利用线虫的趋性行为的血液试样的检查方法与流程

1.本发明涉及利用线虫的趋性行为的血液试样的检查方法。


背景技术：

2.利用线虫可被生物相关物质或其处理物中的癌特异性气味引诱的特性构建了癌筛查。专利文献1公开了利用线虫对尿试样的响应性差异来判定试样的来源对象是否可能患有癌的方法。
3.现有技术文献
4.专利文献
5.专利文献1：wo2015/088039


技术实现要素：

6.本发明提供利用线虫的趋性行为的血液试样的检查方法。
7.本发明人发现，利用线虫的趋性行为能够检查或分析血液试样。本发明人发现，线虫对于来自癌患者的血液试样可显示引诱行为。本发明人还发现，线虫对于来自非癌对象(未患癌的对象)的血液试样可显示回避行为。本发明人进一步发现，使用对血液试样进行蛋白质除去处理而具有降低了的蛋白质含量的血液试样时，可改善线虫的趋性行为的响应性。本发明基于这些发现。
8.根据本发明，可提供以下的发明。
9.[1]一种检查或分析患有癌的对象或疑似患有癌的对象的血液试样的方法，其包括评价线虫对血液试样的趋性行为的步骤。
[0010]
[2]根据上述[1]所述的方法，其中，血液试样为血清试样或血浆试样。
[0011]
[3]根据上述[1]或[2]所述的方法，其中，血液试样为具有降低了的蛋白质含量的血清试样或血浆试样。
[0012]
[4]根据上述[1]～[3]中任一项所述的方法，其中，血液试样为供于除蛋白处理、从而具有降低了的蛋白质含量的血液试样。
[0013]
[5]根据上述[4]所述的方法，其中，除蛋白处理为利用包含选自由甲醇、甲酸和三氯乙酸组成的组中的1种以上的溶液的除蛋白处理、或利用超滤的除蛋白处理。
[0014]
[6]根据上述[1]～[5]中任一项所述的方法，其中，癌为实体癌。
[0015]
[7]根据上述[6]所述的方法，其中，癌为消化器官癌。
[0016]
根据本发明，能够对血液试样进行分析。
附图说明
[0017]
图1示出线虫对分别由2名癌患者和4名癌阴性的人(非癌对象)得到的尿试样的趋性行为的评价结果。
[0018]
图2示出线虫对分别由2名癌患者和2名非癌对象得到的血浆试样的趋性行为的评
价结果。
[0019]
图3示出线虫对分别由2名癌患者和2名非癌对象得到的血清试样的趋性行为的评价结果。
[0020]
图4示出线虫对将分别由2名癌患者和2名非癌对象得到的血浆试样供于蛋白质除去处理而得到的除蛋白处理后的血浆试样的趋性行为的评价结果。
[0021]
图5示出线虫对将分别由2名癌患者和2名非癌对象得到的血清试样供于蛋白质除去处理而得到的除蛋白处理后的血清试样的趋性行为的评价结果。
[0022]
图6是图4和图5的概要。
具体实施方式
[0023]
本说明书中，“对象”是指哺乳动物，例如为人。另外，本说明书中，“对象”以包括健康的对象、疑似为癌的对象和已罹患癌的对象的含义来使用。本说明书中，“疑似为癌的对象”除了包括明确疑似为癌的对象以外，还包括未具体地疑似为癌的对象。
[0024]
本说明书中，“癌”是指恶性肿瘤。癌大致可分为造血系统肿瘤和实体癌。作为造血系统肿瘤，可列举白血病、恶性淋巴瘤和骨髓瘤等。作为实体癌，可列举：胃癌、食道癌、大肠癌、结直肠癌、胆囊癌、胰腺癌等消化器官癌；肺癌、乳腺癌、肝癌、子宫癌、卵巢癌、头颈癌和舌癌等实体癌；骨肉瘤、软骨肉瘤、横纹肌肉瘤、平滑肌肉瘤、纤维肉瘤、脂肪肉瘤和血管肉瘤等肉瘤；软骨肉瘤、尤因肉瘤、恶性血管内皮瘤、恶性施万瘤、骨肉瘤、软组织肉瘤等肉瘤；肝母细胞瘤、髓母细胞瘤、肾母细胞瘤、神经母细胞瘤、胰母细胞瘤、胸膜肺母细胞瘤、视网膜母细胞瘤等母细胞瘤。
[0025]
本说明书中，“检测癌”可以替换为“检测癌细胞”、“鉴定癌”、“判定癌”、“用于辅助癌诊断的方法”、“获取用于诊断癌的备用信息的方法”等。本发明的方法是产业上可利用的方法。一个方式中，本发明的方法不为由医师进行的方法。一个方式中，本发明的方法不包括医疗行为。
[0026]
本说明书中，“线虫”是指秀丽隐杆线虫(caenorhabditis elegans)。关于线虫，从各种环境分离出的株登录和公开于美国明尼苏达大学生物科学部的线虫遗传学中心(caenorhabditis genetics center，cgc)，并且可分开出售。因此，本领域技术人员可以从cgc获得已知的大部分株。从能够通过自体受精进行繁殖的观点出发，可优选使用雌雄同体。
[0027]
本说明书中，“趋性行为”是指引诱行为或回避行为。引诱行为是指缩短与某种物质的物理距离的行为，回避行为是指扩大与某种物质的物理距离的行为。将诱发引诱行为的物质称为引诱物质，将诱发回避行为的物质称为回避物质。线虫具有通过嗅觉而被引诱物质引诱、并避开回避物质的性质。将被引诱物质引诱的行为称为引诱行为(本说明书中有时称为“阳性”)，将避开回避物质的行为称为回避行为(本说明书中有时称为“阴性”)。另外，将引诱行为和回避行为统称为趋性行为。
[0028]
本说明书中，“野生株”是指线虫的野生株，可列举例如通常作为野生株的n2 bristol株。
[0029]
本说明书中，“血液试样”是指包含从对象得到的血液的试样。作为血液试样，可列举例如血清试样和血浆试样。本说明书中，“被测试样”是指成为检查对象的试样。
[0030]
根据本发明，提供在患有癌或疑似患有癌的对象中对其生物试样(特别是血液试样)进行检查的方法(或进行分析的方法)。根据本发明，另外，本发明的方法还可以是在患有癌或疑似患有癌的对象中检测癌的方法(或预测癌的方法、或诊断癌的方法、或获取治疗效果的基础信息的方法)，其包括评价线虫对前述对象的尿试样的趋性行为的步骤。本发明的方法可以是产业上可利用的发明。本发明的方法可以是非医疗性方法。
[0031]
作为线虫，可以使用野生型的线虫(例如n2 bristol株)。线虫株对于癌患者的尿显示引诱行为，因此这样的对癌患者的尿显示引诱行为的线虫可以在本发明中使用。
[0032]
血液试样可以由对象得到。关于血液试样，在通过本发明的方法进行评价时，可以用水等水性溶剂等溶剂进行稀释而制成稀释试样来使用。此时的稀释倍率可以为例如5倍以上、10倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、90倍以上、100倍以上、200倍以上、300倍以上、400倍以上、500倍以上、600倍以上、700倍以上、800倍以上、900倍以上、1000倍以上、2000倍以上、3000倍以上、4000倍以上、5000倍以上、6000倍以上、7000倍以上、8000倍以上、9000倍以上或10000倍以上的稀释倍率。稀释倍率另外可以为100倍以下、200倍以下、300倍以下、400倍以下、500倍以下、600倍以下、700倍以下、800倍以下、900倍以下、1000倍以下、2000倍以下、3000倍以下、4000倍以下、5000倍以下、6000倍以下、7000倍以下、8000倍以下、9000倍以下、10000倍以下的稀释倍率。一个方式中，对于血液试样，可以以5倍至100000倍、例如10倍至10000倍、50倍至2000倍、50倍至500倍、或500倍至5000倍的稀释倍率进行试样稀释而制成稀释试样来使用。
[0033]
尿试样可以由对象得到。关于尿试样，在通过本发明的方法进行评价时，可以用水等溶剂进行稀释。进行稀释时，例如可以为5倍至20000倍的稀释倍率，例如可以为10倍至10000倍的稀释倍率，例如可以为10倍至5000倍的稀释倍率，可以为10倍至2000倍的稀释倍率，例如可以为100倍至1000倍的稀释倍率，线虫对于经稀释的尿试样也显示趋性行为。本发明的一个方式中，尿的稀释倍率可以设为例如100倍或1000倍，或者可以设为包括100倍和1000倍在内的、2个以上的稀释倍率。例如，狗的尿试样的稀释倍率可以为10倍至2000倍的稀释倍率、例如100倍至1000倍的稀释倍率。例如，猫的尿试样的稀释倍率可以为5倍至20000倍的稀释倍率，可以为10倍至10000倍的稀释倍率、例如500倍至5000倍的稀释倍率。另外，例如小鼠的尿试样的稀释倍率可以为5倍至20000倍的稀释倍率，可以为10倍至10000倍的稀释倍率、例如500倍至5000倍的稀释倍率。
[0034]
关于试样的稀释倍率，可以制作分别由癌患者和非癌对象得到的被测试样(例如血液试样)的稀释系列(例如2倍～10倍的稀释系列)并评价线虫对于这些稀释系列的趋性行为，由本领域技术人员适宜地确定对于来自癌患者和非癌患者的尿良好地显示不同响应性的稀释倍率。稀释倍率可以为例如100倍至20000倍、例如500倍至10000倍、例如1000倍至10000倍。从提高检查精度的观点出发，可以适当地研究稀释浓度而确定显示更优良的分离能力的稀释倍率后进行检查或分析。另外，分析也可以使用多个稀释倍率的试样来进行。
[0035]
可以由试样(例如血液试样)通过常规方法得到血清或血浆。血清为血液凝固时的液体成分。血浆为血液中的除细胞以外的成分。具体而言，血浆可以为对血液进行离心分离而得到的上清。
[0036]
血液试样可以在通过蛋白质除去处理而降低所含蛋白量后供于本发明的分析。因此，本发明中，血液试样可以为具有降低了的蛋白质含量的血液试样。本发明的一个方式
中，血液试样可以为具有降低了的蛋白质含量的血浆。本发明的一个方式中，血液试样可以为具有降低了的蛋白质含量的血清。降低了的蛋白质含量是指：比通常的血液试样中所含的蛋白质含量少的蛋白质含量。具有降低了的蛋白质含量的血液试样(例如血清和血浆)例如可以通过将血液试样(例如血清和血浆)供于蛋白质除去处理而得到。作为蛋白质除去处置，没有特别限定，可以使用本领域技术人员通常所使用的方法。作为蛋白质除去处理，可列举例如下述方法：将选自由酸(例如甲酸、高氯酸、三氯乙酸和偏磷酸等)和有机溶剂(例如丙酮、乙腈、甲醇和乙醇等)组成的组中的1种以上试剂(例如蛋白质变性剂)添加于试样中而使蛋白质变性、不溶化，从而从试样中除去蛋白质的方法。作为蛋白质除去处理，另外可列举通过超滤、例如使用膜滤器(离心过滤装置等)的超滤、透析和超速离心分离等物理方法从试样中除去蛋白质的方法。得到的血液试样可以利用水等溶剂稀释并供于本发明的分析。即，血液试样可以为具有降低了的蛋白质含量的血液试样(例如血浆和血清等)的稀释物。
[0037]
线虫的趋性行为的评价可以如下实施：将试样(例如尿试样或血液试样)与线虫分别配置在隔着一定距离(例如约0cm～约5cm左右、例如1cm～5cm的距离)的位置，观察线虫是显示被试样(例如尿试样或血液试样)引诱的行为、还是显示回避行为。趋性行为的观察例如可以在琼脂培养基等固体培养基上进行。
[0038]
使用线虫的被测试样的分析方法
[0039]
使用线虫的试样的分析方法可以如下进行：将由对象得到的被测试样(例如尿或血液试样)与线虫隔着一定距离而配置，观察线虫对被测试样是显示引诱行为、还是显示回避行为。然后，在显示引诱行为时，可以评价为对象已罹患癌或有此可能性。另外，显示回避行为时，可以评价为对象未患癌或有此可能性。使用人的样本的分析方法的例子如通过引用而将其整体引入本说明书中的wo2015/088039中所公开那样。
[0040]
更详细而言，使用线虫的被测试样(例如尿试样或血液试样)的分析方法例如可包括下述步骤：
[0041]
在培养皿(例如，导入了固体培养基的培养皿)中配置由对象得到的被测试样(例如尿试样或血液试样)；
[0042]
在配置有被测试样的培养皿中，在与被测试样隔着一定距离的位置配置线虫；和
[0043]
在配置后使线虫产生行为。
[0044]
使用线虫的试样(例如尿试样或血液试样)的分析方法例如可包括下述步骤：在线虫对被测试样显示引诱行为时，确定为对象已罹患癌或有已罹患癌的可能性。另外，使用线虫的试样(例如尿试样或血液试样)的分析方法中，在线虫对被测试样显示引诱行为时，例如可能表示试样所来源的对象有已罹患癌的可能性。
[0045]
线虫的趋性行为可以通过靠近被测试样的线虫数与远离被测试样的线虫数的差或比来进行评价。基于线虫数的差评价的情况下，差为正值时，整体上被测试样诱发引诱行为，可以评价为来自癌患者的试样；并且/或者，在差为负值时，整体上被测试样诱发回避行为，可以评价为来自未患癌的对象的试样。另外，基于线虫数的比评价的情况下，比为1以上时，被测试样诱发引诱行为，可以评价为来自癌对象的试样，并且/或者，比小于1时，被测试样诱发回避行为，可以评价为来自未患癌的对象的试样。另外，线虫的趋性行为例如可以如下所述地以趋性指数为指标来评价。
[0046][0047]
{式中，a为对被测试样显示引诱行为的线虫数，b为对被测试样显示回避行为的线虫数。}
[0048]
在趋性指数为正值时，整体上被测试样诱发引诱行为，可以评价为来自患有癌的对象的试样，在趋性指数为负值时，整体上被测试样诱发回避行为，可以评价为来自未患癌的对象的试样。
[0049]
趋性指数越接近1意味着线虫显示引诱行为的比率越大，越接近-1意味着线虫显示回避行为的比率越大，越接近0越意味着线虫既不显示引诱行为也不显示回避行为。趋性指数的绝对值越大则行为评价结果越明确。显示出趋性行为的线虫和显示出回避行为的线虫为同等程度时，可以设为阳性(在设为阳性时，可以进一步实施精密检查)，也可以从评价对象中排除。本发明中，可以将呈阳性的被测试样所来源的个体进一步供于精密检查，从而确定该个体是否患有癌。在对不同的2个以上稀释倍率的被测试样进行检查时，从提高灵敏度的观点出发，可以在对任一稀释倍率的试样呈阳性时确定为癌，从提高特异性的观点出发，可以在均呈阳性时确定为癌。
[0050]
本发明可以包括下述步骤：通过线虫的趋性行为的评价系统评价由患有癌的对象或疑似患有癌的对象得到的尿试样，之后通过线虫的趋性行为的评价系统评价由该对象得到的血液试样。
[0051]
通过本发明的方法被评价为患有癌或有此可能性的对象可在之后由医师通过癌诊断来进行是否为癌的确定诊断。通过本发明的方法被评价为患有癌或有此可能性的对象可以进一步接受精密检查而接受癌的确定诊断。通过本发明的方法被评价为患有癌或有此可能性的对象之后可以接受癌治疗(例如化学疗法、放射线疗法和外科手术切除、以及这些的组合等)。
[0052]
根据本发明，可提供用于本发明的分析方法、检测癌的方法、检测癌细胞的方法、鉴定癌的方法、判定癌的方法、用于辅助癌的诊断的方法、获取用于诊断癌的备用信息的方法的包含线虫或其卵的组合物或试剂盒。试剂盒除了包含线虫或其卵以外，还可以包含线虫的行为评价系统(例如培养皿、琼脂和操作说明书)和或其一部分。
[0053]
根据本发明，提供线虫在制造用于本发明的分析方法、检测癌的方法、检测癌细胞的方法、鉴定癌的方法、判定癌的方法、用于辅助癌的诊断的方法、或获取用于诊断癌的备用信息的方法的组合物或试剂盒中的应用。
[0054]
实施例
[0055]
实施例1：尿试样或血液试样的化学趋性分析
[0056]
本实施例中，基于wo2015/088039中记载的步骤“(3)利用线虫的嗅觉的检测”，将2名患有胃癌的人患者和4名癌阴性的人对象的尿用水稀释10倍(条件1)和稀释100倍(条件2)并进行分析。结果如图1所示，线虫对于2名胃癌患者的尿显示引诱行为，对于癌阴性的人的尿显示回避行为。
[0057]
因此，从前述2名胃癌患者(se-005和se-006)和选自前述4名癌阴性的人中的2名(se-001和se-002)采集血液试样，通过常规方法得到血清和血浆。对于血清和血浆，未处理，或利用有机溶剂处理(甲醇：甲酸＝1000：1)或酸处理(10％三氯乙酸)或超滤(按照制造
商手册使用amicon ultra 3k)进行处理，将各试样用水稀释后，按照上述步骤评价线虫对该稀释试样的趋性行为。
[0058]
(1)线虫对未处理的血浆、血清的趋性
[0059]
＜方法＞
[0060]
进而，确认了线虫对实施例1中使用的对象se-001、se-002、se-005和se-006的未处理的血浆和血清的趋性。将未处理的血浆和血清分别用水稀释。稀释率设为10-2
、10-3
、10-4
或10-5
这四种，确认了这些之中观察到癌患者的引诱的稀释倍率。
[0061]
＜结果＞
[0062]
关于血浆，如图2所示，在10-2
稀释时，与实施例1的尿样本同样地，对于健康者样本显示回避、对于癌患者显示引诱。另外，对于健康者的血浆，随着稀释倍率提高，观察到趋性变为引诱倾向，另一方面，对于癌患者的血浆，在任一稀释倍率下均确认到引诱。
[0063]
关于血清，如图3所示，在10-2
或10-3
的稀释倍率时，对于健康者显示回避、对于癌患者显示引诱。另一方面，在进一步提高稀释倍率时，未观察到相同的倾向。
[0064]
(2)线虫对除蛋白处理后的血浆、血清的趋性
[0065]
＜方法＞
[0066]
接着，对于血浆和血清，分别通过超滤(amicon ultra 3k)、甲醇/甲酸处理(1000：1)、或10％三氯乙酸(tca)处理这3种方法进行除蛋白处理，制成血液试样。将得到的血液试样进一步用水稀释。血液试样的稀释倍率设为10-2
、10-3
、10-4
或10-5
。之后对稀释试样评价线虫的趋性。但是，在用甲醇/甲酸处理进行除蛋白处理时，将上清用水稀释至2倍后，制成血液试样。
[0067]
＜结果＞
[0068]
如图4和5所示，在使用血浆和血清的检查中，通过任一除蛋白处理，对于癌与健康者来源的试样中的线虫的响应性均有分离能力提高的倾向。另外，使用血浆的检查与使用血清的检查相比，能够进行分辨率高的检查。
[0069]
可知：在使用血清的检查中，利用甲醇/甲酸或tca的除蛋白更有效、分离能力高、优良。

技术特征：
1.一种检查或分析患有癌的对象或疑似患有癌的对象的血液试样的方法，其包括评价线虫对血液试样的趋性行为的步骤。2.根据权利要求1所述的方法，其中，血液试样为血清试样或血浆试样。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，血液试样为具有降低了的蛋白质含量的血清试样或血浆试样。4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，血液试样为供于除蛋白处理、从而具有降低了的蛋白质含量的血液试样。5.根据权利要求4所述的方法，其中，除蛋白处理为利用包含选自由甲醇、甲酸和三氯乙酸组成的组中的1种以上的溶液的除蛋白处理、或利用超滤的除蛋白处理。6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，癌为实体癌。7.根据权利要求6所述的方法，其中，癌为消化器官癌。

技术总结
本发明提供血液试样的分析方法。根据本发明，提供例如检查或分析患有癌的对象或疑似患有癌的对象的血液试样的方法，其包括评价线虫对血液试样的趋性行为的步骤。根据本发明，例如由此提供评价对象是否患有癌的方法。如由此提供评价对象是否患有癌的方法。如由此提供评价对象是否患有癌的方法。


技术研发人员：广津崇亮
受保护的技术使用者：广津生物科学株式会社
技术研发日：2021.11.16
技术公布日：2023/7/12