表达ClyA-IL10的融合基因、表达载体、分泌抗炎性囊泡的益生菌及其应用

表达clya-il10的融合基因、表达载体、分泌抗炎性囊泡的益生菌及其应用
技术领域
1.本发明涉及融合基因技术领域，特别是涉及表达clya-il10的融合基因、表达载体、分泌抗炎性囊泡的益生菌及其应用。


背景技术：

2.炎症性肠病(ibd)以一种累及回肠，直肠，结肠的慢性肠道炎症，主要包括溃疡性结肠炎和克罗恩病。溃疡性结肠炎主要累及粘膜层和粘膜下层，主要的治疗方式包括非甾体类抗炎药，免疫调节剂，生物制剂，皮质类固醇治疗等。研究表明，不平衡的菌群与失调的免疫反应有关。与健康个体相比，ibd患者有较少的抗炎细菌和/或较多的促炎细菌。患有ibd的患者会发生模式识别受体和促炎基因的改变，这会引起肠道免疫系统的异常激活，并导致慢性肠道炎症和氧化应激。而工程化益生菌是近年来治疗ibd的极具潜力的新疗法。现有的工程化肠道菌群治疗ibd主要集中于抗炎细胞因子的分泌，导致该蛋白主要在肠道粘膜上皮层富集，仅能够有效应对粘膜层上皮层，而进入粘膜固有层发挥作用效果甚微。并且普通的工程化肠道菌群无法通过温度的改变来调节药物释放量。


技术实现要素：

3.为了解决上述问题，本发明提供了表达clya-il10的融合基因、表达载体、分泌抗炎性囊泡的益生菌及其应用。利用本发明提供的表达clya-il10的融合基因构建的益生菌可以37℃环境下释放富含il-10的外膜囊泡，可有效穿透粘膜固有层，调节肠道内炎症，另外，随着温度升高，该益生菌可释放大量携带il-10蛋白的外膜囊泡，可以通过温度的改变来调节药物释放量。
4.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
5.本发明提供了一种表达clya-il10的融合基因，所述融合基因的核苷酸序列包括seq id no.1所示的核苷酸序列。
6.本发明还提供了一种表达clya-il10的表达载体，所述表达载体包括上述技术方案所述的融合基因和基础载体。
7.优选的，所述基础载体包括pet-3a载体。
8.优选的，所述融合基因位于pet-3a载体的xba i和bamh i酶切位点之间。
9.本发明还提供了一种分泌抗炎性囊泡的益生菌，所述益生菌包括大肠杆菌和上述技术方案所述的表达载体。
10.优选的，所述大肠杆菌包括top10菌株。
11.本发明还提供了一种具有抗炎作用的益生菌制剂，所述益生菌制剂包括益生菌和/或益生菌分泌的外囊泡，所述益生菌包括上述技术方案所述的益生菌。
12.本发明还提供了上述技术方案所述的融合基因或上述技术方案所述的表达载体或权上述技术方案所述的益生菌或上述技术方案所述的益生菌制剂在制备抗炎药物中的
应用。
13.本发明还提供了上述技术方案所述的融合基因或上述技术方案所述的表达载体或上述技术方案所述的益生菌或上述技术方案所述的益生菌制剂在制备治疗炎症性肠病药物中的应用。
14.优选的，所述炎症性肠病包括溃疡性结肠炎和克罗恩病。
15.有益效果：
16.本发明提供了一种表达clya-il10的融合基因，所述融合基因的核苷酸序列包括seq id no.1所示的核苷酸序列。il-10需要以二聚体的形式发挥作用，本发明所提供的融合基因通过在表达clya(溶细胞素a)序列的c末端连接了两段il-10编码序列，两段il-10序列以linker相连，从而使得构建的融合基因可以特异地在细菌外膜囊泡中富集，细菌外膜囊泡可有效穿透粘膜固有层，调节肠道内炎症；另外，本发明在整体编码序列前加上了原核生物rna温度感受元件rose element，可以通过温度的改变来调节药物释放量。利用本发明提供的表达clya-il10的融合基因构建的益生菌可以37℃环境下释放富含il-10的外膜囊泡，可有效穿透粘膜固有层，调节肠道内炎症，并且可以通过局部升温的方式(可以通过聚焦超声的方式提高腹部局部肠道内的温度)提高肠道内温度，激活细菌内部的温度感应元件，促进细菌外膜囊泡的分泌，从而达到增大药量的效果。
附图说明
17.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
18.图1为细菌及细菌外囊泡蛋白鉴定结果；
19.图2为pbs组，dss组，dss+il-10ecoli组小鼠体重变化结果图；
20.图3为pbs组，dss组，dss+il-10ecoli组小鼠结肠长度图；
21.图4为pbs组，dss组，dss+il-10ecoli组小鼠结肠长度变化结果图；
22.图5为pbs组，dss组，dss+il-10ecoli组小鼠肠道炎症情况变化结果图；
23.图6为灌胃后il-10ecoli在胃及肠道内分布情况；
24.图7为pbs组，dss组，dss+il-10ecoli组小鼠肠道炎症调控基因表达变化结果图；
25.图8为灌胃后il-10ecoli在结肠内分布情况，其中a或b的右下角标尺为100μm；
26.图9为生物安全性评价结果，其中a为肝脏，脾脏的he染色结果，b为肝功能检测结果。
具体实施方式
27.本发明提供了一种表达clya-il10的融合基因，所述融合基因的核苷酸序列包括seq id no.1所示的核苷酸序列，具体如下：
28.[0029][0030]
其中大写且下划线“__”标注的序列atgacttacttgctgaatctctttatgacc(seq id no.2)为编码rose element元件的序列，rose element元件转录为rna时为发夹结构，在高温环境下其发夹结构熔解有利于核糖体的进入及翻译过程的进行，可以通过温度的改变来调节药物释放量；
[0031]“aggag”为sd序列，位于编码rose element元件的序列的第21和第22位之间，是原核生物的核糖体识别序列；
[0032]
加粗的序列为编码clya(溶细胞素a)的序列，溶细胞素a可以特异地在细菌外膜囊泡中富集，细菌外膜囊泡可有效穿透粘膜固有层，从而将il-10递送到粘膜固有层，调节肠道内炎症；
[0033]
小写没有下划线的序列gattacaaagacgacgacgataaagactacaaggacgatgacgataaaga ctacaaggacgacgacgataaa(seq id no.3)为编码3
×
flag标签的序列，可用于鉴定融合基因是否转化成功；
[0034]
双下划线的序列的序列(seq id no.4)或no.4)或(seq id no.5)为编码linker蛋白的序列，该序列表达的多肽作为柔性连接蛋白，不仅影响融合蛋白的构象，而且能更好发挥融合蛋白中clya和il10的作用；
[0035]
小写且下划线“__”标注的序列标注的序列
[0036]
(seq id no.6)为编码il10的序列，本发明通过构建两段il-10编码序列，两段il-10序列以linker相连，可以使il-10形成二聚体发挥作用。
[0037]
大写且下划线标注的序列标注的序列
[0038]
(seq id no.7)为非编码序列，具有碱基保护作用。
[0039]
本发明中的序列优选由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
[0040]
本发明还提供了一种表达clya-il10的表达载体，所述表达载体包括上述技术方案所述的融合基因和基础载体。
[0041]
在本发明中，所述基础载体优选包括pet-3a载体；所述融合基因优选位于pet-3a载体的xba i和bamh i酶切位点之间。
[0042]
本发明优选还提供了一种上述技术方案中所述表达载体的构建方法，包括以下步骤：
[0043]
在上述技术方案所述的融合基因的5’端前加xba i酶切序列，3’端后加bamh i酶切序列，得到含有酶切位点的融合基因；
[0044]
利用xba i酶和bamh i酶将pet-3a载体进行双酶切，得到大片段载体；
[0045]
将所述含有酶切位点的融合基因和所述大片段载体连接，得到所述表达载体。
[0046]
在本发明中，所述xba i酶切序列优选为：tctaga；所述bamh i酶切序列优选为：ggatcc。
[0047]
在本发明中，所述双酶切的条件优选包括：cutsmart缓冲液，37℃，20min；所述xba i酶和bamh i酶优选购自neb(北京)有限公司。
[0048]
在本发明中，所述连接的条件优选包括：t4 dna连接酶，1
×
t4 dna连接酶反应缓冲液，16℃温育16h。
[0049]
本发明还提供了一种分泌抗炎性囊泡的益生菌，所述益生菌包括大肠杆菌和上述技术方案所述的表达载体。
[0050]
在本发明中，所述大肠杆菌优选包括top10菌株。本发明所述的top10菌株能保证高拷贝质粒的稳定遗传。
[0051]
本发明优选还提供了上述技术方案所述益生菌的制备方法，包括：
[0052]
将表达载体导入大肠杆菌中，得到所述益生菌。
[0053]
在本发明中，所述导入的方法优选包括热休克。
[0054]
本发明提供的益生菌可大量分泌携带il-10蛋白的囊泡，并且该囊泡可有效穿过肠道固有层到达粘膜下层，激活treg细胞并发挥抗炎作用，有效调节肠道炎症。本发明通过在益生菌中的表达载体上插入了温度调控基因元件(rose element元件)，当温度超过37℃时，该益生菌可分泌大量抗炎囊泡，可在炎症高峰期使益生菌群大量释放抗炎性囊泡调节炎症。
[0055]
本方提供的益生菌可以通过口服的方式递送进肠道，可在肠道内进行有效的定植，具有以下优点：1.单药物治疗即能取得良好的抗炎效果，2.无其他不良反应，3.治疗方式简单，成本低。
[0056]
本发明还提供了一种具有抗炎作用的益生菌制剂，所述益生菌制剂包括益生菌和/或益生菌分泌外囊泡，所述益生菌包括上述技术方案所述的益生菌。
[0057]
本发明提供的益生菌制剂可以有效调节肠道炎症，作用机理同上，在此不在赘述。
[0058]
本发明还提供了上述技术方案所述的融合基因或上述技术方案所述的表达载体或上述技术方案所述的益生菌或上述技术方案所述益生菌制剂在制备抗炎药物中的应用。
[0059]
本发明还提供了上述技术方案所述的融合基因或上述技术方案所述的表达载体或上述技术方案所述的益生菌或上述技术方案所述益生菌制剂在制备治疗炎症性肠病药物中的应用。
[0060]
在本发明中，所述炎症性肠病优选包括溃疡性结肠炎和克罗恩病。
[0061]
本发明提供的益生菌制剂可以有效治疗炎症性肠病，作用机理同上，在此不在赘述。
[0062]
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的表达clya-il10的融合基因、表达载体、分泌抗炎性囊泡的益生菌及其应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0063]
实施例1
[0064]
一种表达clya-il10的融合基因，所述融合基因的，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
[0065]
一种表达clya-il10的表达载体，所述表达载体由以下方法构建得到：
[0066]
由南京金斯瑞生物科技有限公司合成核苷酸序列如seq id no.1所示的融合基因，并在融合基因的5’端前加xba i酶切序列(tctaga)，3’端后加bamh i酶切序列(ggatcc)，得到含有酶切位点的融合基因；
[0067]
利用xba i酶和bamh i酶将pet-3a载体进行双酶切，得到大片段载体；双酶切的条件为：cutsmart缓冲液，37℃，20min；所述xba i酶和bamh i酶购自neb(北京)有限公司；
[0068]
将所述含有酶切位点的融合基因和所述大片段载体连接，得到所述表达载体；所述连接的条件优为：t4 dna连接酶，1
×
t4 dna连接酶反应缓冲液，16℃温育16h。
[0069]
实施例2
[0070]
一种分泌抗炎性囊泡的益生菌，由以下方法构建得到：
[0071]
将实施例1构建得到的表达载体通过热休克的方式转化至top10菌株中，随后进行琼脂糖lb涂板，16h后挑取克隆菌株进行测序，选择测序正确的菌株进行保留，得到所述益
生菌，记为il-10ecoli；
[0072]
测序所用引物为t7通用测序引物，核苷酸序列如seq id no.8所示：5'-taatacgactcactataggg-3'。
[0073]
测试例1
[0074]
细菌外囊泡的提取：
[0075]
将实施例2构建得到益生菌(浓度为5
×
105cfu/ml)1ml加入200ml lb培养基中，置于摇床中260r/min，37℃培养，待菌体在600nm的光密度为1.0时，分为两组，分别取1ml菌液，分别置于200ml lb培养基中，置于摇床中以160r/min的转速进行振荡培养，培养条件分别为：37℃培养和42℃培养。
[0076]
为避免不同温度对细菌生长速度造成影响，两组分别取100ml od
600
值均为1.0的细菌菌液，分别进行如下处理：5000r/min，4℃离心10min；收集上清和菌体沉淀，用0.45μm滤器将上清进行过滤，收集第一滤液；将第一滤液用0.22μm滤器进行过滤，收集第二滤液；将第二滤液在150000g离心力下，进行3h超速离心，得到沉淀物(即细菌外囊泡)。
[0077]
细菌及细菌外囊泡蛋白鉴定：
[0078]
用ripa分别裂解两组菌体(即上述收集的菌体沉淀)，其中菌体和ripa的质量体积比为2μg：100μl，冰上裂解30min。通过倍比稀释法进行蛋白定量并进行蛋白样品(浓度为2μg/μl)制备。配置12％的sds-page凝胶后加入蛋白样品进行电泳并将蛋白转移至nc膜上。用8％脱脂乳在tbst中封闭膜1h，用抗flag，抗il-10抗体进行孵育，分别用抗flag(一抗稀释比例为1:1000，二抗稀释比例为1:2000)，抗il-10(一抗稀释比例为1:1000，二抗稀释比例为1:2000)抗体进行4℃过夜孵育，其中抗体后括号内的比例为对应抗体的稀释比例，即抗体与抗体稀释液的体积比，结果见图1中的a。
[0079]
用ripa分别裂解两组沉淀物，其中沉淀物和ripa的质量体积比为2μg：100μl，冰上裂解30min。通过倍比稀释法进行蛋白定量并进行蛋白样品(浓度为2μg/μl)制备。配置12％的sds-page凝胶后加入蛋白样品进行电泳并将蛋白转移至nc膜上。用8％脱脂乳在tbst中封闭膜1h，用抗flag，抗il-10抗体进行孵育，结果见图1中的b。
[0080]
由图1中的a和b可知，在42℃条件下，同等数量细菌分泌的外膜囊泡数量更多，il-10及flag表达量显著高于37℃组。
[0081]
测试例2
[0082]
小鼠肠道ibd模型构建：6～8周龄雄性小鼠采取3％的dss(葡聚糖硫酸钠)水溶液饮用5天后，更换为常规灭菌水饮用5天进行建模。期间小鼠自由饮水进食，常规条件饲养。
[0083]
小鼠ibd模型构建成功后，将小鼠分为dss组，dss+il-10ecoli组，同时设置对照组记为pbs，对照组为健康小鼠，未进行ibd模型构建，每组6只小鼠。
[0084]
其中，对照组不进行任何处理；dss+il-10ecoli组小鼠在接受dss造模后，连续一周灌胃实施例2制备的益生菌il-10ecoli，益生菌il-10ecoli的浓度为2*109cfu/ml(pbs缓冲液重悬得到)，每次250μl/，每天一次；dss组小鼠在接受dss造模后，连续一周灌胃pbs缓冲液，每次250μl/，每天一次。
[0085]
处理完毕后，测定各组小鼠体重，结果见图2；测定体重后，所有组别小鼠麻醉后进行处死，打开腹腔找到结肠段组织，上端从回盲处剪断，下端至肛门上5mm剪断，测量各组结肠长度，结果见图3和图4。
[0086]
将各组结肠段组织取出放入预冷的pbs中，洗去表面血迹，去除肠内粪便，浸泡于多聚甲醛中，切片进行后续he染色，结果见图5。
[0087]
由图2可知，经dss处理后，小鼠体重显著减轻，而经过il-10ecoli治疗后，小鼠体重有所回升，其中pbs组小鼠的体重为26.30
±
1.42g，dss组小鼠的体重为21.53
±
0.875g，dss+il-10ecoli组小鼠的体重为24.64
±
2.73g。
[0088]
由图3和图4可知，经dss处理后，小鼠结肠长度显著缩短，而经过il-10ecoli治疗后，小鼠结肠长度恢复，pbs组小鼠的结肠长度为9
±
0.33cm，dss组小鼠的结肠长度为5.96
±
0.64cm，dss+il-10ecoli组小鼠的结肠长度为7.06
±
0.980cm。
[0089]
由图5可知，经dss处理后，he切片显示dss组小鼠肠道炎症明显，而pbs组和il-10ecoli治疗组小鼠肠道无明显炎症。
[0090]
测试例3
[0091]
检测益生菌il-10ecoli在肠道内分布情况
[0092]
小鼠肠道ibd模型构建：6～8周龄雄性小鼠采取3％的dss(葡聚糖硫酸钠)水溶液饮用5天后，更换为常规灭菌水饮用5天进行建模。期间小鼠自由饮水进食，常规条件饲养。
[0093]
小鼠ibd模型构建成功后，将小鼠分为dss组和dss+il-10ecoli组，同时设置对照组记为pbs，对照组为健康小鼠，未进行ibd模型构建，每组6只小鼠。
[0094]
dss+il-10ecoli组：将浓度为10μm的荧光染料对实施例2制备的益生菌il-10ecoli进行染色，37℃避光孵育30min后，用pbs重悬益生菌后，益生菌il-10ecoli的浓度为2
×
109cfu/ml，将重悬后的益生菌对小鼠进行灌胃，每次250μl/，每天一次；
[0095]
pbs组：不进行任何处理；
[0096]
dss组小鼠在接受dss造模后，连续一周灌胃pbs缓冲液，每次250μl/，每天一次。
[0097]
在灌胃后2h，6h，12h，24h处死dss+il-10ecoli组小鼠，并取小鼠胃及以下消化道(结肠、胃和小肠)，用小动物活体成像仪对小鼠消化道进行检测，结果见图6。
[0098]
由图6可知，随着时间推移，ecoli-il10在小鼠肠道内的分布逐渐向结肠移动，6h后其信号逐渐减弱。
[0099]
采用qpcr检测tnf-α(引物对为tnf-f和tnf-f)、ifn-γ(引物对为ifng-f和ifng-r)、il-2和il-6四种肠道炎症调控基因的表达量，检测的引物如下：
[0100]
ifng-f：5
’‑
atgaacgctacacactgcatc-3’，seq id no.9；
[0101]
ifng-r：5
’‑
ccatccttttgccagttcctc-3’，seq id no.10；
[0102]
tnf-f：5
’‑
ccgggagaagagggatagctt-3’，seq id no.11；
[0103]
tnf-r：5
’‑
tcggacagtcactcaccaagt-3’，seq id no.12；
[0104]
il-2-f：5
’‑
tgagcaggatggagaattacagg-3’，seq id no.13；
[0105]
il-2-r：5
’‑
gtccaagttcatcttctaggcac-3’，seq id no.14；
[0106]
il-6-f：5
’‑
tagtccttcctaccccaatttcc-3’，seq id no.15；
[0107]
il-6-r：5
’‑
ttggtccttagccactccttc-3’，seq id no.16；
[0108]
结果见图7。
[0109]
由图7可知，经dss处理后，小鼠促炎相关基因表达均显著升高，而pbs组和il-10ecoli治疗组小鼠肠道促炎基因表达显著低于dss组。
[0110]
il-10ecoli灌胃一周后，取小鼠结肠，去除粪便后进行冰冻切片。用兔抗flag一抗
对切片进行孵育，随后用cy5-羊抗兔二抗对切片进行二抗标记，随后用hoechst(稀释比例为1:1000)对细胞核进行染色。染色完成后进行激光共聚焦扫描，结果见图8，其中a为大肠杆菌，为短棒状，b图展示为粘膜上皮层及粘膜固有层中细菌外膜囊泡。
[0111]
由图8中的a可知，细菌及其外膜囊泡可以有效到达肠道上皮层，由图8中的b可知，细菌外膜囊泡可以到达肠道固有层。
[0112]
测试例4
[0113]
取不同处理组的小鼠肝脏和脾脏进行he染色切片，切片厚度为8mm，镜下观察各组he切片无显著差异，实验组小鼠肝脏和脾脏明显损伤，表明该益生菌无明显肝脾损伤(见图9中的a)。
[0114]
通过取不同治疗组小鼠血浆进行肝功能检测，结果见图9中的b，结果表明各组小鼠血浆ast和alt无显著差异，表明该益生菌对小鼠肝功能无显著影响。
[0115]
综上所述，利用本发明提供的表达clya-il10的融合基因构建的益生菌可以37℃环境下释放富含il-10的外膜囊泡，可有效穿透粘膜固有层，调节肠道内炎症，另外，随着温度升高，该益生菌可释放大量携带il-10蛋白的外膜囊泡，可以通过温度的改变来调节药物释放量。
[0116]
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

技术特征：
1.一种表达clya-il10的融合基因，其特征在于，所述融合基因的核苷酸序列包括seq id no.1所示的核苷酸序列。2.一种表达clya-il10的表达载体，其特征在于，所述表达载体包括权利要求1所述的融合基因和基础载体。3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述基础载体包括pet-3a载体。4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述融合基因位于pet-3a载体的xbai和bamhi酶切位点之间。5.一种分泌抗炎性囊泡的益生菌，其特征在于，所述益生菌包括大肠杆菌和权利要求2～4任一项所述的表达载体。6.根据权利要求5所述的益生菌，其特征在于，所述大肠杆菌包括top10菌株。7.一种具有抗炎作用的益生菌制剂，其特征在于，所述益生菌制剂包括益生菌和/或益生菌分泌的外囊泡，所述益生菌包括权利要求5或6所述的益生菌。8.权利要求1所述的融合基因或权利要求2～4任一项所述的表达载体或权利要求5或6所述的益生菌或权利要求7所述的益生菌制剂在制备抗炎药物中的应用。9.权利要求1所述的融合基因或权利要求2～4任一项所述的表达载体或权利要求5或6所述的益生菌或权利要求7所述的益生菌制剂在制备治疗炎症性肠病药物中的应用。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述炎症性肠病包括溃疡性结肠炎和克罗恩病。

技术总结
本发明涉及融合基因技术领域，特别是涉及表达ClyA-IL10的融合基因、表达载体、分泌抗炎性囊泡的益生菌及其应用。本发明所述融合基因的核苷酸序列包括SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。利用本发明提供的表达ClyA-IL10的融合基因构建的益生菌可以37℃环境下释放富含IL-10的外膜囊泡，可有效穿透粘膜固有层，调节肠道内炎症，另外，随着温度升高，该益生菌可释放大量携带IL-10蛋白的外膜囊泡，可以通过温度的改变来调节药物释放量。改变来调节药物释放量。改变来调节药物释放量。


技术研发人员：杨国栋 万卓 刘利 张伟
受保护的技术使用者：中国人民解放军空军军医大学
技术研发日：2023.05.04
技术公布日：2023/7/12