染包含car结构的病毒，对感染car结构后的t细胞进行rnp电转，最后获得目的细胞；或(2)活化敲除或失活cd4和或cd8基因的t细胞后电转rnp该t细胞后，再感染包含car结构的病毒，最后获得目的细胞。21.感染权利要求12所述的car-t细胞的重组载体，其特征在于，所述重组载体包含car结构。22.根据权利要求21所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体包含cd44基因功能片段。23.根据权利要求21所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体中选用表达载体为慢病毒表达载体、逆转录病毒表达载体、腺病毒表达载体、腺相关病毒表达载体、dna载体、rna载体、质粒中的任一种。24.含有权利要求1所述的t细胞和/或权利要求12所述的car-t细胞的细胞组合物。25.根据权利要求24所述的细胞组合物，其特征在于，所述细胞组合物中含有的所述t细胞或所述car-t细胞的比例以数量计不低于不低于90％，80％，70％或60％。26.根据权利要求24所述的细胞组合物，其特征在于，所述的细胞组合物可以是经过活化诱导的cik细胞或nkt细胞。27.权利要求1-6任意一项所述的t细胞和/或权利要求12-19任意一项所述的car-t细胞和/或权利要求21-23任意一项所述的重组载体和/或权利要求24-26任意一项所述的细胞组合物在制备细胞治疗药物中的应用。28.根据权利要求27所述的应用，其特征在于，权利要求1-6任意一项所述的t细胞和/或权利要求12-19任意一项所述的car-t细胞和/或权利要求21-23任意一项所述的重组载体和/或权利要求24-26任意一项所述的细胞组合物在制备治疗急性淋巴样白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胰腺癌、肺癌、肾癌、肝癌、脑癌和/或皮肤癌的药物中的应用。29.制备治疗性t-细胞或car-t细胞时，cd4基因的抑制剂、敲除剂和/或cd4基因的抑制剂、敲除剂作为细胞增殖剂、活力提升剂、表型分布改良剂、衰竭标志物表达抑制剂中的应用。

技术总结
本发明属于细胞生物学、分子生物学以及药物研发技术领域，具体涉及通用型CAR-T细胞的制备方法及其应用；所通用型CAR-T细胞的CD4基因和/或CD8基因被敲除和/或失活；所述通用型CAR-T细胞不仅可以在体内、外有效杀伤肿瘤靶细胞，用于肿瘤的靶向治疗，并且有高于传统自体CAR-T细胞和传统通用型CAR-T细胞的抗肿瘤效果；本发明提供的通用型CAR-T细胞，与传统通用型CAR-T细胞一样，在体外仅发生较低的GVH反应，可以用于制备同种异体CAR-T治疗。T治疗。T治疗。


技术研发人员：沈俊杰 李戊玲 徐艳敏 杨智
受保护的技术使用者：重庆精准生物产业技术研究院有限公司
技术研发日：2021.12.30
技术公布日：2023/7/13