一种重组基因工程菌及其构建方法与应用与流程

1.本发明涉生物技术领域，尤其涉及一种重组基因工程菌及其构建方法与应用。


背景技术：

2.多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons,pahs)是一类持久性有机污染物，具有致癌、致畸、致突变等效应。多环芳烃的环数越高，疏水性越强，也越难降解，容易在环境中积累并可通过食物链富集，严重危害人类健康。持续暴露于多环芳烃污染环境下会严重危害人体的健康，甚至致人死亡，美国环境保护署已将16种pahs列为对人类健康构成严重威胁的优先污染物。
3.生物修复，尤其是微生物修复是多环芳烃降解的主要途径，自然环境中存在着多种多样的微生物降解菌，能够降解低分子量多环芳烃的微生物数量比较多，而能降解高分子量的多环芳烃的微生物数量较少。
4.主要协同转运蛋白超家族(major facilitator superfamily,mfs)是目前已知最大的膜转运蛋白超家族之一，普遍存在于细菌、古细菌和真核生物等各种生物细胞中。mfs功能的多样化，mfs超家族中每个家族成员能运输某类化合物，其转运底物除了单糖、多元醇，还能特异性转运药物分子、神经递质、三羧酸循环代谢物、磷酸化糖酵解中间产物、氨基酸、肽、铁载体(外排)、铁-铁载体(吸收)、核苷、有机阴离子和无机阴离子等。
5.对于细菌来讲，多环芳烃跨膜转运进入细胞内后，才能进一步和胞内相关降解酶接触，完成降解过程。然而转运至胞内的疏水性化合物会在细菌外排系统的作用下排出细胞，降低多环芳烃的生物可利用性。mfs蛋白能运输某类化合物，因此，寻找能促进多环芳烃外排的mfs蛋白，并抑制其表达，将有利于多环芳烃的降解。
6.目前对于外排多环芳烃的转运蛋白及其降解过程中产生的中间代谢物的转运蛋白相关研究较少，制约了多环芳烃的高效修复及相关降解菌的应用进程。


技术实现要素：

7.为了解决上述抑制多环芳烃外排的技术问题，本发明提供了一种重组基因工程菌及其构建方法与应用。从受石油污染的海洋沉积物中分离得到一株革兰氏阴性菌新鞘氨醇杆菌，能高效降解含2环至5环的多环芳烃，本发明的目的之一为，以此新鞘氨醇杆菌为底盘菌，通过敲除其中的mfs成员phat蛋白的编码基因获得一种重组基因工程菌，使降解多环芳烃的效果得到提升。
8.本发明另一目的为，提供一种重组基因工程菌的构建方法。本发明以novosphingobium pentaromativoransus6-1为底盘菌，通过将phat基因上、下游同源臂连接至自杀载体然后接合转移至novosphingobiumpentaromativoransus6-1细胞中，筛选phat基因缺失的菌株，即得重组基因工程菌，该重组基因工程菌对多环芳烃的降解能力得到了较大的提升。
9.本发明的具体技术方案为：
一方面，本发明提供了一种重组基因工程菌，以novosphingobiumpentaromativoransus6-1为底盘菌，敲除phat基因，所述phat基因的序列如seq id no.1所示。
10.novosphingobiumpentaromativoransus6-1为新鞘氨醇杆菌，分离自受石油污染的海洋沉积物中，属于革兰氏阴性菌，中度嗜盐，能高效降解含2环至5环的多环芳烃。本发明研究团队在对其研究中发现，novosphingobiumpentaromativoransus6-1菌株内存在一种phat蛋白，属于mfs成员，能促进多环芳烃及其中间代谢产物的外排，其编码基因phat基因的序列如seq id no.1所示。本发明通过以novosphingobiumpentaromativoransus6-1为底盘菌，敲除phat基因，获得一种重组基因工程菌，该重组基因工程菌在多环芳烃的降解具有较好的效果。
11.另一方面，本发明提供了一种上述重组基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：(1)扩增phat基因上、下游同源臂，然后连接至自杀载体，得到自杀性重组载体；(2)将(1)中得到的自杀性重组载体接合转移至novosphingobiumpentaromativoransus6-1细胞中，筛选发生2次同源重组的菌株，得到所述重组基因工程菌。
12.novosphingobiumpentaromativoransus6-1保藏于中国工业菌种保藏中心，产品编号：ccug56449t。本发明以novosphingobiumpentaromativoransus6-1为底盘菌，通过将phat基因上、下游同源臂连接至自杀载体然后接合转移至novosphingobiumpentaromativorans us6-1细胞中，发生2次同源重组，即为phat基因缺失的菌株，将之筛选出来，得到本发明所述重组基因工程菌。使用本发明提供构建方法构建得到的重组基因工程菌可以应用于多环芳烃的降解中，并使对多环芳烃的降解能力得到较大的提升。
13.具体地，步骤(1)中所述自杀载体选自自杀质粒和自杀噬菌体。
14.作为本发明上述技术方案的优选，自杀载体为pak405质粒。
15.作为本发明上述技术方案的优选，步骤(1)中，扩增phat基因上、下游同源臂上、下游同源臂长度分别为400～800bp。
16.作为本发明上述技术方案的优选，步骤(1)中所述扩增通过pcr技术扩增。
17.作为本发明上述技术方案的优选，步骤(1)中所述连接通过t4dna连接酶催化连接。
18.作为本发明上述技术方案的优选，步骤(2)中所述接合转移的方法为：将所述自杀性重组载体导入感受态细胞，然后转导入所述novosphingobiumpentaromativoransus6-1细胞中。
19.将外源dna直接导入novosphingobiumpentaromativoransus6-1细胞较为困难，因此，本发明通过先将自杀性重组载体导入感受态细胞，再以转导接合的形式将自杀性重组载体导入novosphingobiumpentaromativoransus6-1细胞，最终使得发生两次同源重组，敲除phat基因。
20.具体地，感受态细胞优选为e.coliwm3064细胞。
21.与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：(1)本发明筛选得到一株新鞘氨醇杆菌novosphingobiumpentaromativoransus6-1，并在该菌株内发现一种mfs成员蛋白—phat蛋白，敲除该phat蛋白的编码基因后，novosphingobium pentaromativoransus6-1菌株对多环芳烃的降解能力大大提升。
22.(2)本发明提供了一种简单易行的重组基因工程菌的构建方法，使用本发明提供
构建方法构建得到的重组基因工程菌可以应用于多环芳烃的降解中，为多环芳烃降解菌株的构建提供了一种切实可行的方法。
23.(3)本发明发现了一种新的mfs成员蛋白—phat蛋白，并首次将之应用于多环芳烃的降解研究中，丰富mfs转运蛋白的功能多样性，有助于完善细菌内膜蛋白对多环芳烃运输机制的内容。
附图说明
24.图1为本发明实施例1中的pak405质粒元件与限制性内切酶位点示意图；图2为本发明实施例1中的鞘氨醇单胞菌基因无痕敲除流程图；图3为hplc分析的菲浓度-峰面积标准曲线图；图4为实施例2中测定菲含量的结果图；图5为实施例3中测定对邻苯二酚2,3-双加氧酶酶活的影响结果图；图6为实施例4中激光扫描共聚焦显微镜观察菌株胞内菲及其中间代谢物含量图；图7为实施例4中激光扫描共聚焦显微镜观察结果的2.5d视角图。
具体实施方式
25.下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
26.本发明实施例所用novosphingobiumpentaromativoransus6-1为新鞘氨醇杆菌，是本发明研究团队从受石油污染的海洋沉积物中分离得到的一株革兰氏阴性菌，保藏于中国工业菌种保藏中心，产品编号：ccug56449t。
27.本发明实施例所述phat基因的序列如seq id no.1所示，该基因编码的phat蛋白的核苷酸序列如seq id no.2所示。
28.实施例1鞘氨醇单胞菌敲除phat基因获取δphat菌株(1)根据n.pentaromativoransus6-1的基因组序列，找到phat基因上下游各400～800bp左右的序列，在5’同源臂上游和3’同源臂下游分别设计引物，分别记为lf(caccggaatggtcgaacaga)和lr(gtaggtgaagtcggtctgcc)；在phat基因上游同源臂中设计上游和下游引物，分别记录为5o(cgactatgggccaacggtaa)和5i(ctggagcgcctgtatcatcg)，用于获得5’同源臂，并且在5’同源臂内设计引物sf(gacgatggggaattggctga)；在目的基因下游同源臂中设计上游和下游引物，分别记录为3i(gaccttggcccttgttctgtt)和3o(agcagacggttttcgagtgt)，用于获得3’同源臂，并且在3’同源臂内设计引物sr(gtcgccagtcccatcgtatt)。并在引物5i和3i前添加20bp的linker序列(atagctcattaaccggcacg)，在引物5o和3o前添加限制性酶切位点(5o前：ggatcc；3o前：aagctt)和保护碱基(5o前：cg；3o前：ct)。
29.引物5o/5i、3o/3i分别用来扩增上下游同源臂；引物lf/sr和sf/lr组合使用以检测单交换子，自杀质粒成功整合的菌株用lf/sr和sf/lr两对引物能够扩增出一条野生带和一条突变带，lf/lr位于同源臂外侧，sf/sr位于同源臂内侧；引物lf/lr用于筛选双交换子。
30.(2)以n.pentaromativoransus6-1基因组dna为模板，通过pcr反应克隆出上下游片段，分别命名为5o-5i和3o-3i，然后以5o-5i和3o-3i为模板利用重叠延伸pcr将上下游片段连接起来获得融合片段，命名为5o-3o。重叠延伸pcr产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检
测，回收1300bp左右的条带。
31.上下游片段的扩增体系：2
×
phantamaxmastermix25μl；5o2μl；5i2μl；基因组dna1μl；ddh2o20μl。
32.重叠延伸pcr扩增体系：2
×
phantamaxmastermix25μl；5o2μl；3o2μl；5o-5i0.5μl；3o-3i0.5μl；ddh2o20μl。
33.pcr程序：95℃3min；(95℃30sec；58℃15sec；72℃2min)
×
35cycles；72℃5min；16℃pause。
34.(3)双酶切处理融合片段5o-3o和质粒pak405并纯化，然后质粒pak405和融合片段5o-3o按分子数1:5的比例配制连接体系，将融合片段5o-3o和质粒pak40516℃连接过夜，获得重组质粒。
35.融合片段5o-3o、pak405酶切体系：bamh11μl；hindiii1μl；10
×
q.cutbuffer5μl；dna/质粒+ddh2o至20μl。37℃，金属浴2h。酶切产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测并回收目的片段。
36.连接体系：10
×
t4dnaligasebuffer2μl；t4dnaligase1μl；质粒50ng；融合片段5o-3o加ddh2o至20μl。
37.(4)将外源dna直接导入novosphingobiumpentaromativoransus6-1细胞较为困难，因此，本发明通过先将自杀性重组载体导入感受态细胞，再以转导接合的形式将自杀性重组载体导入novosphingobiumpentaromativoransus6-1细胞。
38.向50μl感受态细胞中加入20μl步骤(3)中获得重组质粒，混匀，冰浴30min；42℃热激90s，然后迅速置于冰上冷却2min；向离心管中加入1mllb液体培养基及10μldap(0.3mm)，混匀后37℃孵育1h；上述菌液6000rpm离心2min，去除900μl上清液，用剩余100μl上清重悬菌体，涂布含卡那霉素(50mg
·
ml-1
)和dap(0.3mm)的lb平板，37℃培养15h。
39.用lf-sr、sf-lr两对引物进行pcr验证，筛选得到第一次同源重组突变菌株。
40.将第一轮验证正确的菌株接种到p5y3培养基中，于30℃培养，传代6次后，吸取适量菌液用10倍稀释涂布的方式分离于p5y3平板上。待长出黄色单菌落后，挑取菌落，以引物lf和lr进行pcr验证，筛选得到第二次同源重组的phat基因缺失突变体。将测序正确的缺失phat基因的突变体命名为δphat菌株。
41.质粒pak405质粒元件与限制性内切酶位点如图1所示，鞘氨醇单胞菌phat基因无痕敲除流程图如图2所示。
42.实施例2菲降解率的测定菲是具有三环的多环芳烃，因其具有致癌作用的最小结构单元，常作为研究多环芳烃降解的模式底物。
43.将野生型n.pentaromativoransus6-1菌株和实施例1得到的δphat菌株分别在p5y3培养基中过夜培养，转接至以菲(200mg
·
l-1
)为唯一碳源和能源的基本培养基摇瓶中，30℃振荡培养8h后，将培养液摇晃均匀，取15ml培养液并加入等体积的乙酸乙酯，涡旋振荡5min，于分液漏斗中静置5min分层。收集上层有机相，再于水相中加入等体积的乙酸乙酯，重复萃取三次。收集三次萃取获得的有机相，并用无水硫酸钠去除水相，放入圆底烧瓶中，置于55℃旋转蒸发仪上旋蒸浓缩，待乙酸乙酯蒸发后，用3ml甲醇溶解圆底烧瓶底部残留的菲。用0.45μm孔径有机滤头过滤样品并移入2ml色谱柱中，利用高效液相色谱法测定菲含
量，以菲标准品为对照，根据菲标准曲线获得反应液中菲含量。
44.高效液相色谱法测定条件：选用shimnexs-c18-pah柱，流动相为乙腈：水(60:40，v:v)，流速：1.5ml
·
min-1
，进样量：5μl，柱温：25℃，检测波长为254nm。
45.绘制菲标准曲线：用丙酮溶解菲粉末，配制成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg
·
l-1梯度浓度的菲标准样品溶液，进行高效液相色谱检测，根据液相检测结果制作菲浓度-峰面积标准曲线，如图3所示。根据标准曲线计算反应液中经过菌株降解后的菲含量。
46.结果显示：菲标准品的出峰时间为13.415min，如图4所示，野生型的培养基中菲剩余量约为73％，而δphat培养基中菲剩余量约为47％，回补表达后，回补株培养基中菲剩余量约为62％。说明在n.pentaromativorans us6-1中敲除phat基因促进了菲降解。
47.实施例3邻苯二酚-2,3-双加氧酶酶活的检测由于邻苯二酚为菲降解通路中较为重要的中间代谢物，邻苯二酚下游产物为2-羟基粘康酸半醛，该物质为菲降解反应过程中产生的黄色物质，能直观地初步观察菲降解的快慢，所以通过对邻苯二酚-2,3-双加氧酶酶活的测定确定菌株对菲降解的速率。
48.待检测菌株的全细胞裂解液与邻苯二酚反应，生成2-羟基粘康酸半醛，在375nm处有最大吸收波长。具体方法如下：在4℃条件下，6000rpm离心2min收集3ml对数期的菌体，在600nm处测量吸光度(od
600
)，用pbs缓冲液洗涤后重悬菌体至1ml，用超声破碎仪裂解细胞，离心取上清备用。将混合物与邻苯二酚(0.1m)按1:1比例混合，在375nm处测量吸光度(od
375
)。邻苯二酚-2,3-双加氧酶的相对活性的计算公式如下：酶活(miller units)＝od
375
/od
600
。
49.结果显示：如图5所示，在p5y3培养基中培养wt和δphat的od
600
值为0.2和0.4时，δphat菌株的2,3-邻苯二酚双加氧酶酶活仅略高于wt，当od
600
值为0.6、0.8和1.0时，δphat菌株的2,3-邻苯二酚双加氧酶酶活比wt分别高30％、26％和37％。该结果说明phat的缺失促进了菲降解基因的表达。
50.实施例4phat基因的缺失对菲及其中间代谢物胞内含量的影响利用激光扫描共聚焦显微镜观察野生型、δphat和wt/ptac-phat菌株胞内菲及其中间代谢物转运菲的能力。将相应菌株在基本培养基中，30℃、200rpm培养12h后，收集菌体，利用激光扫描共聚焦显微镜观察菌体荧光现象，激发波长设置为405nm，发射波长检测范围设定在415nm-550nm。若菌体可以摄取和代谢菲，则菌体内部将积累一定浓度的菲及其中间代谢产物，在激发波下发射特定波长的光，一般为蓝光。
51.结果显示：如图6～7所示，与wt相比，δphat菌株荧光现象更明显，说明其胞内菲及其中间代谢物残余量增多，而过表达菌株wt/ptac-phat蓝光明显较弱。因此phat在菲降解过程中使菲及其中间代谢物更好地保留在胞内，从而加快了菲降解速率。
52.本发明实施例中所述wt代表野生型n.pentaromativoransus6-1菌株。
53.本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
54.以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。

技术特征：
1.一种重组基因工程菌，其特征在于：以novosphingobium pentaromativorans us6-1为底盘菌，敲除phat基因，所述phat基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。2.一种如权利要求1所述的重组基因工程菌的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）扩增phat基因上、下游同源臂，然后连接至自杀载体，得到自杀性重组载体；（2）将（1）中得到的自杀性重组载体接合转移至novosphingobium pentaromativorans us6-1细胞中，筛选发生2次同源重组的菌株，得到所述重组基因工程菌。3.如权利要求2所述的重组基因工程菌的构建方法，其特征在于：所述自杀载体选自自杀质粒和自杀噬菌体。4.如权利要求2或3所述的重组基因工程菌的构建方法，其特征在于：所述自杀载体为pak405质粒。5.如权利要求2所述的重组基因工程菌的构建方法，其特征在于：步骤（1）中，所述上、下游同源臂长度分别为400~800bp。6.如权利要求2所述的重组基因工程菌的构建方法，其特征在于：步骤（1）中，所述扩增通过pcr技术扩增。7.如权利要求2所述的重组基因工程菌的构建方法，其特征在于：步骤（1）中，所述连接通过t4 dna 连接酶催化连接。8.如权利要求2所述的重组基因工程菌的构建方法，其特征在于：步骤（2）中，所述接合转移的方法为：将所述自杀性重组载体导入感受态细胞，然后转导入所述novosphingobium pentaromativorans us6-1细胞中。9.如权利要求8所述的重组基因工程菌的构建方法，其特征在于：所述感受态细胞为e. coli wm3064细胞。10.如权利要求1所述的重组基因工程菌或如权利要求2~9任一项所述的构建方法构建得到的重组基因工程菌在降解多环芳烃中的应用。

技术总结
本发明涉及生物技术领域，公开了一种重组基因工程菌及其构建方法与应用。本研究团队以从受石油污染的海洋沉积物中分离得到一株革兰氏阴性菌新鞘氨醇杆菌US6-1为出发菌株，该菌株能高效降解含2环至5环的多环芳烃，本研究团队在该菌株内发现一种MFS成员蛋白—PhaT蛋白，敲除该PhaT蛋白的编码基因后，Novosphingobium pentaromativorans US6-1菌株对多环芳烃的降解能力大大提升。株对多环芳烃的降解能力大大提升。株对多环芳烃的降解能力大大提升。


技术研发人员：余志良 孟秋 曹飞飞 任慧平 於建明 陈步东 音建华 朱廷恒
受保护的技术使用者：杭州楚环科技股份有限公司
技术研发日：2023.04.07
技术公布日：2023/7/12