一种多肽TAT-MRGPRX1C及其应用

一种多肽tat-mrgprx1c及其应用
技术领域
1.本发明属于医药技术领域，具体涉及一种多肽tat-mrgprx1c及其应用。


背景技术：

2.过敏性哮喘以持久的气道炎症为主要特征，是常见的慢性炎症性疾病，th2细胞向肺迁移是过敏性哮喘发生炎症的关键。研究表明，β-arrestin 2参与调节哮喘炎症发生过程。哮喘小鼠模型研究显示：缺失β-arrestin 2的小鼠构建哮喘模型后不会出现气道炎症、气道高反应等哮喘表型，证实β-arrestin 2是调控小鼠哮喘表型的关键靶蛋白，靶向β-arrestin 2的药物研究将蕴含临床治疗的潜力。
3.β-arrestin 2作为很多gpcr(g protein coupled receptor)调控的关键蛋白，能够和gpcr相结合，其介导的信号通路同时受到gpcr结合所影响。过敏性哮喘炎症相关细胞中，mas相关g蛋白偶联受体x1(mrgprx1)发挥了重要作用，mrgprx1是一种g蛋白偶联受体，其功能受到β-arrestin 2的调控，mrgprx1通过胞内结构域和β-arrestin 2发生相互作用。β-arrestin 2竞争性地与mrgprx1细胞质区域结合，将其从g蛋白偶联中释放出来，并阻止更多g蛋白的结合。同时β-arrestin 2将通过独立的信号通路在过敏性哮喘疾病中发挥作用。
4.mrgprx1是一种典型的七次跨膜受体，胞内含有3个胞内loop和羧基末端区域。根据以往gpcr研究显示：mrgprx1和β-arrestin 2发生相互作用的部位主要为羧基末端。
5.以mrgprx1羧基末端氨基酸序列为基础设计多肽，很可能能够选择性干扰β-arrestin 2和mrgprx1的相互作用，该多肽将能够竞争性地与β-arrestin 2结合，阻止β-arrestin 2到mrgprx1的聚集，结合多肽药物后将阻止β-arrestin 2介导的信号通路，抑制th2细胞向肺迁移。因此，研究和开发靶向阻断β-arrestin2的多肽药物，将具有很好的临床应用前景，为过敏性哮喘的治疗提供新的思路。但现有技术中目前仍缺少相关研究。


技术实现要素：

6.针对现有技术的不足，本发明提供一种多肽tat-mrgprx1c及其应用，该多肽在制备治疗β-arrestin 2所介导的过敏性哮喘的药物中具有应用潜力。
7.本发明是通过以下技术方案实现的：
8.一种多肽tat-mrgprx1c，所述多肽tat-mrgprx1c的氨基酸序列如seq id no.1所示；其中，1-11位为穿膜肽tat，12-58位为mrgprx1c。
9.编码上述多肽tat-mrgprx1c的基因，所述基因的核苷酸序列如seq id no.2所示；其中，自5’末端起第1-33位为编码穿膜肽tat的核苷酸序列，第34-174位为编码mrgprx1c的核苷酸序列。
10.含有上述基因的表达盒、重组载体或重组菌。
11.上述多肽tat-mrgprx1c、上述基因或上述表达盒、重组载体或重组菌在制备治疗β-arrestin 2介导的炎症性疾病的药物中的应用。
12.优选地，所述β-arrestin 2介导的炎症性疾病为过敏性哮喘。
13.优选地，所述药物为任何药物治疗学上可接受的剂型。
14.优选地，所述药物还包括药学上可接受的递药载体。
15.本发明的有益效果如下：
16.本发明的多肽tat-mrgprx1c来源于mrgprx1，该多肽tat-mrgprx1c能够竞争性的与β-arrestin 2相结合，干扰β-arrestin 2所介导信号通路，从而抑制β-arrestin 2介导的炎症反应。本发明的多肽tat-mrgprx1c在制备治疗β-arrestin 2所介导的过敏性哮喘的药物中具有应用潜力。
附图说明
17.图1为实施例2中多肽tat-mrgprx1c对th2细胞趋化性的影响。
具体实施方式
18.下面结合附图与具体实施例对本发明做进一步详细说明，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
19.以下实施例中的定量实验，如无特殊说明，均设置三次重复，结果取平均值。
20.以下实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规的分子生物学方法。
21.以下实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
22.以下实施例中th2细胞来源于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。
23.实施例1多肽tat-mrgprx1c的获取
24.本实施例阐述了具有穿模活性的多肽tat-mrgprx1c的获取过程，具体步骤如下：
25.(1)以人源细胞cdna为模板通过pcr获得mrgprx1羧基末端多肽序列，上游引物如seq id no.3所示，下游引物如seq id no.4所示，在上游引物内插入tat编码序列(如seq id no.5所示)，在上、下游引物分别插入xhoi和bamhi酶切位点，通过酶切连接方法，构建pwaldo-tat-mrgprx1c大肠杆菌表达载体，并转化bl21(de3)表达菌株，获得重组子。
26.其中，pwaldo是pet28(a+)基础上插入了gfp-8his的载体，其合成可参考文献：drew,d.e.,von heijne,g.,nordlund,p.&de gier,j.w.green fluorescent protein as an indicator to monitor membrane protein overexpression in escherichia coli.febs lett 507,220-4(2001).
27.(2)接种重组子菌株于100ml lb培养基中，37℃过夜培养。转种至2l lb培养基中，37℃培养至od
600
约0.5～0.6之间，加入终浓度为0.1mm的iptg，22℃培养20h，8000g离心5min收集细胞。
28.(3)将细胞悬浮于100ml裂解缓冲液中(20mm tris-hcl，ph 8.5，300mm nacl和10％甘油)，加入200u dnasei，50μg/ml溶菌酶和蛋白酶抑制剂，高压均质机1200bar，4℃破碎细胞，18,000rpm，4℃离心30min去除细胞碎片；将含有目的蛋白的上清自然通过镍柱；冲洗缓冲液(20mm tris-hcl，ph 8.5，300mm nacl，10％甘油和30mm咪唑)洗80ml，洗脱(20mm tris-hcl，ph 8.5，300mm nacl，10％甘油和300mm咪唑)并收集蛋白质样品，通过分子筛柱子进一步纯化，此步骤能够获得较高纯度的多肽tat-mrgprx1c融合蛋白，可用于后续实施例的相关研究。
29.多肽tat-mrgprx1c的氨基酸序列如seq id no.1所示，由58个氨基酸残基组成；其中，1-11位氨基酸残基组成具有穿过细胞膜作用的区域，即穿膜肽tat，该区域和12-58位氨基酸前后位置可以调换，并且可以被具有相同作用的其他序列替换；12-58位氨基酸残基构成能够干扰β-arrestin 2蛋白质功能的区域，即mrgprx1c。
30.多肽tat-mrgprx1c编码基因的核苷酸序列如seq id no.2所示，长度为174bp；其中，自5’末端起第1-33位为编码穿膜肽tat的核苷酸序列，第34-174位为编码mrgprx1c的核苷酸序列。
31.实施例2多肽tat-mrgprx1c的应用研究
32.细胞趋化性：将培养好的th2细胞用胰蛋白酶消化(消化前加入0.2mg/ml实施例1获取的多肽tat-mrgprx1c处理2h)并重新悬浮于rpmi-1640培养基，使其终浓度为2
×
105个/ml。实验采用24孔transwell细胞培养小室，小室内放置有8μm孔的聚碳酸酯滤膜。底部小室加入600μl 10％ fbs/rpmi-1640培养基、10nm ccl22和0.2mg/ml多肽tat-mrgprx1c(以pbs作为对照)，加入100μl细胞悬液到滤膜上层。37℃培养90min，计数进入下室的细胞数目。
33.给予多肽后细胞形态未发现明显异常。如图1所示，多肽tat-mrgprx1c能够显著抑制过敏性哮喘相关th2细胞的趋化性。
34.由本实施例的实验结果可知，本发明的多肽tat-mrgprx1c能够竞争性地与β-arrestin 2结合，进而抑制β-arrestin 2所介导的过敏性哮喘相关th2细胞的趋化性，缓解th2细胞向肺迁移所诱发的喘息、气促、咳嗽、胸闷等症状，从而达到治疗过敏性哮喘的目的。
35.以上显示和描述了本发明的具体实施方式，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

技术特征：
1.一种多肽tat-mrgprx1c，其特征在于，所述多肽tat-mrgprx1c的氨基酸序列如seq id no.1所示；其中，1-11位为穿膜肽tat，12-58位为mrgprx1c。2.编码权利要求1所述多肽tat-mrgprx1c的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如seq id no.2所示；其中，自5’末端起第1-33位为编码穿膜肽tat的核苷酸序列，第34-174位为编码mrgprx1c的核苷酸序列。3.含有如权利要求2所述基因的表达盒、重组载体或重组菌。4.权利要求1所述多肽tat-mrgprx1c、权利要求2所述基因或权利要求3所述表达盒、重组载体或重组菌在制备治疗β-arrestin 2介导的炎症性疾病的药物中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述β-arrestin 2介导的炎症性疾病为过敏性哮喘。6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药物为任何药物治疗学上可接受的剂型。7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的递药载体。

技术总结
本发明公开了一种多肽TAT-MRGPRX1C及其应用，该多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；其中，1-11位为穿膜肽TAT，12-58位为MRGPRX1C。本发明的多肽TAT-MRGPRX1C来源于MRGPRX1，该多肽TAT-MRGPRX1C能够竞争性的与β-arrestin 2相结合，干扰β-arrestin 2所介导信号通路，从而抑制β-arrestin 2介导的炎症反应。本发明的多肽TAT-MRGPRX1C在制备治疗β-arrestin 2所介导的过敏性哮喘的药物中具有应用潜力。2所介导的过敏性哮喘的药物中具有应用潜力。2所介导的过敏性哮喘的药物中具有应用潜力。


技术研发人员：王中山 李健 张梦
受保护的技术使用者：徐州医科大学
技术研发日：2023.04.24
技术公布日：2023/7/12