单聚乙二醇重组人促红素的制备和纯化方法与流程

1.本发明涉及重组人促红素修饰物的制备和纯化方法，尤其涉及单聚乙二醇重组人促红素的制备和纯化方法，属于单聚乙二醇重组人促红素的制备和纯化领域。


背景技术：

2.贫血是慢性肾脏病(chronic kidney disease，ckd)的常见并发症，与许多不良临床后果有关，不仅严重影响患者的生活质量，是发生心血管并发症的独立预测因子，并可显著增加患者心血管病事件、终末期肾脏病和死亡的发生风险。促红细胞生成素(rhepo)具有与天然促红细胞生成素相同的生物效应，被广泛应用于临床，是治疗慢性肾衰贫血的主要手段。
3.epo又称红细胞刺激因子、促红素，是一种人体内源性糖蛋白激素，可刺激红细胞生成。缺氧可刺激促红细胞生成素产生，早已有重组人促红细胞生成素用于临床，用于治疗肾功能不全合并的贫血、获得性免疫缺陷综合征/艾滋病本身或治疗引起的贫血、恶性肿瘤伴发的贫血及风湿病贫血等多种贫血。天然的促红素激素由肾脏产生(婴儿由肝脏产生)，分泌到血液循环系统中，刺激骨髓的造血祖细胞分化形成红细胞，使人体血液中的红细胞保持正常。
4.聚乙二醇重组人促红素(peg-erythropoietin，简称“peg-epo”)，选用直链35kda聚乙二醇(简称“peg”)通过稳定的共价键与基因重组人促红细胞生成素(rhepo-α)n端氨基以及45位和52位赖氨酸ε氨基结合生成，分子量65kda左右，属于长效epo受体激动剂(erythropoiesis stimulating agents，简称“esas”)，在体内与epo受体结合后可促进红细胞的生成。peg-epo是聚乙二醇修饰的蛋白质药物，与天然的促红素激素药理作用相同，半衰期由原型epo的24小时延长至130小时，免疫原性降低，生物利用度增强，药物的毒副作用减少。
5.在生物药的发展史中，制备型高效液相技术的引入为生物药质量的提升起到十分关键的作用，使得利用偶联剂修饰的样品的纯度从56％左右提升到99％甚至更高，使得药物的安全性进一步得到保障。因此生产厂家都会对色谱纯化工艺进行深度研究和优化，以便得到质量更高，成本更低的产品。因此，开发一种一步纯化单聚乙二醇重组人促红素的制备型方法，提高样品的纯度，去除杂蛋白，将具有重要的市场价值和应用前景。


技术实现要素：

6.本发明的主要目的是提供一种单聚乙二醇重组人促红素的制备和纯化方法；
7.本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
8.一种单聚乙二醇重组人促红素的制备和纯化方法，包括：
9.(1)用peg修饰人促红细胞生成素得到未修饰聚乙二醇重组人促红素、单修饰聚乙二醇重组人促红素和多修饰聚乙二醇重组人促红素的混合产物；(2)用阳离子层析填料装柱制备阳离子交换层析柱；(3)采用平衡液平衡阳离子交换层析柱；(4)将步骤(1)的混合产
物稀释后上样阳离子交换层析柱，再用平衡液平衡阳离子交换层析柱；(5)采用0-30％的酸性洗涤流动相进行梯度洗涤或等度洗涤方式将吸附在阳离子交换层析柱上的杂蛋白洗脱下来；(6)采用40-80％的酸性洗脱流动相进行梯度洗脱或等度洗脱方式进行洗脱，收集洗脱主峰，得到单聚乙二醇重组人促红素纯品。
10.作为本发明一种优选的具体实施方式，步骤(1)中所述的修饰包括将人促红细胞生成素与mpeg-sba进行反应，在epo分子上分别偶联一个、两个或多个聚(乙二醇)基团得到未修饰聚乙二醇重组人促红素、单修饰聚乙二醇重组人促红素和多修饰聚乙二醇重组人促红素的混合产物；其中，peg的分子量为5-30kd，优选为30kd。
11.作为本发明一种优选的具体实施方式，所述阳离子层析填料选自sp sepharose f.f.(cytiva)、macrocap sp(cytiva)、sp 5pw-20(tosoh)或porps 50hs(thermo)中的任何一种，优选为sp 5pw-20(tosoh)。
12.作为本发明一种优选的具体实施方式，所述阳离子交换层析填料的平均粒度为20-90μm，平均长度为15-25cm；优选的，所述阳离子交换层析填料的平均粒度为20-50μm，平均长度为18-22cm。
13.本发明中所述的平衡液可以是阳离子交换层析中常规使用的平衡液，优选为柠檬酸缓冲液，乙酸铵缓冲液或磷酸二氢钠缓冲液中的任何一种，所述的平衡液的ph值为酸性，其ph值优选为3.0-4.5，更优选为3.5。
14.作为本发明一种优选的具体实施方式，所述的酸性洗涤流动相或酸性洗脱流动相选自柠檬酸钠氯化钠缓合液、乙酸铵-氯化钠缓合液或磷酸二氢钠-氯化钠缓合液中的任何一种，优选为乙酸铵-氯化钠缓合液；其中，所述酸性洗涤流动相的终浓度优选为10-50mmol/l，最优选为25mmol/l；氯化钠的终浓度为0.05-0.15mol/l，最优选为0.10mol/l；所述酸性洗脱流动相的终浓度优选为10-50mmol/l，最优选为25mmol/l，氯化钠的终浓度优选为0.20-0.40mol/l，最优选为0.30mol/l。
15.作为本发明一种优选的具体实施方式，所述酸性洗涤流动相或酸性洗脱流动相的ph值优选为3.0-4.5，更优选为3.5；
16.本发明通过试验发现，在步骤(5)采用0-30％的洗涤流动相进行等度洗涤方式能够更充分的将吸附在阳离子交换层析柱上的杂蛋白洗脱下来；其中，所述的等度洗涤条件可以是采用10％，20％或30％洗涤流动相在4-6cv内完成洗涤，更优选为采用20％洗涤流动相在5cv内完成等度洗涤洗涤。
17.本发明通过试验发现，在步骤(6)采用40-80％的洗脱流动相进行梯度或等度洗脱方式进行洗脱时，采用等度洗脱方式能够将吸附在层析柱上单聚乙二醇重组人促红素洗脱下来，从而提高单聚乙二醇重组人促红素的收率和纯度。作为优选的等度洗脱方式可以是采用50％的洗脱流动相、60％的洗脱流动相或70％的洗脱流动相于7cv完成洗脱，最优选的，采用60％的b相，7cv进行等度洗脱对于单修饰peg-epo的纯化效果最好，表现在纯化后样品纯度较高，且纯化收率也相对较高。
18.本发明通过采用阳离子交换层析填料，在酸性(ph3.0-4.5)洗脱液环境下进行洗脱，可较好的去除未修饰的epo和二修饰或者多修饰的epo，从而提高样品纯度，能够一步将单聚乙二醇重组人促红素纯度由56.0％提高至99.0％以上，且纯化后样品收率稳定在85％以上，纯化后样品纯度和收率都显著高于现有技术。
19.本发明方法中粗样样品的上样量大，超过10克/升床层体积，极大的节省了纯化成本。本发明方法中采用低压操作环境，溶剂为盐类，无有机试剂，工艺简单，易于放大。
20.总之，本发明提供的单聚乙二醇重组人促红素的制备和纯化方法，工艺简单可行，粗样样品上样量大，生产成本低，纯化后样品纯度高且得率高，且易于放大，适合作为单聚乙二醇重组人促红素的工业化生产。
附图说明
21.图1为试验例7中单修饰peg-epo的色谱纯化图谱。
22.图2为试验例7中纯化样品的检测图谱。
具体实施方式
23.以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
24.试验材料及仪器
25.epo原液(本发明人自制)、mpeg-sba(北京键凯公司，纯度》95％，分子量为30kd)、柠檬酸、乙酸铵、磷酸二氢钠、氯化钠、乙酸(hac)和氢氧化钠(naoh)购自国药集团化学试剂有限公司；预装色谱柱(5ml)，填料sp sepharose f.f.和macrocap sp购自cytiva；sp 5pw-20购自tosoh；porps 50hs购自thermo。分析型色谱柱poroshell 300sb c8(5μm，300a，2.1
×
75mm)购自agilent；分析型高效液相仪器为安捷伦1260，akta purifier100层析系统，制备型液相仪器为akta层析系统。
26.样品纯度检测方法
27.仪器为安捷伦1260分析型高效液相，柱子采用poroshell 300sb c8(5μm，300a，2.1
×
75mm)色谱柱，设置柱温为60℃
±
5℃，流动相a是0.3％tfa水溶液，流动相b是0.2％tfa，84％乙腈，上样量是样品和对照品根据蛋白含量进适当体积，上样5～20μg，在1ml/min的流速下，进行梯度洗脱。220nm波长下进行检测，采用峰面积归一化法计算得到单体的含量。梯度洗脱条件如下表1所示：
28.表1梯度洗脱条件
29.运行时间(min)流动相a(％)流动相b(％)06040450507505094060134060143268183268190100200100
211000221000
30.试验例1未修饰聚乙二醇重组人促红素、单修饰聚乙二醇重组人促红素和多修饰聚乙二醇重组人促红素混合样品的制备
31.取检定合格的epo原液，浓度2～4mg/ml，各加入k2hpo4至终浓度为100mm k2hpo4，调整缓冲体系ph值为8.0。按epo:peg摩尔比1:3的比例加入mpeg-sba，溶解，在室温(20-25℃)环境下搅拌反应2小时。反应结束后，用乙酸调ph4.5终止反应，取样进行sec-hplc检测，查看单peg-epo组分比例。
32.结果显示目的产物单修饰peg-epo组分比例为56.61％，未修饰epo的组分比例为33.54％，多修饰peg-epo组分比例为9.85％。
33.试验例2考察不同填料对peg-epo混合样品的分离效果的影响
34.1.供试材料：混合样品为试验例1所制备的未修饰聚乙二醇重组人促红素、单修饰聚乙二醇重组人促红素和多修饰聚乙二醇重组人促红素的混合样品。
35.2.试验方法
36.色谱纯化方法采用不同的阳离子层析填料(sp sepharose f.f.、macrocap sp、sp 5pw-20和porps 50hs)在5ml预装柱上进行；洗脱用流动相a相：50mmol/l柠檬酸钠缓冲液，ph4.5，洗脱用流动相b相：50mmol/l柠檬酸钠缓冲液，0.5mol/l氯化钠ph4.5；保持柱子温度为18-26℃；洗脱流速为0.7ml/min；检测波长为280nm。
37.具体步骤为：
38.(1)采用100％a相作为平衡液平衡柱子至基线稳定。
39.(2)50mg混合样品稀释5倍后上样柱子，再采用平衡液平衡柱子至基线稳定。
40.(3)采用0-100％的b相，20cv的梯度洗脱方式将吸附在柱子上的各种物质洗脱下来，280nm uv检测仪监测出峰后对每个峰进行收集。
41.3.试验结果
42.试验结果见表2。
43.表2不同不同填料对单修饰peg-epo的分离纯化效果
44.填料纯化后单修饰peg-epo比例纯化收率sp sepharose f.f.87.79％43.7％macrocap sp89.64％54.5％sp 5pw-2093.45％70.4％porps 50hs91.82％65.9％
45.根据表2的试验结果可以看出sp 5pw-20填料对于单修饰peg-epo的纯化效果最好，表现在纯化后样品纯度较高，且纯化收率也不会太低，可以进一步优化至最佳值，因此优选sp 5pw填料作为单修饰peg-epo的纯化用填料。
46.试验例3不同缓冲液对于纯化后样品纯度及得率的影响
47.1.供试材料
48.试验例1所制备的未修饰聚乙二醇重组人促红素、单修饰聚乙二醇重组人促红素和多修饰聚乙二醇重组人促红素的混合样品。
49.2.试验方法
50.色谱纯化方法采用阳离子层析填料sp 5pw-20在5ml预装柱上进行；采用不同的流动相进行洗脱，
51.流动相1：流动相a相：50mmol/l柠檬酸缓冲液，ph4.5；洗脱用流动相b相：50mmol/l柠檬酸缓冲液，0.5mol/l氯化钠ph4.5；
52.流动相2：流动相a相：50mmol/l乙酸铵缓冲液，ph4.5；洗脱用流动相b相：50mmol/l乙酸铵缓冲液，0.5mol/l氯化钠ph4.5；
53.流动相3：流动相a相：50mmol/l磷酸二氢钠缓冲液，ph4.5；洗脱用流动相b相：50mmol/l磷酸二氢钠缓冲液，0.5mol/l氯化钠ph8.5；
54.保持柱子温度为18-26℃；洗脱流速为0.7ml/min；检测波长为280nm。
55.具体步骤分别为：
56.(1)采用100％a相作为平衡液平衡柱子至基线稳定。
57.(2)分别用50mg混合样品稀释5倍上样柱子，然后采用100％a相为平衡液平衡柱子至基线稳定。
58.(3)采用0-30％的b相，15cv梯度洗脱方式将吸附在柱子上的部分物质洗脱下来；
59.(4)采用100％a相作为平衡液继续平衡柱子至基线稳定。
60.(5)采用40-80％的b相，15cv梯度洗脱方式将吸附在柱子上的样品洗脱下来；280nm uv检测仪监测出峰后对每个峰进行收集。
61.3.试验结果
62.试验结果见表3。
63.表3采用不同种类的缓冲液对于纯化后样品纯度及得率
64.缓冲液种类纯化后单修饰peg-epo比例收集样品的收率柠檬酸94.83％70.2％乙酸铵95.65％76.9％磷酸二氢钠93.21％72.3％
65.从表3的试验结果可以看出，乙酸铵缓冲液对于单修饰peg-epo的纯化效果最好，表现在纯化后样品纯度较高，且纯化收率也相对于其他两种溶液高，可以进一步优化至最佳值，因此优选乙酸铵缓冲液作为单修饰peg-epo的纯化用流动相。
66.试验例4不同ph值对纯化后样品纯度及得率的影响
67.1.供试材料
68.试验例1所制备的未修饰聚乙二醇重组人促红素、单修饰聚乙二醇重组人促红素和多修饰聚乙二醇重组人促红素的混合样品。
69.2.试验方法
70.色谱纯化方法采用阳离子层析填料sp 5pw-20在5ml预装柱上进行；流动相a相：50mmol/l乙酸铵缓冲液；洗脱用流动相b相：50mmol/l乙酸铵缓冲液，0.5mol/l氯化钠；采用不同的ph值，分别为3.0，3.5，4.0以及4.5；保持柱子温度为18-26℃；洗脱流速为0.7ml/min；检测波长为280nm。
71.具体步骤分别为：
72.(1)采用100％a相作为平衡液平衡柱子至基线稳定。
73.(2)分别用50mg混合样品稀释5倍上样柱子，然后采用平衡液平衡柱子至基线稳
定。
74.(3)采用0-30％的b相，15cv梯度洗脱方式将吸附在柱子上的部分物质洗脱下来；
75.(4)采用100％a作为平衡液继续平衡柱子至基线稳定。
76.(5)采用40-80％的b相梯度洗脱方式将吸附在柱子上的样品洗脱下来；280nm uv检测仪监测出峰后对每个峰进行收集。
77.3.试验结果
78.试验结果见表4。
79.表4洗脱相采用不同ph值对纯化后样品纯度及得率
80.ph纯化后单修饰peg-epo比例收集样品的收率3.096.32％88.9％3.597.84％86.4％4.096.93％81.3％4.595.87％77.8％
81.从试验结果可以看出随着ph的降低，收率与纯度均有所升高，但ph3.5时对于单修饰peg-epo的纯化效果最好，表现在纯化后样品纯度较高，且纯化收率也相对于其他三种ph高，因此，优选如下流动相作为单修饰peg-epo的纯化用流动相：流动相a相：50mmol/l乙酸铵缓冲液，ph3.5；流动相b相：50mmol/l乙酸铵缓冲液，0.5mol/l氯化钠，ph3.5。试验例5考察采用不同等度洗涤方式对纯化后样品纯度及得率的影响
82.1.供试材料
83.试验例1所制备的未修饰聚乙二醇重组人促红素、单修饰聚乙二醇重组人促红素和多修饰聚乙二醇重组人促红素的混合样品。
84.2.试验方法
85.色谱纯化方法采用阳离子层析填料sp 5pw-20在5ml预装柱上进行；流动相a相：50mmol/l乙酸铵缓冲液，ph3.5；流动相b相：50mmol/l乙酸铵缓冲液，0.5mol/l氯化钠，ph3.5；保持柱子温度为18-26℃；洗脱流速为0.7ml/min；检测波长为280nm。
86.具体步骤为：
87.(1)分别采用100％a相作为平衡液平衡柱子至基线稳定。
88.(2)分别用50mg混合样品稀释5倍上样柱子然后采用平衡液平衡柱子至基线稳定。
89.(3)分别采用10％的b相，5cv；20％的b相，5cv；30％的b相，5cv；等度洗涤方式将吸附在柱子上的部分物质洗脱下来；
90.(4)分别采用100％a相作为平衡液继续平衡柱子至基线稳定。
91.(5)分别采用50-70％的b相梯度洗脱方式将吸附在柱子上的样品洗脱下来；280nm uv检测仪监测出峰后对每个峰进行收集。
92.3.试验结果
93.试验结果见表5。
94.表5不同等度洗涤方式对纯化后样品纯度及得率的影响
95.等度洗涤纯化后单修饰peg-epo比例收集样品的收率10％的b相，5cv94.57％88.2％20％的b相，5cv98.42％86.9％
30％的b相，5cv98.79％80.5％
96.从表5的试验结果可以看出20％的b相，5cv进行等度洗涤对于单修饰peg-epo的纯化效果最好，表现在纯化后样品纯度较高，且纯化收率也相对于较高；30％的b相，5cv进行等度洗涤所对应的收率较低，而10％的b相，5cv进行等度洗涤所对应的纯度较低。因此单修饰peg-epo的纯化洗涤等度梯度为20％的b相，5cv。
97.试验例6考察不同等度洗脱方式对纯化后样品纯度及得率的影响
98.1.供试材料
99.试验例1所制备的未修饰聚乙二醇重组人促红素、单修饰聚乙二醇重组人促红素和多修饰聚乙二醇重组人促红素的混合样品，纯度为56.0％。
100.2.试验方法
101.色谱纯化方法采用阳离子层析填料sp 5pw-20在5ml预装柱上进行；流动相a相：50mmol/l乙酸铵缓冲液，ph3.5；流动相b相：50mmol/l乙酸铵缓冲液，0.5mol/l氯化钠，ph3.5；保持柱子温度为18-26℃；洗脱流速为0.7ml/min；检测波长为280nm。
102.具体步骤为：
103.(1)分别采用100％a相作为平衡液平衡柱子至基线稳定。
104.(2)分别用50mg混合样品稀释5倍上样柱子，然后采用平衡液平衡柱子至基线稳定。
105.(3)分别采用20％的b相，5cv等度洗涤方式将吸附在柱子上的部分物质洗脱下来；
106.(4)分别采用100％a相作为平衡液继续平衡柱子至基线稳定。
107.(5)分别采用50％的b相，7cv；60％的b相，7cv；70％的b相，7cv；等度洗脱方式将吸附在柱子上的样品洗脱下来，280nm uv检测仪监测出峰后对每个峰进行收集。
108.3.试验结果
109.试验结果见表6。
110.表6不同等度洗脱方式对纯化后样品纯度及得率的影响
111.等度洗脱纯化后单修饰peg-epo比例收集样品的收率50％的b相，7cv98.47％75.9％60％的b相，7cv99.12％88.4％70％的b相，7cv97.25％90.1％
112.从表6的试验结果可以看出60％的b相，7cv进行等度洗脱对于单修饰peg-epo的纯化效果最好，表现在纯化后样品纯度较高，且纯化收率也相对于较高；50％的b相，7cv进行等度洗脱所对应的收率较低，而70％的b相，7cv进行等度洗脱所对应的纯度较低。因此单修饰peg-epo的纯化洗脱等度梯度为60％的b相，7cv。
113.试验例7同比例放大阳离子交换层析方法的试验
114.1.供试材料
115.试验例1所制备的未修饰聚乙二醇重组人促红素、单修饰聚乙二醇重组人促红素和多修饰聚乙二醇重组人促红素的混合样品。
116.2.试验方法
117.色谱纯化方法采用阳离子层析填料sp 5pw-20在1.75l手动装柱上进行；流动相a相：25mmol/l乙酸铵缓冲液，ph3.5；流动相b相：25mmol/l乙酸铵缓冲液，0.5mol/l氯化钠，
ph3.5；保持柱子温度为18-26℃；洗脱流速为15l/h；检测波长为280nm。
118.具体步骤为：
119.(1)采用100％a相作为平衡液平衡柱子至基线稳定。
120.(2)用17.5g混合样品稀释5倍上样柱子，然后采用平衡液平衡柱子至基线稳定。
121.(3)采用20％的b相，5cv等度洗涤方式将吸附在柱子上的部分物质洗脱下来；
122.(4)采用100％a相作为平衡液继续平衡柱子至基线稳定。
123.(5)采用60％的b相，7cv等度洗脱方式将吸附在柱子上的样品洗脱下来；280nm uv检测仪监测出峰后对每个峰进行收集。
124.3.试验结果
125.供试材料进行分析检测，纯度为56.0％，纯化后样品纯度为99.26％，收率为86.9％。图1为单修饰peg-epo的色谱纯化图谱。图2为纯化样品的检测图谱。

技术特征：
1.一种单聚乙二醇重组人促红素的制备和纯化方法，其特征在于，包括：(1)用peg修饰人促红细胞生成素得到未修饰聚乙二醇重组人促红素、单修饰聚乙二醇重组人促红素以及多修饰聚乙二醇重组人促红素的混合产物；(2)用阳离子层析填料装柱制备阳离子交换层析柱；(3)采用平衡液平衡阳离子交换层析柱；(4)将步骤(1)的混合产物稀释后上样阳离子交换层析柱，用平衡液平衡阳离子交换层析柱；(5)采用0-30％的酸性洗涤流动相进行梯度洗涤或等度洗涤方式将吸附在阳离子交换层析柱上的杂蛋白洗脱下来；(6)采用40-80％的酸性洗脱流动相进行梯度洗脱或等度洗脱方式进行洗脱，收集洗脱主峰，得到单聚乙二醇重组人促红素纯品。2.根据权利要求1所述的制备和纯化方法，其特征在于，其特征在于，步骤(1)中所述的修饰包括将人促红细胞生成素与peg进行反应，在epo分子上分别偶联一个、两个或多个聚乙二醇基团得到未修饰聚乙二醇重组人促红素、单修饰聚乙二醇重组人促红素和多修饰聚乙二醇重组人促红素的混合产物；其中，peg的分子量为5-30kd，优选为30kd。3.根据权利要求1所述的制备和纯化方法，其特征在于，所述阳离子层析填料选自sp sepharose f.f.、macrocap sp、sp 5pw-20或porps 50hs中的任何一种。4.根据权利要求1或3所述的制备和纯化方法，其特征在于，所述阳离子交换层析填料的平均粒度为20-90μm，平均长度为15-25cm；优选的，所述阳离子交换层析填料的平均粒度为20-50μm，平均长度为18-22cm。5.根据权利要求1所述的制备和纯化方法，其特征在于，所述的平衡液选自柠檬酸缓冲液，乙酸铵缓冲液或磷酸二氢钠缓冲液中的任何一种。6.根据权利要求1或5所述的制备和纯化方法，其特征在于，所述的平衡液的ph值为酸性，其ph值优选为3.0-4.5，更优选为3.5。7.根据权利要求1所述的制备和纯化方法，其特征在于，所述的酸性洗涤流动相或酸性洗脱流动相选自柠檬酸钠氯化钠缓合液、乙酸铵-氯化钠缓合液或磷酸二氢钠-氯化钠缓合液中的任何一种；其中，所述酸性洗涤流动相的终浓度优选为10-50mmol/l，最优选为25mmol/l；氯化钠的终浓度为0.05-0.15mol/l，最优选为0.10mol/l；所述酸性洗脱流动相的终浓度优选为10-50mmol/l，最优选为25mmol/l，氯化钠的终浓度优选为0.20-0.40mol/l，最优选为0.30mol/l。8.根据权利要求1或7所述的制备和纯化方法，其特征在于，所述酸性洗涤流动相或酸性洗脱流动相的ph值为3.0-4.5，优选为3.5。9.根据权利要求1所述的制备和纯化方法，其特征在于，在步骤(5)中所述的等度洗涤是采用10％洗涤流动相、20％洗涤流动相或30％洗涤流动相在4-6cv内完成等度洗涤；优选的，所述的等度洗涤是采用20％洗涤流动相在5cv内完成等度洗涤。10.根据权利要求1所述的制备和纯化方法，其特征在于，步骤(6)中所述的等度洗脱是采用50％的洗脱流动相、60％的洗脱流动相或70％的洗脱流动相，7cv完成等度洗脱；优选的，所述的等度洗脱是采用60％的b相，7cv完成等度洗脱。

技术总结
本发明公开了一种单聚乙二醇重组人促红素的制备和纯化方法，包括：用PEG修饰人促红细胞生成素；制备阳离子交换层析柱；将修饰产物稀释后上样阳离子交换层析柱；采用0-30％的酸性洗涤流动相进行梯度洗涤或等度洗涤将阳离子交换层析柱上的杂蛋白洗脱下来；采用40-80％的酸性洗脱流动相进行梯度或等度洗脱方式进行洗脱，收集洗脱主峰。本发明采用阳离子交换层析填料，在酸性洗脱液环境下进行洗脱，较好去除未修饰的EPO和二修饰或者多修饰的EPO，能够一步将单聚乙二醇重组人促红素纯度由56.0％提高至99.0％以上，且纯化后样品收率稳定在85％以上；本发明方法上样量大、生产成本低、无有机试剂、工艺简单、易于放大。易于放大。易于放大。


技术研发人员：许波 吕晓林 黄菁 徐天扬 聂洪霞 史传超 贺新新 刘海峰
受保护的技术使用者：华润生物医药有限公司 上海昂德生物科技有限公司
技术研发日：2021.12.29
技术公布日：2023/7/13