一种同时测定样品中的纤维素含量和果胶含量的方法与流程

1.本发明属于检测分析领域，具体涉及一种同时测定样品中的纤维素含量和果胶含量的方法。


背景技术：

2.在烟草行业，烟草化学成分是决定烟叶质量的重要因素。纤维素含量一方面影响烟草燃烧的稳定性，另一方面与烟气中致癌物质稠环芳烃的含量相关。果胶影响烟草的保湿性，其在燃烧时会产生甲醇、甲醛、烟焦油等有害物质。因而，纤维素与果胶的含量对烟草品质及安全性有重要的意义。
3.现有技术中，对烟叶的纤维素或果胶进行定量分析时，需进行破坏性降解，其中，果胶的定量分析多以比色法或色谱法为主，其主要缺点是操作繁琐。传统的化学方法定量分析烟叶的纤维素和果胶已被证明是有效的，但费时低效的缺点使化学方法不适合大规模工业应用。
4.因此，目前亟需一种准确、快速地同时测定烟草或烟草制品中的纤维素和果胶含量的方法。


技术实现要素：

5.本发明的目的之一在于提供一种同时测定样品中的纤维素含量和果胶含量的方法，该方法能准确、快速地同时测定烟草或烟草制品中的纤维素含量和果胶含量，方法的重复性好、信噪比高、操作简单，适于工业化推广。
6.为实现上述目的，本发明提供了一种同时测定样品中的纤维素含量和果胶含量的方法，包括如下步骤：
7.(1)采用甲苯和乙醇对样品进行抽提处理，收集固相物i；
8.(2)采用高温淀粉酶对固相物i进行酶解处理，固液分离，收集固相物ii；
9.(3)采用中性蛋白酶对固相物ii进行酶解处理，固液分离，收集固相物iii；
10.(4)采用碳13多重交叉极化/魔角旋转核磁共振仪(
13
cmulticp/mas nmr)检测固相物iii，得到谱图；
11.(5)根据谱图中化学位移为105ppm和174ppm的峰分别计算样品中的纤维素含量和果胶含量。
12.本发明的任意实施方式中，步骤(4)中，碳13多重交叉极化/魔角旋转核磁共振仪的操作条件包括如下的一项或多项：
13.a.采用10个0.88ms cp的周期；
14.b.测试时间为100-110分钟，例如107分钟；
15.c.魔角旋转频率为10-15khz，例如12khz；
16.d.复极化持续时间为1s；
17.e.cp梯度以11步和1％幅度增量90％至100％；
18.f.采用布鲁克400mhz avance av iii波谱仪；
19.g.采用布鲁克4mm 1
h-13
c双共振mas探头；
20.h.弛豫延迟2s；
21.i.500-530次扫描，例如512次扫描；
22.j.纵向弛豫时间t
1,c
通过交叉极化方法测定，拟合函数为i(t)＝i(0)exp(-t/t1)，其中，i(t)表示t时刻的信号强度，i(0)表示理论的最大初始信号强度，t1表示纵向驰豫时间，t表示时间。
23.本发明的任意实施方式中，碳13多重交叉极化/魔角旋转核磁共振仪采用4mm固体核磁转子。
24.本发明的任意实施方式中，步骤(1)中，甲苯和乙醇的体积比为1:1-5:1，例如1:1、2:1、3:1、4:1、5:1。
25.本发明的任意实施方式中，步骤(2)中，酶解处理的温度为80℃-95℃(例如80℃、85℃、90℃、95℃)，酶解处理的时间为10-120分钟(例如20分钟、30分钟、50分钟、60分钟、100分钟)。
26.本发明的任意实施方式中，步骤(2)中，在回流条件下进行酶解处理。
27.本发明的任意实施方式中，步骤(3)中，酶解处理的温度为45℃-65℃(例如50℃、55℃、60℃)，酶解处理的时间为10-120分钟(例如20分钟、30分钟、50分钟、60分钟、100分钟)。
28.本发明的任意实施方式中，步骤(3)中，在回流条件下进行酶解处理。
29.本发明的任意实施方式中，步骤(5)中，在计算前，采用洛伦兹/高斯混合线型对谱图进行去卷积处理。
30.本发明的任意实施方式中，步骤(4)中，在检测前，向固相物iii中混入内标物；和，
31.步骤(5)中，根据谱图中化学位移为105ppm和0ppm的峰计算样品中的纤维素含量，根据谱图中化学位移为174ppm和0ppm的峰计算样品中的果胶含量。
32.本发明的任意实施方式中，内标物为3-(三甲基甲硅烷基)丙酸-d4钠盐。
33.本发明的任意实施方式中，步骤(4)中，固相物iii与内标物的质量比为2:1-10:1，例如3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1。
34.本发明的任意实施方式中，步骤(4)中，混入内标物后进行研磨。
35.本发明的任意实施方式中，步骤(5)中，
36.根据谱图计算化学位移为105ppm和0ppm的峰的积分面积比，代入纤维素的标准曲线中计算出固相物iii中的纤维素质量，然后按照如下的公式计算出样品中的纤维素含量；
[0037][0038]
根据谱图计算化学位移为174ppm和0ppm的峰的积分面积比，代入果胶的标准曲线中计算出固相物iii中的果胶质量，然后按照如下的公式计算出样品中的果胶含量；
[0039][0040]
其中，
[0041]acell
表示样品中的纤维素质量含量；
[0042]ccell
表示固相物iii中的纤维素质量；
[0043]apec
表示样品中的果胶质量含量；
[0044]cpec
表示固相物iii中的果胶质量；
[0045]
m表示样品的质量；
[0046]
z表示样品中的水质量含量。
[0047]
本发明的任意实施方式中，步骤(5)中，
[0048]
纤维素的标准曲线通过如下的步骤获得：
[0049]
不同质量的微晶纤维素分别与内标物混合，得到多个标样；
[0050]
将多个标样采用碳13多重交叉极化/魔角旋转核磁共振仪检测，得到谱图；
[0051]
以多个标样的谱图中化学位移为105ppm和0ppm的峰的积分面积比为纵坐标，以多个标样中的微晶纤维素质量为横坐标，得到纤维素的标准曲线；和/或，
[0052]
果胶的标准曲线通过如下的步骤获得：
[0053]
不同质量的聚半乳糖醛酸分别与内标物混合，得到多个标样；
[0054]
将多个标样采用碳13多重交叉极化/魔角旋转核磁共振仪检测，得到谱图；
[0055]
以多个标样的谱图中化学位移为174ppm和0ppm的峰的积分面积比为纵坐标，以多个标样中的聚半乳糖醛酸质量为横坐标，得到果胶的标准曲线；
[0056]
优选地，混合采用的内标物质量与步骤(4)中的内标物的混入质量相同。
[0057]
本发明的任意实施方式中，方法包括如下的一项或多项：
[0058]
1)步骤(1)中，样品质量与甲苯和乙醇总体积的比例为1:10-1:20g/ml，例如1:12g/ml、1:15g/ml、1:18g/ml；
[0059]
2)步骤(1)中，抽提处理2-10小时，例如4、6、8、9小时；
[0060]
3)步骤(1)中，抽提处理为索氏抽提处理；
[0061]
4)步骤(2)中，在酶解处理前，将固相物i干燥；
[0062]
5)步骤(2)中，每克固相物i采用0.1-1mg(例如0.3、0.5、0.7mg)高温淀粉酶；
[0063]
优选地，高温淀粉酶为购买自阿拉丁的货号为a109182的耐高温α-淀粉酶；
[0064]
6)步骤(2)中，在混合溶剂中进行酶解处理，所述混合溶剂由乙醇和hcl水溶液组成；
[0065]
优选地，乙醇和hcl水溶液的体积比为1:1-10:1，例如2:1、4:1、6:1、8:1；
[0066]
优选地，固相物i与混合溶剂的比例为1:20-1:100g/μl，例如1:30g/μl、1:50g/μl、1:70g/μl；
[0067]
优选地，hcl水溶液的浓度为0.05-1m，例如0.1m；
[0068]
7)步骤(2)和/或步骤(3)中，通过真空抽滤进行固液分离；
[0069]
8)步骤(3)中，在酶解处理前，将固相物ii洗涤，干燥；
[0070]
优选地，采用乙醇洗涤固相物ii；
[0071]
9)步骤(3)中，每克的固相物ii采用600-1400u(例如1000u)中性蛋白酶；
[0072]
优选地，中性蛋白酶为购买自阿拉丁的货号为d195752的中性蛋白酶；
[0073]
10)步骤(3)中，在中性(优选ph值为7-7.5，例,7.5)的环境中进行酶解处理；
[0074]
11)步骤(3)中，在磷酸盐缓冲溶剂中进行酶解处理；
[0075]
优选地，磷酸盐缓冲溶剂由磷酸二氢钠水溶液和磷酸氢二钠水溶液以1:3-1:8(优
选为1:5-1:6)的体积比组成；
[0076]
优选地，磷酸二氢钠水溶液和磷酸氢二钠水溶液的浓度各自独立地为0.1-0.5m，例如0.2m；
[0077]
12)步骤(4)中，在检测前，将固相物iii洗涤，干燥；
[0078]
优选地，依次采用水和乙醇洗涤固相物iii；
[0079]
13)所述纤维素含量以微晶纤维素的含量计；
[0080]
14)所述果胶含量以聚半乳糖醛酸的含量计；
[0081]
15)所述样品为烟草和/或烟草制品。
[0082]
本发明取得的有益效果：
[0083]
本发明方法将样品进行特定前处理，通过
13
c multicp/mas nmr采用特定操作条件进行检测并结合特定内标物，能准确、快速地同时测定烟草和/或烟草制品中的纤维素含量和果胶含量，并且，本发明方法的重复性好、信噪比高、操作简单，无需对纤维素和果胶成分进行破坏性降解，适合大规模工业化推广。
附图说明
[0084]
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
[0085]
图1为实施例1的微晶纤维素标准品、聚半乳糖醛酸标准品的
13
cmulticp/mas nmr谱图；
[0086]
图2-1为去卷积后的实施例1的微晶纤维素标准品的
13
cmulticp/mas nmr谱图；
[0087]
图2-2为去卷积后的实施例1的聚半乳糖醛酸标准品的
13
cmulticp/mas nmr谱图；
[0088]
图3-1为实施例1的微晶纤维素的标准曲线；
[0089]
图3-2为实施例1的聚半乳糖醛酸的标准曲线；
[0090]
图4-1为实施例1的烤烟样品对应的
13
c multicp/mas nmr谱图；
[0091]
图4-2为实施例1的白肋烟样品的
13
c multicp/mas nmr谱图；
[0092]
图4-3为实施例1的香料烟样品的
13
c multicp/mas nmr谱图；
[0093]
图4-4为实施例1的再造烟叶样品的
13
c multicp/mas nmr谱图；
[0094]
图5为实施例2中的残渣i、残渣ii、残渣iii的
13
cmulticp/mas nmr谱图。
[0095]
图6为对比例1中的烟梗样品的不同cp接触时间的
13
cmulticp/mas nmr谱图与
13
c dp/mas nmr谱图。
[0096]
图7-1为对比例2中的六甲基苯的
13
c multicp/mas nmr谱图。
[0097]
图7-2为对比例2中的甘氨酸的
13
c multicp/mas nmr谱图。
[0098]
图7-3为对比例2中的四-(三甲基硅氧基)-硅烷的
13
c multicp/mas nmr谱图。
具体实施方式
[0099]
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施
例，都属于本发明保护的范围。
[0100]
实施例1
[0101]
(1)标准曲线的绘制：
[0102]
称量5mg、20mg、30mg、40mg、50mg的微晶纤维素标准品(购于sinopharm chemical reagent co.,ltd(shanghai,china))，分别与10mg的3-(三甲基甲硅烷基)丙酸-d4钠盐(tmsp，购于rhawn公司(shanghai,china))均匀混合后装入4mm固体核磁转子中，若样品质量少则再加入氯化钠研磨。利用
13
c multicp/mas nmr获得一系列波谱图，检测条件同第(3)项。
[0103]
称量5mg、17.5mg、25mg、35mg、42.5mg的聚半乳糖醛酸标准品(购于阿拉丁公司)，分别与10mg的3-(三甲基甲硅烷基)丙酸-d4钠盐(tmsp)均匀混合后装入4mm固体核磁转子中，若样品质量少则再加入氯化钠研磨。利用
13
c multicp/mas nmr获得一系列波谱图，检测条件同第(3)项。
[0104]
图1为40mg的微晶纤维素标准品(a)和42.5mg的聚半乳糖醛酸标准品(b)对应的波谱图。
[0105]
对于微晶纤维素的系列波谱图和聚半乳糖醛酸的系列波谱图采用洛伦兹/高斯混合线型进行去卷积以实现重叠峰的分离，图1波谱图去卷积后如图2-1至2-2所示。
[0106]
以去卷积后的微晶纤维素谱图中的纤维素c-1峰(105ppm)与内部参考峰(0ppm)积分面积比值作为y，以微晶纤维素的质量作为x，建立微晶纤维素的标准曲线：y＝0.06783x-0.15735(r2＝0.9980)。如图3-1所示。
[0107]
以去卷积后的聚半乳糖醛酸谱图中的聚半乳糖醛酸c-6峰(174ppm)与内部参考峰(0ppm)积分面积比值作为y，以聚半乳糖醛酸的质量作为x，建立聚半乳糖醛酸的标准曲线：y＝0.04696x-0.02504(r2＝0.9990)，如图3-2所示。
[0108]
以信噪比3倍水平与10倍水平下计算出纤维素(以微晶纤维素计)与果胶(以聚半乳糖醛酸计)的检出限与定量下限。纤维素(以微晶纤维素计)的检出限为1.01mg/g，定量下限为3.32mg/g。果胶(以聚半乳糖醛酸计)的检出限为0.38mg/g，定量下限为1.28mg/g。
[0109]
(2)待测样品的制备：
[0110]
取8g烤烟样品，加入80ml甲苯和40ml乙醇进行索氏抽提处理6h，将剩余物干燥，得到残渣i；
[0111]
向1.0g的耐高温α-淀粉酶(货号a109182，购买自阿拉丁公司)中加入80ml乙醇和20ml的0.1mol/l hcl水溶液，混合得到100ml的耐高温α-淀粉酶溶液；
[0112]
取1g残渣i在50μl的耐高温α-淀粉酶溶液中，在90℃加热回流30min，之后真空抽滤，用乙醇洗涤滤渣，干燥后得到残渣ii；
[0113]
取1g残渣ii置于100ml的ph＝7.5磷酸盐缓冲溶液(0.2mol/l磷酸二氢钠水溶液16ml和0.2mol/l磷酸氢二钠水溶液84ml混合得到)中，加入20mg中性蛋白酶(货号d195752，50u/mg，购买自阿拉丁公司)在55℃加热回流30min，之后真空抽滤，依次用蒸馏水、乙醇洗涤滤渣，干燥后得到残渣iii。
[0114]
精确称量10mg的3-(三甲基甲硅烷基)丙酸-d4钠盐(tmsp)与50mg残渣iii混合并研磨成均匀细粉，作为待测样品，紧密地将其装在4mm固体核磁转子里，待上机测试。
[0115]
(3)检测：
[0116]
采用
13
c multicp/mas nmr检测待测样品，具体操作条件如下：
[0117]
使用布鲁克400mhz avance av iii波谱仪；使用布鲁克4mm1h-13
c双共振mas探头；魔角旋转频率为12khz；复极化持续时间为1s；采用10个0.88ms cp的周期；弛豫延迟2s；512次扫描；测试时间为107min；cp梯度以11步和1％幅度增量(90-100％)实现；纵向弛豫时间t
1,c
的测量通过交叉极化方法进行测定，拟合函数i(t)＝i(0)exp(-t/t1)，其中，i(t)为t时刻的信号强度，i(0)为理论的最大初始信号强度，t1为纵向驰豫时间，t为自变量：时间。数据处理使用的软件为mestrenova与origin。
[0118]
(4)计算：
[0119]
采用洛伦兹/高斯混合线型进行去卷积以实现重叠峰的分离，将去卷积后的谱图中的纤维素c-1峰(105ppm)与内部参考峰(0ppm)积分面积比值，代入微晶纤维素的标准曲线中计算，获得待测样品中纤维素(以微晶纤维素计)的质量，再按照公式1计算出烟草样品中的纤维素(以微晶纤维素计)含量；同理，按照公式2计算出烟草样品中的果胶(以聚半乳糖醛酸计)含量。
[0120][0121][0122]
其中，
[0123]acell
表示烟草样品中的纤维素质量含量(％)；c
cell
表示待测样品中的纤维素质量(mg)；a
pec
表示烟草样品中的果胶质量含量(％)；c
pec
表示待测样品中的果胶质量(mg)；w1表示所取残渣i在残渣i中的质量占比；w2表示所取残渣ii在残渣ii中的质量占比；w3表示所取残渣iii在残渣iii中的质量占比；z表示烟草样品的含水率(wt％)；m表示烟草样品的质量(mg)。
[0124]
按照上述方法，测定烤烟、白肋烟、香料烟和再造烟叶的纤维素(以微晶纤维素计)和果胶(以聚半乳糖醛酸计)的含量，结果如表1所示。四个烟草样品对应的谱图如图4-1至4-4所示。
[0125]
表1四个烟草样品的纤维素和果胶含量结果
[0126][0127][0128]
实施例2
[0129]
烟草样品的复杂成分通常导致较大的定量误差，有必要对烟草样品进行前处理。
[0130]
对实施例1中的烤烟样品，步骤(2)的三步前处理得到的残渣i、残渣ii、残渣iii分别采用
13
c multicp/mas nmr检测，具体操作条件同实施例1步骤(3)，得到的谱图如图5所示，其中，a为残渣i的谱图，b为残渣ii的谱图，c为残渣iii的谱图。
[0131]
由图5可知，残渣i已经过甲苯-乙醇索式抽提处理，其中的高级脂肪酸、部分单糖、萜烯类化合物、蜡和鞣质已被去除，但谱图分辨率仍较差；残渣ii是在残渣i的基础上去除了淀粉、水溶性糖、可溶性蛋白质以及多元酸，其谱图分辨率有一定的改善；残渣iii是在残渣ii的基础上去除了蛋白质，干扰物质被去除，c-1峰与c-6峰更为尖锐。可见，样品前处理在很大程度上去除了干扰。
[0132]
根据图5中残渣i、残渣ii、残渣iii的谱图，按照实施例1的步骤(1)和(4)分别计算出残渣i、残渣ii、残渣iii中的纤维素质量和果胶质量，进而计算出烟草样品中的纤维素(以微晶纤维素计)质量和果胶(以聚半乳糖醛酸计)质量，结果见表2(简称核磁分析)。
[0133]
化学分析方法：烟草样品中的纤维素含量按照文献(van soest pj.symposium on nutrition and forage and pastures:new chemical procedures for evaluating forages[j].journal of animal science,1964,23(3):838-45.)中的洗涤剂法进行测定，果胶含量根据文献(blumenkrantz n,asboe-hansen g.new method for quantitative determination of uronic acids[j].anal biochem,1973,54(2):484-9.)中的间羟基联苯比色法测定，结果见表2。
[0134]
表2烟草样品经不同前处理后的纤维素和果胶的定量结果
[0135][0136]
由表2可知，无论经历一步、两步或三步的前处理，本发明核磁分析方法与化学分析方法测定纤维素含量的相对误差在1.92～2.31％之间，说明本发明方法测定纤维素的准确度良好；经历过三步前处理后，本发明核磁分析方法与化学分析方法测定果胶含量的相对误差仅1.18％，说明经三步前处理去除干扰物后，本发明方法测定果胶的准确度得到显著提高。
[0137]
实施例3
[0138]
以烟梗样品为例，分别加入一定质量的微晶纤维素、一定质量的聚半乳糖醛酸，得到加标样品。
[0139]
按照实施例1的方法测定烟梗样品和加标样品中的纤维素(以微晶纤维素计)质量和果胶(以聚半乳糖醛酸计)质量，加标样品平行测定三次并计算加标回收率，结果见表3-4。
[0140]
表3烟梗样品的纤维素加标回收结果
[0141][0142][0143]
表4烟梗样品的果胶加标回收结果
[0144][0145]
由表3-4可知：本发明方法测定样品中纤维素的平均加标回收率为98.69％，rsd(n＝3)为7.36％；本发明方法测定样品中果胶的平均加标回收率为100.8％，rsd(n＝3)为6.93％；说明本发明方法测定样品中的纤维素和果胶含量的准确度高、重复性好。
[0146]
实施例4
[0147]
化学分析方法：烟草样品中的纤维素含量按照文献(van soest pj.symposium on nutrition and forage and pastures:new chemical procedures for evaluating forages[j].journal of animal science,1964,23(3):838-45.)中的洗涤剂法进行测定，果胶含量根据文献(blumenkrantz n,asboe-hansen g.new method for quantitative determination of uronic acids[j].anal biochem,1973,54(2):484-9.)中的间羟基联苯比色法测定。
[0148]
采用化学分析方法测定实施例1中四个烟草样品的纤维素含量和果胶含量，与实施例1方法的结果进行对比，结果见表5。
[0149]
表5实施例1方法与化学分析方法测定四个烟草样品的纤维素和果胶含量的结果比较
[0150]
[0151][0152]
由表5可知，本发明方法与化学分析方法测定纤维素含量的相对误差在0.71％～4.74％之间，测定果胶果胶含量的相对误差在6.58％～8.50％之间，相对误差均小于10％，说明本发明方法测定结果的准确度高。
[0153]
对比例1
[0154]
将实施例3烟梗样品的
13
c multicp/mas nmr操作条件中的10个0.88ms cp周期中的cp接触时间分别调整为0.055ms cp、5.5ms cp，其余与实施例3中相同；结合
13
c dp/mas nmr谱图，比较纤维素c-1峰(105ppm)及果胶c-6峰(174ppm)处multicp/mas与dp/mas谱的差异，如图6所示；表6为根据谱图计算出的信噪比及准确度。
[0155]
由图6可知，在c-1峰(105ppm)处，multicp/mas谱与dp/mas谱基本重合。在c-6峰(174ppm)处(见放大图)，0.055ms cp和5.5ms cp的接触时间下峰强度较弱，与dp/mas谱存在较大差异，0.88ms cp接触时间下的峰强度与dp/mas谱的差异明显缩小。
[0156]
由表6可知，multicp/mas谱的c-6峰(174ppm)的信噪比均高于dp/mas谱的c-6峰(174ppm)的信噪比；并且，0.88ms cp接触时间下的multicp/mas定量准确度更加接近于dp/mas。
[0157]
表6烟梗样品的multicp/mas谱与dp/mas谱的的c-6峰(174ppm)的信噪比和准确度结果比较
[0158][0159]
对比例2
[0160]
考察采用六甲基苯、甘氨酸、四-(三甲基硅氧基)-硅烷作为内标物的可行性。
[0161]
将六甲基苯、甘氨酸、四-(三甲基硅氧基)-硅烷利用
13
cmulticp/mas nmr获得谱图，操作条件同实施例1的第(3)项，谱图如图7-1至7-3所示。
[0162]
如图7-1所示，六甲基苯的出峰在131.74ppm与16.80ppm，然而，六甲基苯的毒性较大，容易污染环境、损害人体健康。
[0163]
如图7-2所示，甘氨酸的出峰在176.03ppm与43.41ppm，176.03ppm峰与果胶峰可能发生重叠，并且43.41ppm的峰也存在一定干扰。
[0164]
如图7-3所示，四-(三甲基硅氧基)-硅烷虽然出峰在0ppm左右，但四-(三甲基硅氧
基)-硅烷在常温下为液体，难以填装，有微弱毒性，不利于作为内标物使用。
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显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

技术特征：
1.一种同时测定样品中的纤维素含量和果胶含量的方法，包括如下步骤：(1)采用甲苯和乙醇对样品进行抽提处理，收集固相物i；(2)采用高温淀粉酶对固相物i进行酶解处理，固液分离，收集固相物ii；(3)采用中性蛋白酶对固相物ii进行酶解处理，固液分离，收集固相物iii；(4)采用碳13多重交叉极化/魔角旋转核磁共振仪检测固相物iii，得到谱图；(5)根据谱图中化学位移为105ppm和174ppm的峰分别计算样品中的纤维素含量和果胶含量。2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(4)中，碳13多重交叉极化/魔角旋转核磁共振仪的操作条件包括如下的一项或多项：a.采用10个0.88ms cp的周期；b.测试时间为100-110分钟；c.魔角旋转频率为10-15khz；d.复极化持续时间为1s；e.cp梯度以11步和1％幅度增量90％至100％；f.采用布鲁克400mhz avance aviii波谱仪；g.采用布鲁克4mm 1
h-13
c双共振mas探头；h.弛豫延迟2s；i.500-530次扫描；j.纵向弛豫时间t
1,c
通过交叉极化方法测定，拟合函数为i(t)＝i(0)exp(-t/t1)。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，步骤(1)中，甲苯和乙醇的体积比为1:1-5:1。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，步骤(2)中，酶解处理的温度为80℃-95℃，酶解处理的时间为10-120分钟；优选地，在回流条件下进行酶解处理。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，步骤(3)中，酶解处理的温度为45℃-65℃，酶解处理的时间为10-120分钟；优选地，在回流条件下进行酶解处理。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，步骤(5)中，在计算前，采用洛伦兹/高斯混合线型对谱图进行去卷积处理。7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，步骤(4)中，在检测前，向固相物iii中混入内标物；和，步骤(5)中，根据谱图中化学位移为105ppm和0ppm的峰计算样品中的纤维素含量，根据谱图中化学位移为174ppm和0ppm的峰计算样品中的果胶含量；优选地，内标物为3-(三甲基甲硅烷基)丙酸-d4钠盐；优选地，固相物iii与内标物的质量比为2:1-10:1。8.根据权利要求7所述的方法，其中，步骤(5)中，根据谱图计算化学位移为105ppm和0ppm的峰的积分面积比，代入纤维素的标准曲线中计算出固相物iii中的纤维素质量，然后按照如下的公式计算出样品中的纤维素含量；
根据谱图计算化学位移为174ppm和0ppm的峰的积分面积比，代入果胶的标准曲线中计算出固相物iii中的果胶质量，然后按照如下的公式计算出样品中的果胶含量；其中，a
cell
表示样品中的纤维素质量含量；c
cell
表示固相物iii中的纤维素质量；a
pec
表示样品中的果胶质量含量；c
pec
表示固相物iii中的果胶质量；m表示样品的质量；z表示样品中的水质量含量。9.根据权利要求8所述的方法，其中，步骤(5)中，纤维素的标准曲线通过如下的步骤获得：不同质量的微晶纤维素分别与内标物混合，得到多个标样；将多个标样采用碳13多重交叉极化/魔角旋转核磁共振仪检测，得到谱图；以多个标样的谱图中化学位移为105ppm和0ppm的峰的积分面积比为纵坐标，以多个标样中的微晶纤维素质量为横坐标，得到纤维素的标准曲线；和/或，果胶的标准曲线通过如下的步骤获得：不同质量的聚半乳糖醛酸分别与内标物混合，得到多个标样；将多个标样采用碳13多重交叉极化/魔角旋转核磁共振仪检测，得到谱图；以多个标样的谱图中化学位移为174ppm和0ppm的峰的积分面积比为纵坐标，以多个标样中的聚半乳糖醛酸质量为横坐标，得到果胶的标准曲线。10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其特征在于如下的一项或多项：1)步骤(1)中，样品质量与甲苯和乙醇总体积的比例为1:10-1:20g/ml；2)步骤(1)中，抽提处理2-10小时；3)步骤(1)中，抽提处理为索氏抽提处理；4)步骤(2)中，在酶解处理前，将固相物i干燥；5)步骤(2)中，每克固相物i采用0.1-1mg高温淀粉酶；6)步骤(2)中，在混合溶剂中进行酶解处理，所述混合溶剂由乙醇和hcl水溶液组成；优选地，乙醇和hcl水溶液的体积比为1:1-10:1；优选地，固相物i与混合溶剂的比例为1:20-1:100g/μl；7)步骤(2)和/或步骤(3)中，通过真空抽滤进行固液分离；8)步骤(3)中，在酶解处理前，将固相物ii洗涤，干燥；9)步骤(3)中，每克的固相物ii采用600-1400u中性蛋白酶；10)步骤(3)中，在中性的环境中进行酶解处理；11)步骤(3)中，在磷酸盐缓冲溶剂中进行酶解处理；优选地，磷酸盐缓冲溶剂由磷酸二氢钠水溶液和磷酸氢二钠水溶液以1:3-1:8的体积比组成；优选地，磷酸二氢钠水溶液和磷酸氢二钠水溶液的浓度各自独立地为0.1-0.5m；
12)步骤(4)中，在检测前，将固相物iii洗涤，干燥；13)所述纤维素含量以微晶纤维素的含量计；14)所述果胶含量以聚半乳糖醛酸的含量计；15)所述样品为烟草和/或烟草制品。

技术总结
本发明属于检测分析领域，具体涉及一种同时测定样品中的纤维素含量和果胶含量的方法，包括：(1)采用甲苯和乙醇对样品进行抽提处理，收集固相物I；(2)采用高温淀粉酶对固相物I进行酶解处理，固液分离，收集固相物II；(3)采用中性蛋白酶对固相物II进行酶解处理，固液分离，收集固相物III；(4)采用碳13多重交叉极化/魔角旋转核磁共振仪检测固相物III，得到谱图；(5)根据谱图中化学位移为105ppm和174ppm的峰分别计算样品中的纤维素含量和果胶含量。本发明方法能准确、快速地同时测定样品中的纤维素和果胶含量，重复性好，信噪比高，操作简单，适合工业化推广。合工业化推广。合工业化推广。


技术研发人员：刘泽春 黄延俊 谢卫 杨俊 杨明宇 张建平 蓝洪桥 刘江生 龚科 王雨松
受保护的技术使用者：福建中烟工业有限责任公司
技术研发日：2023.04.21
技术公布日：2023/7/12