一种树脂辅助离心分离和回用微生物细胞的方法

1.本发明属于微生物细胞分离技术领域，更具体地说，涉及一种树脂辅助离心分离和回用微生物细胞的方法。


背景技术：

2.固液分离的方法主要包括：分子筛、悬浮分离、重力沉降以及离心和过滤。用于发酵液固液分离的主要是离心和过滤操作。对于丝状菌，如霉菌和放线菌，体形比较大，一般采用过滤的方法处理发酵液。单细胞的细菌和酵母菌，其菌体大小一般在1-10μm，高速离心的效果比较好。
3.离心就是利用离心机转子高速旋转产生的强大的离心力原理，加快液体中颗粒的沉降速度，把样品中不同沉降系数和浮力密度的物质分离开。当含有细小颗粒的悬浮液静置不动时，由于重力场的作用使得悬浮的颗粒逐渐下沉。粒子越重，下沉越快，反之密度比液体小的粒子就会上浮。微粒在重力场下移动的速度与微粒的大小、形态和密度有关，并且又与重力场的强度及液体的粘度有关，(v＝沉降速度，d＝颗粒直径，ρ
p
＝微粒密度，ρ
l
＝液体密度，g＝离心力，μ＝液体粘度)。以菌体细胞的收集或除去为目的称为一级分级分离。
4.在工业生产中，高速离心投资费用高，能耗较大，同时离心机的各部件承受很大的离心力，稳定性差。受电源频率、电机转差率等因素影响，难以实现准确的高速离心。


技术实现要素：

5.针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种树脂辅助离心分离和回用微生物细胞的方法，在提高沉降效率的同时，有效降低离心转速(即离心力)。
6.为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
7.一种树脂辅助离心分离和回用微生物细胞的方法，先在发酵液中添加树脂，然后通过离心实现沉降微生物。
8.所述的微生物细胞包括枯草芽孢杆菌、氧化葡萄酸杆菌和酿酒酵母。
9.所述的树脂选自大孔吸附树脂xad-16n，凝胶型阴离子交换树脂335，大孔型阴离子交换树脂d315，凝胶型阳离子交换树脂jk110，大孔型阳离子交换树脂hd-1。
10.所述的树脂分别经过1m naoh、1m hcl和1m naoh振荡2小时，然后用去离子水清洗，直到洗脱液为中性，保存在-4℃冰箱中备用。
11.所述的树脂的添加质量浓度为10g/100ml。
12.所述的发酵液发酵条件为：30℃，220rpm，培养至细胞浓度为5g/l。
13.所述的离心力不超过317g。
14.有益效果：相比于现有技术，本发明的技术优势为：本发明解决了在工业生产中无
法实现高速离心的细胞分离问题，可以有效提升细菌细胞的离心分离效率，并降低离心转速(即离心力)，有效降低生产成本，延长离心设备使用寿命，可以在低离心力条件下获得高细胞浓度，具有很好的工业适用性。
附图说明
15.图1是凝胶型阴离子交换树脂335辅助氧化葡萄糖酸杆菌细胞沉降结果图；
16.图2是凝胶型阴离子交换树脂335辅助枯草芽孢杆菌细胞沉降结果图；
17.图3是凝胶型阴离子交换树脂335辅助酿酒酵母细胞沉降结果图；
18.图4是不同树脂辅助氧化葡萄糖酸杆菌细胞沉降结果图；
19.图5是不同树脂辅助枯草芽孢杆菌细胞沉降结果图；
20.图6是不同比例树脂辅助沉降氧化葡萄糖酸杆菌结果图；
21.图7是不同转速树脂辅助沉降氧化葡萄糖酸杆菌结果图；
22.图8是树脂辅助沉降不同细胞浓度的氧化葡萄糖杆菌结果图；
23.图9是不同比例洗脱液洗脱离心沉降后的氧化葡萄糖酸杆菌结果图。
具体实施方式
24.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。本发明保护范围不限于实施例，本领域技术人员在权利要求限定的范围内做出任何改动也属于本发明保护的范围。以下实施例中如无特殊说明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
25.以下实施例所使用的氧化葡萄糖酸杆菌nl71同cn114854796a采用的菌株；所使用的枯草芽孢杆菌10732来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心(china center of industrial culture collection)；所使用的酿酒酵母来源于安琪酵母。
26.实施例1
27.阴离子交换树脂335辅助不同微生物细胞沉降，具体包括以下步骤:
28.1、树脂的前处理
29.阴离子交换树脂335(335弱碱性阴离子交换树脂由环氧氯丙烷与乙烯多胺反相聚合而成，功能基团为:-mh2，＝mh，≡n(华东理工大学华震公司))分别经过1m naoh、1m hcl和1m naoh振荡2小时，然后用去离子水清洗，直到洗脱液为中性，保存在-4c冰箱中备用。
30.2、发酵液的制备
31.(1)在30℃，220rpm条件下，氧化葡萄糖酸杆菌nl71在增殖培养基(100g/l山梨醇，10g/l酵母提取物)中培养至59/l。
32.(2)在30℃，220rpm条件下，枯草芽抱杆菌10732在增殖培养基(20g/l葡萄糖，20g/l酵母提取物，20g/l牛肉膏)中培养至5g/l。
33.(3)在30℃，220rpm条件下，酿酒酵母在增殖培养基(10g/l酵母提取物，20g/l蛋白腺，20g/l葡萄糖)中培养至5g/l。
34.3、树脂辅助离心分离
35.试验组:取50ml发酵液放入250ml锥形瓶，添加10％(g/ml)335树脂震荡混合均匀。
36.对照组:同试验组，不同在于发酵液中不添加加树脂。
37.对试验组和对照组进行差速离心，离心转速与离心力对照如表1所示，计算细胞沉降率，
38.表1离心转速与离心力对照表
39.转速(rpm)5001000150020002500离心力(g)35141317563880
40.结果如图1-图3所示，显示阴离子交换树脂335可以有效提升细胞沉降率。随着转速的升高，树脂的辅助作用逐渐降低，变为差速离心主导。氧化葡萄糖酸杆菌nl71和枯草芽抱杆菌10732在阴离子交换树脂335辅助条件下，转速为2000rpm时沉降率已经超过90％。2000rpm条件下氧化葡萄糖酸杆菌nl71对照组的沉降率为65.4％，添加阴离子交换树脂335的试验组沉降率为94％(大于90％)，提升了43.7％。枯草芽孢杆菌10732也呈现出相似的结果，2000rpm下对照组的沉降率为70.6％，而实验组为91.4％，提升了29.4％。酿酒酵母细胞由于自身沉降快，在工业中可以通过自身重力作用沉降。外加离心作用条件下，添加阴离子交换树脂335的试验组在500rpm沉降率为88.8％，对照组为71％，提升了25％。
41.实施例2
42.不同类型的树脂辅助发酵液(氧化葡萄糖酸杆菌nl71和枯草芽孢杆菌10732)细胞沉降的方法，同实施例1，不同在于选择不同类型的树脂取代阴离子交换树脂335进行试验，该树脂包括大孔吸附树脂xad-16n，大孔型阴离子交换树脂d315，凝胶型阳离子交换树脂jk110，大孔型阳离子交换树脂hd-1。树脂的基本特征如表2所示。所有树脂均分别经过1mnaoh、1mhcl和1mnaoh振荡2小时，然后用去离子水清洗，直到洗脱液为中性，保存在-4℃冰箱中备用。
43.表2树脂的基本特征
[0044][0045]
结果如图4和图5所示，添加不同的树脂均可以辅助细胞沉降。无论是大孔型树脂
还是凝胶型树脂对细胞的辅助沉降效果几乎没有差别。树脂所带的不同功能基团也不影响沉降效果。不同的树脂对革兰氏阴性菌氧化葡萄糖酸杆菌nl71和革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌10732均具有辅助沉降的效果。在2000rpm转速下，氧化葡萄糖酸杆菌nl71和枯草芽孢杆菌10732均可以实现超90％的细胞沉降。
[0046]
实施例3
[0047]
不同树脂添加量对辅助细胞沉降效果的影响，具体包括以下步骤：在氧化葡萄糖酸杆菌nl71浓度为5g/l的发酵液中分别添加不同比例(0％，5％，10％，20％，30％)的335阴离子交换树脂(该树脂经过1m naoh、1m hcl和1m naoh振荡2小时，然后用去离子水清洗，直到洗脱液为中性，保存在_4℃冰箱中备用)。通过不同转速的离心，比较树脂添加量对细胞沉降的影响。结果如图6所示，随着转速的增加，不同树脂添加量的细胞发酵液细胞沉降率均呈现增加趋势。在低转速条件下(0-1500rpm)，添加树脂均比不添加树脂细胞的沉降效果更好。高转速条件下，10％的树脂添加量辅助沉降效果最好，2000rpm条件下细胞沉降率超过90％。
[0048]
实施例4
[0049]
不同离心力条件下添加树脂对细胞沉降的影响，具体包括以下步骤：在氧化葡萄糖酸杆菌nl71浓度为5g/l的发酵液中添加10％的335阴离子交换树脂，比较不同转速条件下树脂辅助沉降的效果。结果如图7所示，随着转速的升高(离心力增加)细胞沉降率不断升高。添加树脂的细胞沉降率与不添加的树脂细胞沉降率的差距先增大后减小。0-1500rpm条件下树脂辅助沉降效果逐渐增强，大于1500rpm条件下细胞沉降率则由转速主导，树脂辅助沉降效果逐渐减弱。3500rpm(1726g)时未添加树脂的沉降率与添加树脂的细胞沉降率一致，超过95％。
[0050]
实施例5
[0051]
树脂辅助不同细胞浓度的氧化葡萄糖酸杆菌细胞沉降，具体包括以下步骤：分别在不同细胞浓度的氧化葡萄糖酸杆菌的发酵液中添加10％的335阴离子交换树脂，比较2000rpm转速下辅助沉降效果。结果如图8所示，在细胞浓度为2-6g/l时，树脂辅助沉降率均可以超过90％，其中细胞浓度为2-4g/l,时细胞沉降率可以超过95％。
[0052]
实施例6
[0053]
离心收集细胞后，树脂的回收具体包括以下步骤：利用不同体积的生理盐水洗脱335阴离子交换树脂和细胞的沉淀并计算洗脱比例洗脱液和原发酵液的体积比分别为1：1，1：2，1：4，1：6，1：8，1：10，在200rpm条件下震荡20分钟。结果如图9所示，洗脱液与原发酵液体积比为1：1～1：4时洗脱效果最好，洗脱超过95％的细胞，同时回收树脂。

技术特征：
1.一种树脂辅助离心分离和回用微生物细胞的方法，其特征在于，先在发酵液中添加树脂，然后通过离心实现沉降微生物。2.根据权利要求1所述的树脂辅助离心分离和回用微生物细胞的方法，其特征在于，所述的微生物细胞包括枯草芽孢杆菌、氧化葡萄酸杆菌和酿酒酵母。3.根据权利要求1所述的树脂辅助离心分离和回用微生物细胞的方法，其特征在于，所述的树脂选自大孔吸附树脂xad-16n，凝胶型阴离子交换树脂335，大孔型阴离子交换树脂d315，凝胶型阳离子交换树脂jk110，大孔型阳离子交换树脂hd-1。4.根据权利要求1所述的树脂辅助离心分离和回用微生物细胞的方法，其特征在于，所述的树脂分别经过1mnaoh、1mhcl和1mnaoh振荡2小时，然后用去离子水清洗，直到洗脱液为中性，保存在-4℃冰箱中备用。5.根据权利要求1所述的树脂辅助离心分离和回用微生物细胞的方法，其特征在于，所述的树脂的添加质量浓度为10g/100ml。6.根据权利要求1所述的树脂辅助离心分离和回用微生物细胞的方法，其特征在于，所述的发酵液发酵条件为：30℃，220rpm，培养至细胞浓度为2-6g/l。7.根据权利要求1所述的树脂辅助离心分离和回用微生物细胞的方法，其特征在于，离心力不超过317g。

技术总结
本发明公开了一种树脂辅助离心分离和回用微生物细胞的方法，属于发酵工程及生物分离技术领域。该方法利用树脂与微生物细胞膜之间的电化学、表面吸附等多重微作用力的堆积效应，形成了发酵液中微生物细胞与树脂颗粒的“假复合体”，显著提高了微生物，尤其是难分离微小尺寸细胞在离心场中的沉降分离效率和效果，可有效降低工业化发酵生产过程中细胞离心分离对离心速率(离心力)及离心设备的要求，进而降低生产成本、延长离心设备使用寿命。延长离心设备使用寿命。延长离心设备使用寿命。


技术研发人员：徐勇 吕阳
受保护的技术使用者：南京林业大学
技术研发日：2023.04.03
技术公布日：2023/7/12