轻量级微卫星不稳定性检测装置及其应用的制作方法

1.本发明涉及分子生物学领域，具体涉及轻量级微卫星不稳定性检测装置及其应用。


背景技术：

2.高发病率和高死亡率使得结直肠癌成为全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，患病人数逐年攀升，半数以上的患者直接或者间接的死于结直肠癌，并且发病人群趋于年轻化，严重威胁人类生命健康及财产安全。由于癌症患者机体错配修复功能（mmr）缺陷导致短片段重复区域（微卫星区域）发生不同程度的插入（insertions）或者缺失（deletions）累积致使基因组微卫星不稳定（microsatellite instability，msi），大量针对结直肠癌的研究表明高水平的微卫星不稳定性与结直肠癌（colorectal cancer，crc）的发生和发证有密切关联，随着癌症分子机制深入研究及免疫检查抑制剂（immune checkpoint inhibitors，icis）药物的开发上市，自2017年美国fda陆续批准了pabolizumab（k药）和nivolumab（o药）作为msi-h/dmmr结直肠癌患者的后线治疗药物，2021年我国批准envolimab用于患有泛实体瘤和结肠直肠癌的msi-h/dmmr患者的后线治疗，相应临床研究表明对msi-h的患者采用免疫治疗时可明显提高5年生存率，降低肿瘤的扩散和转移，这使得微卫星不稳定性成为重要且成熟的肿瘤免疫治疗生物标志物。
3.微卫星不稳定性在不同癌肿中均有出现，但在结直肠癌和子宫内膜癌中尤其明显，因此也出现不同平台的检测产品，目前临床主要使用的有两类，第一类时通过检pcr检测与肿瘤密切相关的微卫星位点判断msi状态，目前国内外也有获批上市的产品；第二类则是临床常用的免疫组织化学法。随着高通量测序技术（next generation sequencing，ngs）发展和临床应用，美国fda批准f1cdx作为对msi-h泛实体瘤中pabrizumab (k药物)的伴随诊断，用于筛选可能受益于pabrizumab治疗的msi-h实体瘤患者，该方法颠覆了传统检测方法，将检测对象扩展到整个基因组而非局限性的几个位点，可通过检测少量的cfdna评价样品微卫星不稳定性，与此同时，ngs方法可同时完成其他肿瘤标志物的检出，例如与肿瘤免疫治疗相关的组织肿瘤突变负荷（tmb）和游离核酸肿瘤突变符合（btmb），拷贝数变异等。
4.虽然高通量测序技术相比荧光pcr技术具有很多扩展性功能，但检测流程冗长复杂，费用高昂，过度依赖于捕获探针及多重扩增引物而造成浪费，对待检测样本要求较高，针对低输入量，低肿瘤含量，肿瘤循环dna样本仍然存在挑战。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明提供了轻量级微卫星不稳定性检测装置及其应用。
6.本发明提供了轻量级微卫星不稳定性检测装置及其应用。本发明基于基因组重复原件alu末端特征，融合pcr扩增平台的快速及高通量测序平台的全面特征阐述一种高效，快捷的轻量级微卫星不稳定性检测装置，用于对临床样本快速精确检测，使得更多结直肠癌患者从免疫治疗中获益。
7.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了引物组，其包括：（ⅰ）、上游引物具有如seq id no.1所示的核苷酸序列；和（ⅱ）、下游引物具有如seq id no.2所示的核苷酸序列；或（ⅲ）、与（ⅰ）或（ⅱ）所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与（ⅰ）或（ⅱ）所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或（ⅳ）、与（ⅰ）~（ⅲ）任一项所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与（ⅰ）~（ⅲ）任一项所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或（
ⅴ
）、与（ⅰ）~（ⅳ）任一项所述核苷酸序列具有至少80%序列同源性的核苷酸序列。
8.在本发明的一些具体实施方案中，所述引物组基于alu重复原件亚型y的序列设计。
9.本发明还提供了标签引物组，其包括：（ⅰ）、indexing primer_i5具有如seq id no.3所示的核苷酸序列；和（ⅱ）、indexing primer_i7具有如seq id no.4所示的核苷酸序列；或（ⅲ）、与（ⅰ）或（ⅱ）所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与（ⅰ）或（ⅱ）所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或（ⅳ）、与（ⅰ）~（ⅲ）任一项所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与（ⅰ）~（ⅲ）任一项所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或（
ⅴ
）、与（ⅰ）~（ⅳ）任一项所述核苷酸序列具有至少80%序列同源性的核苷酸序列。
10.在本发明的一些具体实施方案中，所述标签引物组包括如下任意项：（ⅰ）、indexing primer_i5具有如seq id no.101~196任意所示的核苷酸序列；和（ⅱ）、indexing primer_i7具有如seq id no.5~100任意所示的核苷酸序列；或（ⅲ）、与（ⅰ）或（ⅱ）所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与（ⅰ）或（ⅱ）所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或（ⅳ）、与（ⅰ）~（ⅲ）任一项所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与（ⅰ）~（ⅲ）任一项所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或（
ⅴ
）、与（ⅰ）~（ⅳ）任一项所述核苷酸序列具有至少80%序列同源性的核苷酸序列。
11.在上述研究的基础上，本发明还提供了如下任意项在制备检测肿瘤试剂和/或试剂盒中的应用：（ⅰ）、所述引物组；和/或（ⅱ）、所述标签引物组；所述肿瘤包括但不限于结直肠癌和/或子宫内膜癌；所述检测根据msi score判断：msi score≥20%，判断为msi-h；10%≤所述msi socore《20%，判断为msi-l；所述msi score《10%，判断为mss。
12.在本发明的一些具体实施方案中，所述肿瘤还包括胃腺癌、直肠腺癌、直肠腺癌或子宫肉瘤中的一种或多种。
13.本发明还提供了试剂和/或试剂盒，包括如下任意项以及可接受的助剂或载体：（ⅰ）、所述引物组；和/或（ⅱ）、所述标签引物组。
14.本发明还提供了如下任意项在制备微卫星不稳定性检测装置中的应用：（ⅰ）、所述引物组；和/或（ⅱ）、所述标签引物组；和/或（ⅲ）、所述试剂和/或试剂盒；所述微卫星不稳定性检测的判断标准包括：msi score≥20%，判断为msi-h；10%≤所述msi socore《20%，判断为msi-l；所述msi score《10%，判断为mss。
15.本发明还提供了微卫星不稳定性检测装置，其包括如下任意项：（ⅰ）、所述引物组；和/或（ⅱ）、所述标签引物组；和/或（ⅲ）、所述试剂和/或试剂盒。
16.在本发明的一些具体实施方案中，所述微卫星不稳定性检测装置，还包括高通量测序文库、msi状态评价模块；所述高通量测序文库采用所述引物组、所述标签引物组或所述试剂和/或试剂盒pcr扩增构建；所述msi状态根据msi score判断：所述msi score≥20%，判断为msi-h；10%≤所述msi socore《20%，判断为msi-l；所述msi score《10%，判断为mss。
17.在本发明的一些具体实施方案中，所述msi状态评价模块为msisensor。
18.本发明还提供了扩增方法，包括如下步骤：步骤1：获得临床样本核酸；步骤2：采用所述引物组、所述标签引物组或所述试剂和/或试剂盒扩增。
19.本发明还提供了微卫星不稳定性检测方法，包括如下步骤：步骤1：获得临床样本核酸；步骤2：采用所述引物组、所述标签引物组或所述试剂和/或试剂盒pcr扩增，构建高通量测序文库，测序，收集数据；步骤3：对所述数据进行分析，根据msi score判断msi状态；所述msi score≥20%，判断为msi-h；10%≤所述msi socore《20%，判断为msi-l；所述msi score《10%，判断为mss。
20.本发明提供了微卫星不稳定性检测方法，包括如下步骤：步骤1：获得临床样本核酸；步骤2：采用所述引物组第一次扩增，1.8
×
磁珠纯化后获得纯化扩增产物；取所述纯化扩增产物，采用所述标签引物组第二次扩增，1.2
×
磁珠纯化后获得高通量测序文库，经定量混合测序，收集数据；步骤3：对所述数据进行分析，根据msi score判断msi状态；所述msi score≥20%，判断为msi-h；10%≤所述msi socore《20%，判断为msi-l；所述msi score《10%，判断为mss。
21.在本发明的一些具体实施方案中，所述第一次扩增的反应条件包括：
22.在本发明的一些具体实施方案中，所述第二次扩增包括：
23.在本发明的一些具体实施方案中，所述定量方式包括qubit。
24.本发明还提供了肿瘤的诊断方法，包括如下步骤：步骤1：获得临床样本核酸；步骤2：采用所述引物组、所述标签引物组或所述试剂和/或试剂盒pcr扩增构建高通量测序文库，测序，收集数据；步骤3：对所述数据进行分析，根据msi score判断msi状态；所述msi score≥20%，判断为msi-h，即为阳性；10%≤所述msi socore《20%，判断为msi-l，即为阴性；所述msi score《10%，判断为mss，即为阴性。
25.在本发明的一些具体实施方案中，所述肿瘤还包括胃腺癌、直肠腺癌、直肠腺癌或子宫肉瘤中的一种或多种。
26.本发明基于基因组重复原件alu末端特征，融合pcr扩增平台的快速及高通量测序平台的全面特征阐述一种高效，快捷的轻量级微卫星不稳定性检测装置，用于对临床样本快速精确检测，使得更多结直肠癌患者从免疫治疗中获益。
附图说明
27.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
28.图1示实施例3中基因组微卫星不稳定状态分析结果；其中，a示amm-seq与chosenone panel msi检测结果对比；b示amm-seq与chosenone panel检测结果一致性分析。
具体实施方式
29.本发明公开了轻量级微卫星不稳定性检测装置及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
30.术语解释：微卫星不稳定（msi）是指与同一个体的正常组织细胞的dna相比，肿瘤
细胞的基因组dna中单个、两个、三个、四个或五个核苷酸组成的重复序列的长度发生了改变。根据msi的程度，可以将msi分为微卫星高度不稳定（msi-h），微卫星低度不稳定（msi-l）以及微卫星稳定（mss）。
31.本发明涉及一种基于基因组重复原件的轻量级微卫星不稳定性检测装置，结合高通量测序技术完成对人组织和外周血游离dna的重复原件的检测，通过自主研发的分析软件进行打分从而判定样本中微卫星不稳定的状态。
32.alu重复原件是一种片段长于约300bp，广泛分布在人类基因组上的短片段重复结构，其拷贝数多达百万，约占整个人类基因组的11%。有研究表明：虽然在alu重复原件的插入大幅增加了基因组多样性，但同时也改变了部分基因表达从而导致疾病的发生。因此针对基因组中短片段研究也呈现多样化，例如：有研究表明alu重复原件检测能够用于液体活检用于肿瘤的早筛早检，也可用于疾病预后的动态监控；通过研究其重复原件的甲基化状态建立疾病筛查模型等；结合alurna和aludna对基因组稳定性分析等。以上研究针对的重复原件本身进行。
33.alu重复原件的是由本体序列和一段多聚腺苷酸尾（polya）构成，本体序列相对保守，主要由一段增强子（enhancer）和左右两个单体构成；3’末端的多聚腺苷酸尾长度多变，该区域内容易发生碱基变异但多以缺失为主，因此会形成多种多样的类似微卫星不稳定的区域，基于该结构特征，针对重复原件的靠右单体结构及另一个原件的靠左单体结构设计alu尾部引物及头部引物，用于富集3’末端的polya序列。由于该重复原件的在基因组上分布广泛，仅仅采用单重pcr设计即可从微量的核酸中富集足够的信息用于评价基因组微卫星不稳定性。
34.具体发明内容如下：1.扩增引物及接头序列的设计与合成通过ncbi数据库调取alu重复原件亚型y的序列，选择该亚型下的两个重复原件，根据其结构中保守序列分别设计3’尾部引物及5’头部引物并对引物进测序接头结合位点的序列修饰，主要用于富集重复原件3’末端得多聚腺苷酸并为后续标签引物扩增过程提供对应得引物结合位点；根据illumina trusight通用接头序列设计带有双端标签的接头序列，主要用于多样本混合测序时用于区分样本信息以及用于提供测序引物结合位点，采用双端index-pcr可用于减少再测序过程中由于index hopping产生的测序错误，保证数据拆分的稳定性和可追溯性。本发明中所用到的引物序列均委托赛默飞世尔公司合成，纯化规格选择hplc。具体序列见表1。
35.表1alu重复原件扩增引物信息
36.注：表格引物中nnnnnnnn代表index pcr引物中的标签序列表2 标签引物序列
37.[0038][0039]
注：标签需要带入如seq id no.3或seq id no.4所示序列后，分别获得如seq id no.5~seq id no.196所示的引物序列。
[0040]
2.高通量测序文库构建用于高通量测序的文库是通过两步pcr扩增方式完成构建。第一步pcr扩增反应主要用于富集重复原件3’末端可变区域并为后续扩增提供引物结合位点，其扩增体系见表3。
[0041]
表3 富集扩增反应体系建立
[0042]
注：扩增循环数根据dna模板输入量确定，1ng dna，15cycles；1ng cfdna或剪切后的dna 18~20cycles；0.1ng cfdna或剪切后的dna 25cycles。
[0043]
扩增后的产物使用1.8
×
磁珠纯化后qubit检测浓度。
[0044]
enrich_pcr纯化产物需要经过index pcr将标签引添加至富集片段上，完成最终测序文库构建，扩增反应体系见表4。
[0045]
表4 index pcr扩增反应体系建立
[0046]
扩增后产物使用1.2
×
磁珠纯化后完成文库构建，后经过qubit定量混合，采用illumina nextseq 550dx平台完成测序，收集数据。
[0047]
3.数据分析测序下机数据按照样本对应的index拆分后，使用bwa软件将比对到人类基因组（hg19），按照软件既定的过滤条件对bam格式文件进行优化，去除质量评分低，覆盖度低的数据，采用本技术人自主研发的msisensor对样本的msi状态评价。
[0048]
本发明涉及一种轻量级的微卫星不稳定性的检测装置，通过对人类基因组重复原件末端特征分析，仅采用一对扩增引物完成高通量测序文库构建，大幅度缩短整个ngs检测试验和分析流程，将整体建库过程缩短至2.5小时左右，相较传统杂交捕获和多重pcr方法具有明显优势，增加了检测的灵活性和可实施性；采用最少的扩增引物对大幅降低了文库构建的成本即复杂区域设计难度，简化了整体操作流程，去除繁琐的条件变化和温度敏感性步骤使得反应更稳定，更高效；重复原件在整个人类基因组分布广，占比高，末端重复区域具有多样性，本装置可完成微量甚至痕量核酸的检测分析，直接解决复杂临床样本量少，检测损耗问题，由于可变区与插入片段长度偏低，可针对临床复杂性样本，低质量样本或存储年限长的样本进行准确检测，突破传统检测的样本依赖性，扩展该装置的应用场景，为微卫星不稳定性检测提供新的解决方案；本装置所配套的分析软件是自主研发，经过大量临床样品验证且广泛应用与高通量测序数据msi分析领域，美国fda批准的高通量检测产品msk-impact的微卫星不稳定性分析采用msisensor完成，提高检测结果的准确性和可信度；分析所需数据量小，特定分析指标简化整体分析流程，降低分析资源占用，加快分析速提高检测，提高分析效率。
[0049]
本发明提供的轻量级微卫星不稳定性检测装置及其应用中所用原料及试剂均可由市场购得。
[0050]
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：临床样本核酸制备选择混合细胞系提取的dna样本作为阳性对照样本，human genomic dna（promega）作为阴性对照样本。结直肠癌患者福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤组织和癌旁组织样本共计191对，所有临床样本均采用标准检测方法验证（nr21、bat26、nr27、bat25、nr24、mono27、penta c、penta d、amelogenin的pcr检测）其中检测为msi-h的样本共计98例，检测结果为mss（包含mss和msi-l）的样本为93例。同时采用本技术人已经通过性能验证的chosenone panel检测结果作为对照，全面评价amm-seq检测准确性。样本采用maxwell rsc ffpe plus kit（promega）完成对应样本的dna提取，具体工作程序如下：（1）蛋白酶k粉末加入500 μl无核酸酶水，充分溶解后按照储存标准备用；（2）使用灭菌的手术刀片将配对的ffpe切片样本刮至洁净的离心管中，做好标记；（3）缓慢加入180μl缓冲液，20μl新配制的蛋白酶k溶液，充分震荡混匀；（4）调整金属浴温度调整至70℃，将离心管放置在金属浴孵育2小时或过夜，结束后瞬时离心；（5）向离心管中加入裂解液400μl，充分震荡混匀，然后瞬时离心；（6）向离心管中加入包含磁珠缓冲液600μl，充分震荡混匀，静置7分钟；（7）将离心转移到磁力架上静置5分钟，待溶液澄清，磁珠吸附到磁力架一侧，弃去上清液；（8）将磁珠按照表5流程进行洗涤，去除杂质：表5
[0051]
（9）小心吸取残留的洗涤液，将离心管置于磁力架23℃
±
2℃的温度条件先干燥5~10分钟；（10）加入50 μl无核酸超纯水，震荡混匀，23℃
±
2℃的温度条件下静置5 min，磁力架上吸附3~5 min。转移上清至新的1.5 ml离心管中。
[0052]
（11）qubit测定浓度。
[0053]
实施例2：alu motif msi sequencing（amm-seq）将实施例1中完成提取并经过定量的dna样本按照高通量文库构建的方法，使用合成的扩增引物进行两次pcr扩增完成文库构建，具体操作如下：（1）将做好标记的dna样本按照qubit所测浓度稀释到1ng/μl，并按照如表6反应条件进行构建扩增反应体系并按照对应条件进行扩增：表6
[0054]
（2）将扩增产物从基因扩增仪取下，加入1.8
×
纯化磁珠，充分混匀，转移至磁力架上静置5分钟；（3）待溶液澄清，弃去上层清液，保留磁珠；（4）在离心管中加入200μl新配置的80%乙醇溶液，充分混匀后置于磁力架上；（5）待溶液澄清，弃去上层清液，保留磁珠；（6）重复步骤4和步骤5一次；（7）小心吸取残留在管底的溶液，23℃
±
2℃的温度静置晾干5分钟；（8）吸取22μl无核酸酶超纯水，将磁珠从管壁冲洗并充分混匀，23℃
±
2℃的温度洗脱2~5分钟；（9）将离心管转移至磁力架静置5分钟，待磁珠吸附成团，溶液澄清；（10）吸取20μl上层清液转移到洁净的离心管中，做好标记，保存备用；（11）将上步骤纯化后得到的扩增产物进行第二轮的index pcr，按照如表7反应条件进行扩增体系配制：表7
[0055]
（12）将扩增产物从基因扩增仪取下，加入1.2
×
纯化磁珠，充分混匀，转移至磁力架上静置5分钟；（13）待溶液澄清，弃去上层清液，保留磁珠；（14）在离心管中加入200μl新配置的80%乙醇溶液，充分混匀后置于磁力架上；（15）待溶液澄清，弃去上层清液，保留磁珠；（16）重复步骤14和步骤15一次；（17）小心吸取残留在管底的溶液，23℃
±
2℃的温度静置晾干5分钟；（18）吸取22μl无核酸酶超纯水，将磁珠从管壁冲洗并充分混匀，23℃
±
2℃的温度洗脱2~5分钟；（19）将离心管转移至磁力架静置5分钟，待磁珠吸附成团，溶液澄清；（20）吸取20μl上层清液转移到洁净的离心管中，做好标记，准备上机测序。
[0056]
（21）将不同样本的文库定量混合，采用illumina nextseq 550dx完成测序，收集数据。
[0057]
实施例3：数据分析将实施例2中完成测序收集的测序下机数据按照样本对应的index拆分后，使用bwa软件将比对到人类基因组（hg19），按照软件既定的过滤条件对bam格式文件进行优化，去除质量评分低，覆盖度低的数据，采用本技术人自主研发的msisensor对样本的msi状态评价（表8），当msi score≥20%判断为msi-h，即为阳性；当10%≤msi socore《20%，则判断为msi-l，当msi score《10%则判断为mss，参照中国食品药品检定研究院发布的微卫星不稳定性（msi）检测国家参考品的判定标准，将msi-l和mss都判定为阴性。
[0058]
msisensor是一款用于分析二代测序数据中微卫星不稳定性的软件，而chosenone panel在数据分析过程中则采用了msisensor用于计算msi。
[0059]
表8 msisensor检测结果
[0060][0061]
[0062]
通过对来自临床的191对结直肠临床样本进行分类数据统计，测序深度和数据指控指标均符合要求，文库的插入片段多集中在100bp~150bp之间，但部分样本中出现了较长的片段分布，约集中在330bp~370bp之间，极小部分样本中出现更长的插入片段，但对数据分析并无影响。通过msisensor分析评价确定结果的临床样本的微卫星不稳定状态发现，chosenone panel所检测结果与amm-seq结果具有高度一致性（见图1所示的a），采用t检验结果表明两组之间不具有显著差异（p=0.9812），通过对每个检验数据的单次评级和平均评级检验发现，二者检测结果相关系数r=0.9879（95% ci：0.9840~0.9908），具有很强的相关性（见图1所示的b）。为进一步确定amm-seq装置对临床样本的检测能力，将其分析结果与临床检验常用的荧光pcr方法进行对比，分析其阳性一致率和阴性一致率（见表9），评价该装置检测能力。
[0063]
表9 amm-seq检测准确性评价
[0064]
阳性一致率=97/（97+1）
×
100%=98.98%（95%ci:94.45%~99.97%）阴性一致率=93/（0+93）
×
100%=100% （95%ci:96.11%~100%）基于高通量测序的msi检测方法相比传统pcr的检测方法具有检测靶标区域更多，基因组上面的分布更广泛，由于碱基缺失或插入导致的基因组不稳定性评价更准确。通过对临床采集的经过验证的stageii/iii的结直肠癌患者样本验证，该装置检测敏感度可达到98.98%（95%ci：94.44%~99.95%），特异性100%（95%ci：96.03%~100%），准确性99.48%（95%ci：97.12%~99.99%）真正实现了轻量级数据分析，“更快，更稳，更准”的微卫星不稳定性检测，使更多结直肠患者能从免疫治疗中获益。
[0065]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.引物组，其特征在于，其包括：（ⅰ）、上游引物具有如seq id no.1所示的核苷酸序列；和（ⅱ）、下游引物具有如seq id no.2所示的核苷酸序列。2.标签引物组，其特征在于，其包括：（ⅰ）、indexing primer_i5具有如seq id no.3所示的核苷酸序列；和（ⅱ）、indexing primer_i7具有如seq id no.4所示的核苷酸序列；。3.如权利要求2所述的标签引物组，其特征在于，所述标签引物组包括如下任意项：（ⅰ）、indexing primer_i5具有如seq id no.101~196任意所示的核苷酸序列；和（ⅱ）、indexing primer_i7具有如seq id no.5~100任意所示的核苷酸序列。4.如下任意项在制备检测肿瘤试剂和/或试剂盒中的应用：（ⅰ）、如权利要求1所述的引物组；和/或（ⅱ）、如权利要求2或3所述的标签引物组；所述肿瘤包括但不限于结直肠癌和/或子宫内膜癌；所述检测根据msi score判断：msi score≥20%，判断为msi-h；10%≤所述msi socore<20%，判断为msi-l；所述msi score<10%，判断为mss。5.试剂和/或试剂盒，其特征在于，包括如下任意项以及可接受的助剂或载体：（ⅰ）、如权利要求1所述的引物组；和/或（ⅱ）、如权利要求2或3所述的标签引物组。6.如下任意项在制备微卫星不稳定性检测装置中的应用：（ⅰ）、如权利要求1所述的引物组；和/或（ⅱ）、如权利要求2或3所述的标签引物组；和/或（ⅲ）、如权利要求5所述的试剂和/或试剂盒；所述微卫星不稳定性检测的判断标准包括：msi score≥20%，判断为msi-h；10%≤所述msi socore<20%，判断为msi-l；所述msi score<10%，判断为mss。7.微卫星不稳定性检测装置，其特征在于，其包括如下任意项：（ⅰ）、如权利要求1所述的引物组；和/或（ⅱ）、如权利要求2或3所述的标签引物组；和/或（ⅲ）、如权利要求5所述的试剂和/或试剂盒。8.如权利要求7所述的微卫星不稳定性检测装置，其特征在于，还包括高通量测序文库、msi状态评价模块；所述高通量测序文库采用如权利要求1所述的引物组、如权利要求2或3所述的标签引物组或如权利要求5所述的试剂和/或试剂盒pcr扩增构建；所述msi状态根据msi score判断：所述msi score≥20%，判断为msi-h；10%≤所述msi socore<20%，判断为msi-l；所述msi score<10%，判断为mss。9.扩增方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1：获得临床样本核酸；步骤2：采用如权利要求1所述的引物组、如权利要求2或3所述的标签引物组或如权利要求5所述的试剂和/或试剂盒扩增。10.微卫星不稳定性检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：获得临床样本核酸；步骤2：采用如权利要求1所述的引物组、如权利要求2或3所述的标签引物组或如权利要求5所述的试剂和/或试剂盒pcr扩增，构建高通量测序文库，测序，收集数据；步骤3：对所述数据进行分析，根据msi score判断msi状态；所述msi score≥20%，判断为msi-h；10%≤所述msi socore<20%，判断为msi-l；所述msi score<10%，判断为mss。

技术总结
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及轻量级微卫星不稳定性检测装置及其应用。本发明提供了轻量级微卫星不稳定性检测装置及其应用。本发明基于基因组重复原件Alu末端特征，融合PCR扩增平台的快速及高通量测序平台的全面特征阐述一种高效，快捷的轻量级微卫星不稳定性检测装置，用于对临床样本快速精确检测，使得更多结直肠癌患者从免疫治疗中获益。更多结直肠癌患者从免疫治疗中获益。更多结直肠癌患者从免疫治疗中获益。


技术研发人员：张腾龙 王冬冬 蔡丽丽 陈慧娟 商宇红 李建基
受保护的技术使用者：北京求臻医疗器械有限公司
技术研发日：2023.06.06
技术公布日：2023/7/12