混源萜类化合物TaladrimaninA、制备方法及用途与流程

混源萜类化合物taladrimanin a、制备方法及用途
技术领域
1.本发明涉及化合物抗肿瘤和抗菌活性领域，尤其涉及混源萜类化合物taladrimanin a、制备方法及用途。


背景技术：

2.真菌杂萜表现出优秀的结构多样性，根据其生物合成途径，真菌杂萜一般由两部分组成：萜类片段(主要是甲羟戊酸途径)和非萜类片段(包括聚酮、氨基酸(通常为吲哚二萜)、莽草酸和其他生物遗传途径)。复杂的萜类部分(萜类链的长度及其环化方式)和非萜类成分以及后修饰裁剪反应使其具有化学多样性。具体地，真菌杂萜可分为以下4类：polyketide-terpenoids(聚酮萜类),indole-terpenoids(吲哚萜类),shikimate-terpenoids(莽草酸类)和miscellaneous meroterpenoids(混杂萜类)。其中聚酮萜类可细分为三酮类、四酮类和其他聚酮类，同时orsellinic acid/orcinaldehyde，3,5-dimethylorsellinic acid(dmoa)和6-methylsalicylic acid(6-msa)是四酮类萜典型结构前体。在数目上，聚酮萜类和莽草酸萜类是最主要的两大杂萜类群。
3.在生物活性方面，56％的真菌杂萜具有明显的生物活性，包括细胞毒性、酶抑制、抗菌、抗炎、抗病毒、抗真菌等。这些具有生物活性的真菌杂萜，是现代药物发现中重要的“先导化合物”，为药物研发提供丰富和珍贵的药物活性分子资源。如antroquinonol和4-acetyl antroquinonol b已被开发成作为抗癌、抗高胆固醇血症和抗高脂血症药物，并进入临床应用ii期。还有部分在较低浓度下表现出显著生物活性的杂萜，具有良好的药物开发前景：mycophenolic acid(免疫抑制剂)、fumagillin(抗菌和抗血管生成剂)、pyripyropene a(acat-2抑制剂)、territrem b(ache抑制剂)、ascofuranone(选择性氧化酶抑制剂)、terpendole e(eg5抑制剂)、vibralactone(胰脂肪酶抑制剂)和ganomycin的衍生物7d(肥胖与代谢功能障碍的拮抗剂)。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种混源萜类化合物taladrimanin a。
5.为实现上述目的，本发明提供一种混源萜类化合物taladrimanin a，其结构式如式(a)所示，
6538p。
21.本发明还提供一种药物制剂，其特征在于，包括所述混源萜类化合物taladrimanin a；优选的，所述制剂为丸剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂或注射剂。
22.本发明的混源萜类化合物taladrimanin a是从海洋篮状菌属真菌talaromyces sp.hm6-1-1的乙酸乙酯提取物中分离得到的。其化学结构采用核磁共振技术和高分辨质谱技术进行鉴定结果见表1，最终通过单晶衍射法确定其立体构型。
23.本发明的混源萜类化合物taladrimanin a也可以通过化学合成方法制备得到。
24.从实施例可以看出，本发明的混源萜类化合物taladrimanin a能够有效抑制金黄色葡萄球菌的生长。
25.本发明所述的混源萜类化合物taladrimanin a可以抗菌，包括但不限于，球菌、杆菌和螺旋菌。具体可以是金黄色葡萄球菌等等。
附图说明
26.图1是实施例1中本发明化合物混源萜类化合物taladrimanin a的结构式。
27.图2是实施例1中本发明化合物混源萜类化合物taladrimanin a的单晶衍射图。
28.图3是实施例2中taladrimanin a对人胃癌细胞集落形成的影响(a)和taladrimanin a对人胃癌细胞凋亡的影响(b)。
29.图4是实施例3抗菌实验的结果图。
具体实施方式
30.下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
31.实施例1：化合物taladrimanin a的制备与鉴定
32.菌种的准备：使用海水pda培养基，高温灭菌，制成平板，置于常温状态下，接种活化好的篮状菌属真菌talaromyces sp.hm6-1-1作为菌种；所述海水pda培养基成分为马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15-20g，1l海水；
33.篮状菌属真菌talaromyces sp.hm6-1-1的保藏信息如下：
34.保藏菌种：talaromyces sp.hm6-1-1，
35.保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心，
36.保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，
37.保藏编号：gdmcc no.62116，
38.保藏日期：2021年12月10日。
39.发酵种子液制备：在多个锥形瓶中分别装入海水pda液体培养基，高温灭菌后，接种上述菌种培养，将该培养物作为种子液；
40.接种：采用固体发酵方式，准备发酵瓶，加入大米固体发酵培养基，高温灭菌，接种上述种子液，室温静置培养；所述大米固体发酵培养基为每1l的三角锥瓶装大米70g，蛋白
胨0.3g，谷氨酸钠0.1g，100ml海水(采自厦门市白城海滩)；
41.萃取：待室温静置培养28天后，加入乙酸乙酯溶液500ml/瓶浸泡发酵产物，发酵产物溶入乙酸乙酯溶液中，浸泡后，将上层乙酸乙酯溶液倒出，每瓶提取3次，所得提取液用滤纸过滤，减压浓缩至固态，即得到乙酸乙酯提取浸膏。
42.分离：乙酸乙酯提取浸膏，经硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂，从体积比100:0，100:2，100:5，100:10，100:20，100:50，100:100，100:200，0:100进行梯度洗脱，然后以乙酸乙酯-甲醇为洗脱剂，从体积比100:100,0:100进行梯度洗脱，每个比例洗脱3l，其中石油醚-乙酸乙酯(体积比100:0)的洗脱液浓缩成为组分f1，石油醚-乙酸乙酯(体积比100:2)的洗脱液浓缩成为组分f2，石油醚-乙酸乙酯(体积比100:5)的洗脱液浓缩成为组分f3，石油醚-乙酸乙酯(体积比100:10，100:20)的洗脱液合并浓缩成为组分f4，石油醚-乙酸乙酯(体积比100:50，100:100)的洗脱液合并浓缩成为组分f5，石油醚-乙酸乙酯(体积比100:200，0:100)的洗脱液合并浓缩成为组分f6，乙酸乙酯-甲醇(体积比100:100)的洗脱液浓缩成为组分f7，乙酸乙酯-甲醇(体积比0:100)的洗脱液浓缩成为组分f8。组分f8以制备高效液相色谱法(从20％的乙腈到70％的乙腈梯度洗脱20分钟，流速10毫升/分钟)分离，得到化合物(10.1mg，保留时间18.1分钟)。
43.结构解析：无规则白色粉末；核磁数据见表1(850mhz下测定)；分子式c
28h38
o7，高分辨质谱hresims(positive)m/z 487.2689[m+h]
+
(calcd for c
28h39
o7,487.2696)，结果如图1所示。最终，化合物定义为taladrimanin a，其立体构型通过单晶衍射法确定，晶体结构如图2所示。
[0044]
表1.taladrimanin a的1h和
13
c nmr数据表
[0045]
[0046][0047]
实施例2：抗肿瘤活性实验
[0048]
实验方法
[0049]
人胃癌细胞系的培养：人胃癌细胞系mgc803和mkn28是从中国科学院细胞研究所(中国上海)获得的。所有细胞系均培养在补充有10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素(中国，杭州，northend biotechnology)的rpmi1640(hyclone)中，并在37℃，5％co2的培养箱中培养。
[0050]
细胞活力检测实验：胃癌细胞系mgc803和mkn28在96孔板中培养过夜，然后用不同浓度的taladrimanin a或顺铂处理。72小时后，进行cck8(nuoyang biotech，杭州，中国)测定以检查taladrimanin a对胃癌细胞活力的影响，并在450nm处测量吸光度。使用graphpad prism5软件(graphpad software inc，美国圣地亚哥)计算ic50。
[0051]
细胞凋亡实验：将mgc803细胞接种在6孔板中(1
×
105细胞/孔)过夜，用taladrimanin a(50和200μm)处理48小时。然后收获细胞并用预冷的pbs洗涤。加入fitc annexin v细胞凋亡检测试剂盒i(bd pharmingen，美国)中的结合缓冲液和染色试剂重悬细胞。使用流式细胞仪(bd biosciences，ca，usa)进行样品分析。
[0052]
细胞集落形成实验：将mgc803细胞分别以500个每孔的浓度加入6孔板中，过夜后以0、20、50、100和200μm浓度taladrimanin a加入各孔，24小时后更换培养基，继续培养10天，对细胞进行固定和结晶紫染色。
[0053]
实验结果：
[0054]
taladrimanin a细胞毒实验：使用cck8试验测定化合物taladrimanin a对胃癌细胞系mgc803和mkn28的影响。该化合物对所有癌细胞系均有明显的细胞毒作用，并且呈浓度依赖性，ic50值分别为71.8和122.7μm。阳性对照顺铂对以上细胞系均表现出强大的细胞毒性，ic50值分别为6.2、19.7μm。
[0055]
taladrimanin a抑制细胞集落形成：将mgc803细胞分别以500个每孔的浓度加入6孔板中，过夜后以0、20、50、100和200μm浓度的taladrimanin a加入各孔，24小时后更换培养基，继续培养10天，对细胞进行固定和结晶紫染色。结果如图3的a所示，实验显示，taladrimanin a可以浓度依赖型地减少胃癌细胞的集落形成。
[0056]
taladrimanin a对细胞凋亡的影响：使用annexin v-fitc/pi染色后进行流式细胞仪分析测定化合物taladrimanin a对mgc803细胞凋亡的影响。结果如图3的b所示，用50至200μm的taladrimanin a处理48小时后，48小时后按细胞凋亡试剂盒流程处理细胞并以
流式细胞仪检测细胞凋亡情况，结果显示，taladrimanin a能够以浓度依赖的方式诱导mgc803细胞的早期凋亡和晚期凋亡。
[0057]
在目前的研究中，申请人发现taladrimanin a对胃癌细胞系有细胞毒性作用，并能诱导细胞周期停滞和凋亡，具有开发为用于治疗人类癌症(尤其是胃癌)药物的潜力。
[0058]
实施例3：抗菌活性实验
[0059]
采用刃天青显色法作为检测活性的方法。刃天青显色法的原理是：活细胞中的乳酸脱氢酶能将刃天青(蓝色)转化为荧光物质试卤灵(粉红红色)，产生荧光信号。试卤灵会继续被细胞还原为无荧光的物质二氢试卤灵(白色)，使荧光信号下降，无活性的或死亡的细胞丧失了代谢能力而不能还原刃天青，也就不能产生荧光信号，所以该法能特异性检测活性细胞。
[0060]
抑菌实验采用96孔板操作，96孔中颜色呈蓝色，则代表样品对目标菌株有抑制活性；96孔中颜色呈粉红色或红色，则代表样品对目标菌株没有抑制活性。
[0061]
目标菌株菌悬液制备：取副溶血弧菌vibrio parahaemolyticus atcc 17802、取副溶血弧菌vibrio parahaemolyticus vp-hl、大肠杆菌escherichia coli cicc 10389和金黄色葡萄球菌staphylococcus aureus atcc 6538p，以10体积％接种于5mlmhb培养液(厂商：北京拜尔迪生物技术有限公司，货号：cm0405)中，于37℃180rpm/min振荡培养6到8小时后，用酶标仪测od值(od
600
＝0.08，可近似看成菌悬液浓度为108cfu/ml，以mhb培养液稀释菌悬液浓度到105cfu/ml(菌落数/毫升)。
[0062]
刃天青溶液：用无菌水配置5000μg/ml的刃天青(商购来源：国药化学试剂有限公司，货号：71035931)溶液。
[0063]
抗菌实验在96微孔板进行，化合物以dmso溶解，梯度稀释，同时设化合物阴性对照，溶剂阴性对照，阳性对照和空白对照。抗菌实验及mic(最低抑制浓度)的测定参考文献wibowo,a.；ahmat,n.；hamzah,a.s.；low,a.l.；mohamad,s.a.；khong,h.y.；sufian,a.s.；manshoor,n.；takayama,h.,malaysianol b,an oligostilbenoid derivative from dryobalanops lanceolata.fitoterapia 2012,83,1569-75。
[0064]
实验组(见图4)：
[0065]
a2-a3-a4-a5-a6-a7-a8-a9-a10:化合物溶液(依次是60.75ug/ml、30.375ug/ml、15.1875ug/ml、7.5938ug/ml、3.7969ug/ml、1.8984ug/ml、0.9492ug/ml、0.4746ug/ml、0.2373ug/ml)5μl+菌悬液(atcc 17802)175.5μl+刃天青溶液19.5μl；
[0066]
b2-b3-b4-b5-b6-b7-b8-b9-b10:化合物溶液(依次是60.75ug/ml、30.375ug/ml、15.1875ug/ml、7.5938ug/ml、3.7969ug/ml、1.8984ug/ml、0.9492ug/ml、0.4746ug/ml、0.2373ug/ml)5μl+菌悬液(vp-hl)175.5μl+刃天青溶液19.5μl；
[0067]
c2-c3-c4-c5-c6-c7-c8-c9-c10:化合物溶液(依次是60.75ug/ml、30.375ug/ml、15.1875ug/ml、7.5938ug/ml、3.7969ug/ml、1.8984ug/ml、0.9492ug/ml、0.4746ug/ml、0.2373ug/ml)5μl+菌悬液(cicc 10389)175.5μl+刃天青溶液19.5μl；
[0068]
d2-d3-d4-d5-d6-d7-d8-d9-d10:化合物溶液(依次是60.75ug/ml、30.375ug/ml、15.1875ug/ml、7.5938ug/ml、3.7969ug/ml、1.8984ug/ml、0.9492ug/ml、0.4746ug/ml、0.2373ug/ml)5μl+菌悬液(atcc 6538p)175.5μl+刃天青溶液19.5μl；
[0069]
a1、b1、c1、d1溶剂对照：dmso 5μl+mhb培养液175.5μl+刃天青溶液19.5μl；
[0070]
a11、b11、c11、d11空白对照：菌悬液175.5μl+刃天青溶液19.5μl；
[0071]
a12、b12、c12、d12阳性对照：氯霉素(50μg/ml)5μl+菌悬液175.5μl+刃天青溶液19.5μl；
[0072]
试验结果见图4。从图4可以看出，化合物阴性对照a11、b11、c11、d11为红色,溶剂阴性对照a1、b1、c1、d1为红色；化合物阳性对照a12、b12、c12、d12为蓝色,说明阴阳性试验结果正确，没有污染；d2-d4为蓝色,d5-d10为红色，说明当本化合物溶液浓度从60.75μg/ml降到15.1875μg/ml，对金黄色葡萄球菌staphylococcus aureus atcc 6538p具有抗菌效果，当浓度为7.5938ug/ml甚至更低时，则完全失去了抗菌效果。对其他三种病原菌则没有抑菌活性。
[0073]
综上可知，化合物taladrimanin a对金黄色葡萄球菌staphylococcus aureus atcc6538p的最低抑菌浓度为15.1875μg/ml。
[0074]
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

技术特征：
1.一种混源萜类化合物taladrimanin a，其特征在于，其结构式如式(a)所示，2.一种权利要求1所述混源萜类化合物taladrimanin a的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：菌种的准备：使用海水pda培养基，高温灭菌，制成平板，置于常温状态下，接种活化好的篮状菌属真菌talaromyces sp.hm6-1-1，作为菌种；发酵种子液制备：在锥形瓶中装入海水pda液体培养基，高温灭菌后，接种上述菌种培养，将该培养物作为种子液；接种：采用固体发酵方式，准备发酵瓶，加入高温灭菌后的大米固体发酵培养基，接种上述种子液后室温静置培养；萃取：待室温静置培养20-30天后，加入乙酸乙酯溶液浸泡发酵产物，发酵产物溶入乙酸乙酯溶液中，浸泡后，将上层乙酸乙酯溶液倒出，每瓶提取1-4次，所得提取液用滤纸过滤，减压浓缩至固态，即得到乙酸乙酯提取浸膏；分离：将乙酸乙酯提取浸膏经硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂，从体积比100:0～0:100进行梯度洗脱，得到8个组分，分别命名为组分f1到f8；组分f8以高效液相色谱法分离，得到化合物混源萜类化合物taladrimanin a。3.根据权利要求2所述混源萜类化合物taladrimanin a的制备方法，其特征在于，所述海水pda培养基成分为马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15-20g，1l海水；所述大米固体发酵培养基为大米70g，蛋白胨0.3g，谷氨酸钠0.1g，100ml海水。4.根据权利要求3所述混源萜类化合物taladrimanin a的制备方法，其特征在于，所述海水为厦门市白城海滩的海水。5.根据权利要求2所述混源萜类化合物taladrimanin a的制备方法，其特征在于，所述分离步骤中石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂，从体积比100:0～0:100进行梯度洗脱为用石油醚-乙酸乙酯洗脱的体积比依次为100:0，100:2，100:5，100:10，100:20，100:50，100:100，100:200，0:100进行梯度洗脱。6.根据权利要求2所述混源萜类化合物taladrimanin a的制备方法，其特征在于，所述高效液相色谱法是从20％的乙腈到70％的乙腈梯度洗脱20分钟，流速10毫升/分钟。7.权利要求1所述混源萜类化合物taladrimanin a或其药用盐在制备抗肿瘤药物和抗菌药物中的用途。8.如权利要求7所述用途，其特征在于，所述抗肿瘤药物是指防治胃癌药物；优选的，所述抗肿瘤药物是指能诱导胃癌细胞周期停滞和凋亡的药物；更优选的，胃癌细胞是指胃癌
细胞系mgc803和mkn28细胞。9.如权利要求7所述用途，其特征在于，所述抗菌药物是指抗球菌、杆菌和螺旋菌的药物；优选的，所述球菌是指金黄色葡萄球菌；更优选的，所述抗菌药物是指能抑制金黄色葡萄球菌生长的药物；最优选的，所述金黄色葡萄球菌是指食源病原菌金黄色葡萄球菌staphylococcus aureus atcc 6538p。10.一种药物制剂，其特征在于，包括权利要求1所述混源萜类化合物taladrimanin a；优选的，所述制剂为丸剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂或注射剂。

技术总结
本发明公开了混源萜类化合物Taladrimanin A、制备方法及用途。该混源萜类化合物Taladrimanin A可用于制备抗肿瘤和抗菌药物。A可用于制备抗肿瘤和抗菌药物。A可用于制备抗肿瘤和抗菌药物。


技术研发人员：赖其良 王伟毅 邵宗泽 覃江江 管晓庆 夏金梅
受保护的技术使用者：中国大洋矿产资源研究开发协会（中国大洋事务管理局）
技术研发日：2021.12.29
技术公布日：2023/7/13