一种提高水稻镉胁迫抗性的方法与流程

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种提高水稻镉胁迫抗性的方法。


背景技术：

2.镉(cd)是环境中毒性最大的重金属之一，是植物生长和发育的非必需元素。镉胁迫抑制植物的光合速率和酶活性，从而对植物氧化应激的防御系统等有负面影响，并影响稻米品质和产量。此外，镉很容易被水稻吸收并积累在谷物中，并通过食物链进入人体内，对人类的健康造成严重威胁，因此，挖掘到能够降低水稻镉吸收的优异基因，培育能够显著降低镉积累的水稻品种，从而解决大米镉含量超标的问题，对人类的健康至关重要。
3.许多研究揭示了(ca
2+
/h
+
)反向转运体(cax)家族基因在植物生长发育和各种胁迫反应适应性上起重要作用，尤其是调节了重金属(钙、镉、锰(mn)、锌(zn))及盐胁迫耐性。钙离子已被证明可以调节多种细胞功能，在不同的压力条件下调节植物的生长和发育，并在植物信号转导中发挥重要作用。
4.目前已报道不少参与了镉耐性和累积的基因，然而在常规和生物技术育种上得到应用的基因很少。如何降低水稻镉毒害对于在农业生产和保障国家粮食安全上具有重要意义。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题为：如何提高水稻镉胁迫抗性，降低水稻镉毒害。
6.本发明的技术方案为：一种提高水稻镉胁迫抗性的方法，在水稻植株中过表达oscax1c基因，从而提高水稻镉胁迫抗性，所述oscax1c基因编码seq id no.1所示的多肽。
7.进一步地，过表达oscax1c基因植株生长过程中添加钙离子。
8.进一步地，所述钙离子的浓度为3mm。
9.进一步地，过表达oscax1c基因的方法为构建oscax1c基因过表达载体，然后通过农杆菌转化水稻，获得过表达oscax1c基因的水稻植株。
10.进一步地，所述oscax1c基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
11.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
12.1.通过系统研究，首次公开了日本晴水稻转ubi启动子启动的水稻基因oscax1c株系，在镉胁迫环境下，增强镉耐性和降低镉转运。与野生型相比，转基因株系的根部镉浓度增加了8.1％，地上部镉浓度降低了20.2％，根部向地上部的镉转运率下降65.1％。
13.2.本发明首次公开了适当的施加适当外源钙(3mm)可以显著提高oscax1c的敲除和过表达株系的耐性，尤其增强了oscax1c的敲除系的耐性(几乎回补到了野生型水平)。
14.3.本发明发明了适当外源钙缓解镉毒害的方法，该方法不仅可以应用于常规水稻品种。另外对于基因编辑表现差的基因(如低镉耐性高镉累积)，也能明显得到改善。
15.4.本发明说明可将oscax1c基因应用于水稻镉累积的遗传改良和低镉积累品种的培育，尤其是施加外源钙可以进一步加快镉安全品种的培育。
附图说明
16.图1：基于crispr/cas9基因编辑及水稻基因ubi启动子启动水稻基因oscax1c敲除和过表达载体示意图和oscax1c表达量的鉴定。
17.图2：苗期镉胁迫水培条件下转基因株系的生长表型及镉累积情况。
18.图3：外源补充钙条件下oscax1c敲除和过表达株系的镉毒害缓解情况。
具体实施方式
19.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。
20.实施例1转基因水稻植株的构建
21.(1)针对水稻cax1c基因(loc_os02g21009，编码蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示，基因序列如seq id no.2所示)序列设计crispr/cas9基因编辑靶点。合成编辑靶点的核苷酸序列(seq id no.3，seq id no.4，seq id no.5和seq id no.6所示)，通过退火形成核苷酸二聚体结构，与cas9载体片段进行连接反应，构建水稻cax1c基因编辑载体crispr-cax1c。
22.(2)针对水稻cax1c基因序列设计过量表达载体引物(序列如seq id no.7和seq id no.8所示)，扩增水稻日本晴基因组上cax1c的基因片段，与插入具有ubi启动子的过表达载体片段进行连接反应，构建水稻cax1c基因过表达载体ubi:cax1c(如图1中b)。
23.(3)用含crispr-cax1c和ubi:cax1c质粒的根癌农杆菌侵染水稻愈伤组织，进行水稻遗传转化，获得转基因植株。具体步骤如下：
24.(3.1)愈伤组织的诱导和培养。取水稻品种日本晴授粉后12～15天未成熟种子经75％乙醇浸泡1min后，于naclo溶液中消毒，然后用解剖刀和摄子挑出幼胚并接种于n6d2培养基上(含300mg/l水解酪蛋白、500mg/l脯氨酸、500mg/l谷氨酰胺、30g/l蔗糖和2mg/l 2,4-d的固体ms培养基)诱导愈伤组织。
25.(3.2)农杆菌的培养。将构建好水稻cax1c的敲除载体crispr-cax1c和基因的过量表达载体ubi:cax1c转化农杆菌eha105，与水稻幼胚愈伤组织共培养侵染。
26.(3.3)抗性愈伤组织的筛选及转基因植株的再生。幼胚愈伤与农杆菌共培养3天后，切去胚芽并转入选择培养基n6d2s1进行选择培养，转移到预分化培养基上培养一周左右，再移至分化培养基上分化(12小时光照/天)。再生的小苗在1/2ms上生根壮苗，随后移入网室栽培。1/2ms培养基配方(1l)：2.215g ms粉末，10g蔗糖，7.8g琼脂粉，将ph调至5.8，120℃高压灭菌20min。
27.(4)通过将oscax1c基因特异性引物(序列如seq id no.9和seq id no.10)pcr扩增基因组片段进行测序，获得oscax1c基因敲除植株，其基因敲除片段如图1中a；通过oscax1c基因的定量引物(序列如seq id no.11和seq id no.12)检测oscax1c基因的表达水平，获得oscax1c的过量表达植株(如图1中c)。
28.实施例2检测oscax1c转基因系的镉耐性和镉转运
29.将野生型，3个oscax1c的敲除(ko1，ko2和ko3)和3个oscax1c过表达株系(oe1，oe2和oe3)经浸种，催芽后播种于减去底部的96孔板。水培1周后将长势一致的幼苗转移至96孔泡沫板上用水稻营养液培养1周后，分别用含0、20μm cdcl2营养液处理2周，每2-3天更换一
次营养液，营养液由2.5mm nh4no3、0.3mm kh2po4、1mm k2so4、1mm cacl2·
2h2o、1mm mgso4·
7h2o、0.5mm na2sio3·
9h2o、9μm mncl2·
2h2o、0.39μm na2moo4·
2h2o、20μm h3bo3、0.77μm znso4·
7h2o、0.32μm cuso4·
5h2o以及20μm fe-edta组成。用去离子水清洗至少3遍测定根长、株高，并将根系和地上部分分开，在70℃下烘烤3天测定根干重、地上干重。将干燥的样品粉碎，在120℃的浓hno3中湿消化30min，并在180℃用hclo4进一步消化，直到样品变得透明。然后用超纯水稀释样品。使用电感耦合等离子体质谱仪(icp-ms)测定金属浓度。如图2所示，镉胁迫下，oscax1c的敲除和过表达株系分别显著提高了镉的敏感和耐受性，具体表现在根长、株高、根干地上干重和总干重上。另外，oscax1c的敲除表达分别降低和增加在根部和地上部的镉累积，进而增加了镉转运，而oscax1c的过量表达分别增加和减少在根部和地上部的镉累积，进而减少了镉转运。
30.实施例3考察外源补充钙条件下oscax1c敲除和过表达株系的镉毒害缓解情况
31.将野生型，1个oscax1c的敲除(ko1)和1个oscax1c过表达株系(oe1)经浸种，催芽后播种于减去底部的96孔板。水培1周后将长势一致的幼苗转移至96孔泡沫板上用水稻营养液培养1周后，分别用含20μm cdcl2(正常钙)、20μm cdcl2+3mm cacl2(中度钙)营养液处理2周，每2-3天更换一次营养液。用去离子水清洗至少3遍测定根长、地上长，并将根系和地上部分分开，在70℃下烘烤3天测定根干重、地上干重。结果如图3所示，镉胁迫下，oscax1c的敲除和过表达株系分别显著提高了镉的敏感和耐受性，而适度的外源钙缓解了水稻镉毒害，尤其增强了oscax1c的敲除系的耐性(几乎回补到了野生型水平)，oscax1c过表达系的镉耐性也得到了明显提高，表现在根长、株高、根干重和地上干重。

技术特征：
1.一种提高水稻镉胁迫抗性的方法，其特征在于，在水稻植株中过表达oscax1c基因，从而提高水稻镉胁迫抗性，所述oscax1c基因编码seq id no.1所示的多肽。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，过表达oscax1c基因植株生长过程中添加钙离子。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述钙离子的浓度为3mm。4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，过表达oscax1c基因的方法为构建oscax1c基因过表达载体，然后通过农杆菌转化水稻，获得过表达oscax1c基因的水稻植株。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述oscax1c基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。

技术总结
本发明公开了一种提高水稻镉胁迫抗性的方法，在水稻植株中过表达OsCAX1c基因，从而提高水稻镉胁迫抗性，所述OsCAX1c基因编码SEQ ID No.1所示的多肽。通过在水稻中过表达OsCAX1c基因，可以在镉胁迫环境下，增强镉耐性和降低镉转运。与野生型相比，转基因株系的根部镉浓度增加了8.1％，地上部镉浓度降低了20.2％，根部向地上部的镉转运率下降65.1％。适当的施加外源钙可以显著提高OsCAX1c的敲除和过表达株系的耐性。和过表达株系的耐性。和过表达株系的耐性。


技术研发人员：邹文莉 孟丽君 陈粤彤 叶国友 张铭旆
受保护的技术使用者：佛山鲲鹏现代农业研究院
技术研发日：2023.04.23
技术公布日：2023/7/12