一种鸡传染性支气管炎细菌样颗粒疫苗的制备方法和应用

1.本发明涉及疫苗制备技术领域，尤其涉及一种鸡传染性支气管炎细菌样颗粒疫苗的制备方法和应用。


背景技术：

2.鸡传染性支气管炎(infectious bronchitis，ib)是由冠状病毒科、γ-冠状病毒属的传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus，ibv)感染鸡引起的一种急性、高度接触性传染病。感染鸡最初呈现呼吸型病理反应，临床表现为气喘、咳嗽、气管啰音等“支气管堵塞”症状，故被称为“传染性支气管炎”。然而由于不同毒株对组织器官的亲嗜性有所差别，部分毒株会经呼吸道感染后扩散至输卵管、肾脏、肠道等部位，继而由呼吸道型衍生出生殖道型、肾型和肠型，导致鸡出现产蛋量下降、“花斑肾”及腹泻。ibv对所有品种、日龄的鸡均有易感性，尤以4周龄以内的雏鸡最为易感，感染ibv的鸡又容易遭受支原体、细菌等继发感染而导致高死亡率。该病于1931年在美国首次报道，目前全球50个国家和地区均有ib发生和流行的报道。由于ib对全球经济的影响而被认为是影响家禽养殖业的第二大破坏性疾病。
3.ibv是首个被发现的冠状病毒，其基因组大小约为27.6kb，编码四种主要结构蛋白，即刺突蛋白(s)、膜蛋白(m)、包膜蛋白(e)、核衣壳蛋白(n)，以及几种辅助蛋白作为ibv最大的结构蛋白，s蛋白位于病毒粒子的表面，是ibv最主要的免疫保护性抗原，可诱导机体产生特异性的中和抗体。s蛋白由s1和s2两个亚单位组成。s1亚单位位于n末端，在细胞附着、组织嗜性、毒力、诱导保护性免疫以及基因型/血清型特异性中起主要作用。s2亚单位位于c末端，其序列高度保守且含有少量的中和表位。
4.1956年，jungherr首次证明ibv存在多种血清型。因为基因组的突变、缺失、插入及毒株间的同源重组，ibv出现了众多的基因型和血清型。基于s1基因全长序列的进化树分析，ibv可分为7个基因型，包括gi～gⅶ。但是，不同基因型、血清型毒株之间的交叉保护性较差，这为ib的防控带来了巨大挑战；各个国家使用ib疫苗株的基因型各不相同。目前中国主要通过接种gi基因型h120减毒活疫苗株和m41株灭活苗防控ib；但是，近几年与活疫苗株发生基因重组的ibv变异株在家禽中的存在与流行及其所带来的危害值得我们重视与思考。
5.细菌样颗粒(bacterium-like particle，blp)是一种新型乳酸菌表面展示系统，源自被美国食品药品监督管理局评定为公认安全的食品级微生物—乳酸乳球菌。该系统包括革兰氏阳性菌细胞壁肽聚糖骨架(gram-positive enhancer matrix，gem)和锚钩蛋白(protein anchor，pa)两部分，分别构成了表面展示系统的载体和运载蛋白。gem制备过程简便，仅需对乳酸菌进行简单的热酸处理，去除其蛋白质、核酸等物质而留下细胞壁肽聚糖骨架，所获得的空心颗粒即为gem。由于去除了乳酸菌的脂磷壁酸等阻碍外源蛋白结合的物质，使gem的负载能力远超越母本活菌；处理后的gem形态仍与活菌相似，大小约为1μm，在保证生物安全的基础上能够更好地被上呼吸道m细胞和肠系膜淋巴系统peyer’s结等捕获，从
而有效诱导抗原特异性辅助性t淋巴细胞、细胞毒性t淋巴细胞反应以及b细胞分泌iga，进而启动局部黏膜和全身系统性免疫应答；此外，gem还具有免疫刺激特性，作为其主要成分的肽聚糖通过tlr2介导的信号传递可以有效激活先天免疫应答；为了将异种抗原附着在gem表面，可以将其与pa蛋白进行融合表达，进而融合蛋白能以非共价方式紧密结合在gem表面，一个gem表面大约能结合106个pa分子。
6.blp的发展为研制生物安全疫苗的展示系统提供了一种新的方向。多项研究表明，blp在多价疫苗、黏膜疫苗的开发中展现出了巨大潜力，其提供的自我佐剂平台已被应用于开发针对不同病原体的疫苗，包括肺炎链球菌、寨卡病毒和中东呼吸综合征病毒等。此外，blp高度稳定，可以在室温下储存，无需冷链运输，这极大地节约了疫苗的使用成本。锚钩蛋白pa作为该系统的运载蛋白，其锚定活性直接影响外源蛋白的结合效率。国内外多采用乳酸菌或大肠杆菌表达系统来表达用于构建blp疫苗的外源蛋白；然而，外源基因在乳酸菌的转化与表达困难，而且蛋白表达量较低；虽然大肠杆菌表达系统产量高，但ibv的s1蛋白存在糖基化修饰，需要真核表达系统才能完成翻译后修饰。


技术实现要素：

7.本发明的目的是通过利用昆虫细胞-杆状病毒系统表达了gi基因型ibv的s1蛋白，并立足于gem-pa表面展示技术构建了表面展示s1蛋白的blp，提供一种新型有效的鸡传染性支气管炎细菌样颗粒疫苗，已解决现有技术中活疫苗株与病毒发生基因重组的问题。
8.为实现上述目的，本发明首先提供了一种鸡传染性支气管炎细菌样颗粒疫苗的制备方法，包括以下步骤：
9.步骤一：杆状病毒重组杆粒的构建
10.基因合成的ibv毒株h120表面刺突蛋白s1基因序列(genbank登录号：on350836.1)，并设计s1基因的特异性引物；
11.s1-f：5
′‑
cggatccatgttggggaagtc-3
′
12.根据锚钩蛋白pa，即乳酸乳球菌mg1363(genbank登录号：am40667.1)的acma序列设计引物s1-r-pa-f和pa-r，其中，s1-r-pa-f序列的5
′
端包含s1基因的下游序列；
13.s1-r-pa-f：5
′‑
aacaagttgttcttatgttaggagcttcttcagctggaaa-3
′
和
14.pa-r：5
′‑
ccgctcgagttattttattcgtag-3
′
15.以基因合成的s1基因为模板，利用引物s1-f和s1-r-pa-f扩增含有pa基因5
′
端序列的s1基因，以s1-r-pa-f和pa-r扩增含有s1基因3
′
端序列的pa基因；利用s1-f和pa-r通过重叠pcr扩增3
′
端带有pa基因的s1基因后，将其克隆至杆状病毒表达载体pfastbac1(thermo fisher scientific，usa)；将连接产物转化至e.coli dh5α中，提取重组表达质粒并进行双酶切鉴定；将重组表达质粒转化至e.coli dh10bac(invitrogen，usa)，通过蓝白斑筛选获得重组杆粒；
16.步骤二：重组杆状病毒的构建
17.sf9(spodoptera frugiperda)昆虫细胞(atcc，crl-1711)在含有5％胎牛血清(gibco，usa)的sf900iii昆虫细胞培养基中于27℃培养，取重组杆粒置于100μl sf900iii昆虫细胞培养基，加入转染试剂cellfectin
tm ii(invitrogen，usa)，充分混匀后室温孵育，然后滴加至含有sf9昆虫细胞的细胞培养皿中，27℃条件下培养后，获取第一代重组杆状病
毒，连续传代至第四代；取第四代重组杆状病毒感染后的细胞上清进行western blot鉴定：一抗用h120疫苗免疫后获得的鸡血清，4℃孵育过夜后加入hrp(辣根过氧化物酶)标记的羊抗鸡酶标二抗，期间以pbst清洗3-6次，室温孵育1h-2h后通过ecl显色观察；
18.步骤三：gem的制备
19.将乳酸乳球菌mg1363株(mobitec molecular biotechnology，germany)在m17培养基中30℃培养过夜后，用m17培养基将菌液稀释，30℃，180rpm培养至菌液od值至0.4～0.6之间，此时收获菌液，7000rpm室温离心，弃上清后用10mm pbs重悬沉淀，相同条件再次离心；用10％三氯乙酸(sigma-aldrich，上海，中国)重悬菌体，煮沸30min后7000rpm室温离心10-15min以去除酸液，再用pbs洗涤5次后进行细菌计数；以2.5
×
109为1u，将样品真空干燥、喷金镀膜后置于透射电子显微镜(transmission electron microscope，tem)下观察；
20.步骤四：表面展示s1蛋白blp的制备
21.将第四代重组杆状病毒接种到悬浮培养的sf9昆虫细胞中，27℃，180rpm培养4-5天后收取悬浮细胞，4℃，4000rpm条件下离心；将pbs重悬后的细胞沉淀进行超声破碎，4℃，12000rpm条件下离心，上清即为s1蛋白；利用bca蛋白定量试剂盒(sigma-aldrich，上海，中国)对s1蛋白进行定量；取1u的gem离心后分别与不同浓度的s1蛋白重悬，室温120rpm孵育后，4℃，2000rpm离心10-20min；将收集的沉淀经pbs洗涤后，进行sds-page鉴定和透射电子显微镜观察，经鉴定，1u的gem最多可以结合130μg的s1蛋白，将结合了130μg s1蛋白的gem命名为blp-s1。
22.进一步的，所述步骤二中重组杆粒取用剂量为：1-5μg；所述转染试剂cellfectin
tm ii加入剂量为：5-10μl。
23.进一步的，所述步骤二中充分混匀后室温孵育时间为30-60min；所述27℃条件下培养时间为72-96h。
24.进一步的，所述步骤二中一抗所用h120疫苗免疫鸡血清抗体稀释倍数为1∶500-1∶1000；所述羊抗鸡酶标二抗抗体稀释倍数为1∶1000-1∶5000。
25.进一步的，所述步骤三中m17培养基将菌液稀释至300-500倍；所述收获菌液后，7000rpm室温条件下离心时间为10-15min。
26.进一步的，所述步骤三中收取悬浮细胞后，4℃，4000rpm条件下离心时间为20-30min；所述超声破碎厚，4℃，12000rpm条件下离心时间为10-20min；
27.另外，本发明还提供一种鸡传染性支气管炎细菌样颗粒在制备治疗鸡传染性支气管炎疫苗中的应用。
28.本发明的有益效果
29.本发明公开了一种鸡传染性支气管炎细菌样颗粒疫苗的制备方法和应用，与现有技术相比，具有以下有益效果：
30.首先，本技术利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统，通过tem和western blot鉴定，构建了表面展示s1的blp(如图4所示)；并用14日龄商品蛋鸡评价了该blp的免疫保护效果，结果表明，blp-s1能够有效诱导体液和黏膜免疫应答(如图5所示)。用相同基因型的异种病毒m41毒株进行攻毒后第7～14天，blp-s1组与h120组鸡血清中ibv特异性igg抗体水平无显著差异(p》0.05)(如图6a所示)，另外，blp-s1组可以有效降低鸡只的排毒(如表1所示)和脏器载毒(如图7所示)；截至攻毒后第14天，从blp-s1组采集的鸡只拭子和脏器均未检出病毒的
存在(如表1、图7所示)，鸡只存活率为100％(如图8所示)；这显示出本技术构建的blp疫苗具有良好的免疫原性和免疫保护性，具备良好的疫苗开发潜能。
31.其次，blp疫苗高度稳定，可以在室温下储存，无需冷链运输，这极大地节约了疫苗的使用成本，另外，该疫苗饲喂宿主方式简单，免疫成本低，安全性好，无副作用，无反毒危险具有佐剂效果。
32.最后，本技术所提供的blp疫苗通过乳酸乳球菌mg1363株的表达系统来表达用于构建blp疫苗的外源蛋白，能够避免现有技术中活疫苗株与病毒发生基因重组的问题。
附图说明
33.图1为本发明提供的杆状病毒重组表达质粒与重组杆粒的鉴定图，其中，a：s1基因的重叠pcr产物；b：pfastbac1-s1的双酶切鉴定；c：rbacmid-s1的pcr鉴定；m1、m2：dl5000 marker；1：s1基因；2：pfastbac1-s1；3：rbacmid-s1
34.图2为本发明提供的重组杆状病毒致细胞病变效应与s1蛋白的western blot鉴定图，其中，m：蛋白marker；1：s1蛋白
35.图3为本发明提供的blp与s1蛋白的结合能力与blp-s1鉴定图，其中，图3f中m：蛋白marker；1：gem；2：blp-s1；
36.图4为本发明提供的鸡只免疫攻毒程序示意图；
37.图5为本发明提供的blp-s1免疫后抗体的elisa检测结果柱形图，其中，a：血清中ibv特异性igg抗体水平图；b：气管灌洗液中siga抗体水平图；
38.图6为本发明提供的blp-s1免疫攻毒后抗体的elisa检测结果展示图，其中，a：血清中ibv特异性igg抗体水平图；b：气管灌洗液中siga抗体水平图；
39.图7为本发明提供的blp-s1免疫攻毒后肺脏和肾脏中的病毒滴度检测结果展示图；
40.图8为本发明提供的blp-s1免疫攻毒后鸡只的生存曲线展示图。
具体实施方式
41.下面结合实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验步骤，通常按照常规条件。
42.实施例1
43.一种鸡传染性支气管炎细菌样颗粒疫苗的制备方法，包括以下步骤：
44.步骤一：杆状病毒重组杆粒的构建
45.基因合成的ibv毒株h120表面刺突蛋白s1基因序列，并设计s1基因的特异性引物；
46.s1-f：5
′‑
cggatccatgttggggaagtc-3
′
47.根据锚钩蛋白pa，即乳酸乳球菌mg1363的acma序列设计引物s1-r-pa-f和pa-r，其中，s1-r-pa-f序列的5
′
端包含s1基因的下游序列；
48.s1-r-pa-f：5
′‑
aacaagttgttcttatgttaggagcttcttcagctggaaa-3
′
和
49.pa-r：5
′‑
ccgctcgagttattttattcgtag-3
′
50.以基因合成的s1基因为模板，利用引物s1-f和s1-r-pa-f扩增含有pa基因5
′
端序列的s1基因，以s1-r-pa-f和pa-r扩增含有s1基因3
′
端序列的pa基因；利用s1-f和pa-r通过
重叠pcr扩增3
′
端带有pa基因的s1基因后，将其克隆至杆状病毒表达载体pfastbac1；将连接产物转化至e.coli dh5α中，提取重组表达质粒并进行双酶切鉴定；将重组表达质粒转化至e.coli dh10bac，通过蓝白斑筛选获得重组杆粒；
51.步骤二：重组杆状病毒的构建
52.sf9昆虫细胞在含有5％胎牛血清的sf900iii昆虫细胞培养基中于27℃培养，取3μg重组杆粒置于100μl sf900iii昆虫细胞培养基，加入5μl转染试剂cellfectin
tm ii，充分混匀后室温孵育45min，然后滴加至含有85％sf9昆虫细胞的细胞培养皿中，27℃培养84h后，获取第一代重组杆状病毒，连续传代至第四代；取第四代重组杆状病毒感染后的细胞上清进行western blot鉴定：一抗用h120疫苗免疫后获得的鸡血清(稀释倍数为1:800)，4℃孵育过夜后加入hrp标记的羊抗鸡酶标二抗(稀释倍数为1:3000)，期间以pbst清洗4次，室温孵育1.5h后通过ecl显色观察；
53.步骤三：gem的制备
54.将乳酸乳球菌mg1363株在m17培养基中30℃培养过夜后，用m17培养基将菌液稀释400倍，30℃，180rpm培养至菌液od值至0.4～0.6之间，此时收获菌液，7000rpm室温离心12min，弃上清后用10mm pbs重悬沉淀，相同条件再次离心；用10％三氯乙酸重悬菌体，煮沸30min后7000rpm室温离心10min以去除酸液，再用pbs洗涤5次后进行细菌计数；以2.5
×
109为1u，将样品真空干燥、喷金镀膜后置于透射电子显微镜下观察；
55.步骤四：表面展示s1蛋白blp的制备
56.将第四代重组杆状病毒接种到悬浮培养的sf9昆虫细胞中，27℃，180rpm培养4天后收取悬浮细胞，4℃，4000rpm离心30min；将pbs重悬后的细胞沉淀进行超声破碎，4℃，12000rpm离心15min，上清即为s1蛋白；利用bca蛋白定量试剂盒对s1蛋白进行定量；取1u的gem离心后分别与不同浓度的s1蛋白重悬，室温120rpm孵育3h后，4℃，2000rpm离心15min；将收集的沉淀经pbs洗涤后，进行sds-page鉴定和透射电子显微镜观察，经鉴定，1u的gem最多可以结合130μg的s1蛋白，将结合了130μg s1蛋白的gem命名为blp-s1。
57.实施例2
58.一种鸡传染性支气管炎细菌样颗粒疫苗的制备方法，包括以下步骤：
59.步骤一：杆状病毒重组杆粒的构建
60.基因合成的ibv毒株h120表面刺突蛋白s1基因序列，并设计s1基因的特异性引物；
61.s1-f：5
′‑
cggatccatgttggggaagtc-3
′
62.根据锚钩蛋白pa，即乳酸乳球菌mg1363的acma序列设计引物s1-r-pa-f和pa-r，其中，s1-r-pa-f序列的5
′
端包含s1基因的下游序列；
63.s1-r-pa-f：5
′‑
aacaagttgttcttatgttaggagcttcttcagctggaaa-3
′
和
64.pa-r：5
′‑
ccgctcgagttattttattcgtag-3
′
65.以基因合成的s1基因为模板，利用引物s1-f和s1-r-pa-f扩增含有pa基因5
′
端序列的s1基因，以s1-r-pa-f和pa-r扩增含有s1基因3
′
端序列的pa基因；利用s1-f和pa-r通过重叠pcr扩增3
′
端带有pa基因的s1基因后，将其克隆至杆状病毒表达载体pfastbac1；将连接产物转化至e.coli dh5α中，提取重组表达质粒并进行双酶切鉴定；将重组表达质粒转化至e.coli dh10bac，通过蓝白斑筛选获得重组杆粒；
66.步骤二：重组杆状病毒的构建
67.sf9昆虫细胞在含有5％胎牛血清的sf900iii昆虫细胞培养基中于27℃培养，取5μg重组杆粒置于100μl sf900iii昆虫细胞培养基，加入10μl转染试剂cellfectin
tm
ii，充分混匀后室温孵育60min，然后滴加至含有90％sf9昆虫细胞的细胞培养皿中，27℃培养72h后，获取第一代重组杆状病毒，连续传代至第四代；取第四代重组杆状病毒感染后的细胞上清进行western blot鉴定：一抗用h120疫苗免疫后获得的鸡血清(稀释倍数为1:500)，4℃孵育过夜后加入hrp标记的羊抗鸡酶标二抗(稀释倍数为1:1000)，期间以pbst清洗6次，室温孵育2h后通过ecl显色观察；
68.步骤三：gem的制备
69.将乳酸乳球菌mg1363株在m17培养基中30℃培养过夜后，用m17培养基将菌液稀释300倍，30℃，180rpm培养至菌液od值至0.4～0.6之间，此时收获菌液，7000rpm室温离心15min，弃上清后用10mm pbs重悬沉淀，相同条件再次离心；用10％三氯乙酸重悬菌体，煮沸30min后7000rpm室温离心15min以去除酸液，再用pbs洗涤5次后进行细菌计数；以2.5
×
109为1u，将样品真空干燥、喷金镀膜后置于透射电子显微镜下观察；
70.步骤四：表面展示s1蛋白blp的制备
71.将第四代重组杆状病毒接种到悬浮培养的sf9昆虫细胞中，27℃，180rpm培养4.5天后收取悬浮细胞，4℃，4000rpm离心20min；将pbs重悬后的细胞沉淀进行超声破碎，4℃，12000rpm离心20min，上清即为s1蛋白；利用bca蛋白定量试剂盒对s1蛋白进行定量；取1u的gem离心后分别与不同浓度的s1蛋白重悬，室温120rpm孵育4h后，4℃2000rpm离心15min；将收集的沉淀经pbs洗涤后，进行sds-page鉴定和透射电子显微镜观察，经鉴定，1u的gem最多可以结合130μg的s1蛋白，将结合了130μg s1蛋白的gem命名为blp-s1。
72.实施例3
73.一种鸡传染性支气管炎细菌样颗粒疫苗的制备方法，包括以下步骤：
74.步骤一：杆状病毒重组杆粒的构建
75.基因合成的ibv毒株h120表面刺突蛋白s1基因序列，并设计s1基因的特异性引物；
76.s1-f：5
′‑
cggatccatgttggggaagtc-3
′
77.根据锚钩蛋白pa，即乳酸乳球菌mg1363的acma序列设计引物s1-r-pa-f和pa-r，其中，s1-r-pa-f序列的5
′
端包含s1基因的下游序列；
78.s1-r-pa-f：5
′‑
aacaagttgttcttatgttaggagcttcttcagctggaaa-3
′
和
79.pa-r：5
′‑
ccgctcgagttattttattcgtag-3
′
80.以基因合成的s1基因为模板，利用引物s1-f和s1-r-pa-f扩增含有pa基因5
′
端序列的s1基因，以s1-r-pa-f和pa-r扩增含有s1基因3
′
端序列的pa基因；利用s1-f和pa-r通过重叠pcr扩增3
′
端带有pa基因的s1基因后，将其克隆至杆状病毒表达载体pfastbac1；将连接产物转化至e.coli dh5α中，提取重组表达质粒并进行双酶切鉴定；将重组表达质粒转化至e.coli dh10bac，通过蓝白斑筛选获得重组杆粒；
81.步骤二：重组杆状病毒的构建
82.sf9昆虫细胞在含有5％胎牛血清的sf900iii昆虫细胞培养基中于27℃培养，取1μg重组杆粒置于100μl sf900iii昆虫细胞培养基，加入8μl转染试剂cellfectin
tm ii，充分混匀后室温孵育30min，然后滴加至含有80％sf9昆虫细胞的细胞培养皿中，27℃培养96h后，获取第一代重组杆状病毒，连续传代至第四代；取第四代重组杆状病毒感染后的细胞上
清进行western blot鉴定：一抗用h120疫苗免疫后获得的鸡血清(稀释倍数为1:1000)，4℃孵育过夜后加入hrp标记的羊抗鸡酶标二抗(稀释倍数为1:5000)，期间以pbst清洗3次，室温孵育1h后通过ecl显色观察；
83.步骤三：gem的制备
84.将乳酸乳球菌mg1363株在m17培养基中30℃培养过夜后，用m17培养基将菌液稀释500倍，30℃，180rpm培养至菌液od值至0.4～0.6之间，此时收获菌液，7000rpm室温离心10min，弃上清后用10mm pbs重悬沉淀，相同条件再次离心；用10％三氯乙酸重悬菌体，煮沸30min后7000rpm室温离心10min以去除酸液，再用pbs洗涤5次后进行细菌计数；以2.5
×
109为1u，将样品真空干燥、喷金镀膜后置于透射电子显微镜下观察；
85.步骤四：表面展示s1蛋白blp的制备
86.将第四代重组杆状病毒接种到悬浮培养的sf9昆虫细胞中，27℃，180rpm培养5天后收取悬浮细胞，4℃，4000rpm离心30min；将pbs重悬后的细胞沉淀进行超声破碎，4℃，12000rpm离心15min，上清即为s1蛋白；利用bca蛋白定量试剂盒对s1蛋白进行定量；取1u的gem离心后分别与不同浓度的s1蛋白重悬，室温120rpm孵育2h后，4℃2000rpm离心15min；将收集的沉淀经pbs洗涤后，进行sds-page鉴定和透射电子显微镜观察，经鉴定，1u的gem最多可以结合130μg的s1蛋白，将结合了130μg s1蛋白的gem命名为blp-s1。
87.为进一步证明本技术提供的blp具有应用于疫苗研发的潜力与可行性，本发明针对本实施例中的blp疫苗的制备方法进行了一系列实验验证，具体如下：
88.1、杆状病毒-昆虫细胞系统表达ibv的s1蛋白的鉴定
89.以合成基因s1和pcr扩增获得的锚钩蛋白pa的基因产物为模板，利用引物s1-f、pa-r进行扩增融合，对pcr扩增产物进行1％(m/v)琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图1a所示，融合基因大小2,329bp；用ecor i和xho i对s1基因进行双酶切并回收酶切产物，利用t4 dna连接酶将上述酶切产物与pfastbac1载体进行连接，采用酶切验证结果如图1b所示，s1基因正确重组至pfastbac1；将鉴定正确的重组质粒转化至escherichia coli dh10 bac感受态细胞，培养48h后挑取白斑，对所提取的重组杆粒进行pcr鉴定。如图1c所示，pcr产物大小与预期一致，表明重组杆粒构建正确。
90.用重组杆粒转染sf9细胞获得第一代重组杆状病毒rbv-s1。将第一代rbv-s1感染贴壁的sf9细胞，27℃培养96h后显微镜下观察细胞病变情况。如图2所示，与正常细胞(图2a)相比，感染rbv-s1的细胞(图2b)出现细胞变大、变圆，增殖变慢甚至不增殖，细胞发生脱落、破碎等病变现象。取第四代重组杆状病毒感染后的细胞上清经western blot鉴定分析目的蛋白的表达情况。如图2c所示，s1蛋白条带约为90kda，与预期大小相符，说明重组杆状病毒感染sf9细胞后可以表达s1蛋白。
91.2、表面展示s1蛋白的blp鉴定
92.将经过热酸处理的乳酸酸乳球菌样品真空干燥后，置于tem下观察，如图3a所示，该菌仍保留细菌形态，表面光滑且胞质中蛋白和核酸已经去除，表明gem制备成功；为了定量gem结合s1蛋白的能力，首先利用bca蛋白定量试剂盒对重组杆状病毒表达的s1蛋白进行定量，然后将不同浓度的s1蛋白分别与gem室温孵育后，利用image j软件对sds-page中的s1蛋白进行灰度值分析，如图3b所示，图中各附图标记含义为：m：蛋白marker；1：0μg；2：40μg；3：80μg；4：120μg；5：130μg；6：140μg；由图3b可得1u的gem最多可以结合130μg的s1蛋白，
这也得到了灰度值统计分析的证实(如图3c，3d所示)；在tem下，可见结合了130μg s1蛋白的gem为椭球形，与裸露的gem相比，其表面不再光滑，而是被一层絮状物质覆盖，表明s1蛋白展示于gem表面(如图3e所示)；western blot也证实gem表面结合的s1蛋白条带大小与预期相符(如图3f所示)。
93.3、动物免疫与攻毒
94.将60只14日龄蛋鸡(吉林德大有限公司购买所得)随机分为3组，每组20只，分别设置实验组(blp-s1组)、h120疫苗组(阳性对照组)(h120疫苗，哈药集团生物疫苗有限公司)以及pbs阴性对照组。各组鸡共进行三次免疫，每次间隔2周，每次鼻腔接种100μl/只。最后一次免疫14天后经鼻腔攻毒ibv m41株(genbank：dq834384.1)，攻毒剂量为103.0eid50/0.1ml，100μl/只。免疫攻毒程序如图4所示，攻毒后连续观察14天，每日观察并记录鸡只临床症状。
95.4、elisa(酶联免疫吸附剂测定)
96.于首免后第7、14、21、28、35、42天，以及攻毒后第5、7、10、14天，随机采集各组6只鸡的翅下静脉血，3,000rpm离心5min，分离血清后用idexx ibvab elisa试剂盒(北京爱德士生物科技有限公司)分别鉴定免疫和攻毒后ibv特异性igg抗体水平变化。与此同时，随机采集各组3只鸡的气管，用等量pbs进行反复的冲洗后用chicken iga elisa kit试剂盒(novus biologicals，usa)检测气管灌洗液中分泌型iga(secretory iga，siga)抗体水平，结果如下：
97.(1)免疫后血清和气管灌洗液中抗体水平检测
98.将结合了130μg s1蛋白的gem命名为blp-s1。为了鉴定它的免疫原性，滴鼻免疫14日龄蛋鸡，一共免疫三次，每次间隔两周。如图5所示的elisa检测结果显示，与pbs组相比，blp-s1组和h120组均能显著提高血清中ibv特异性igg抗体水平和气管灌洗液中siga抗体水平(图5b)。在三免后，blp-s1组igg的抗体水平很快上升；在免疫后第42天，与h120组igg的抗体水平无显著差异(p》0.05)(图5a)。
99.(2)攻毒后血清和气管灌洗液中抗体水平检测
100.为了检测攻毒后对免疫鸡抗体水平变化的影响，于攻毒后第5、7、10、14天分别用idexx ibvab elisa试剂盒和chicken iga elisakit试剂盒检测ibv特异性igg和气管灌洗液中siga的抗体水平变化。如图6所示攻毒后的elisa检测结果显示，blp-s1组和h120组的igg和siga于攻毒后第5天抗体水平均低于攻毒前的水平，而后逐渐上升。blp-s1组攻毒5天后igg抗体水平与h120组igg抗体水平差异均不显著(p》0.05)。
101.5、qrt-pcr
102.为了检测免疫攻毒后鸡只的排毒情况，于攻毒后第3、5、7、10、14天，随机采集各组8只鸡的口咽拭子和泄殖腔拭子，放入含有2
×
106u/l青霉素和200mg/l链霉素的pbs中；4℃，5000g离心10min后，取0.2ml经0.22μm滤器过滤的上清液经尿囊腔接种3枚9～11日龄spf鸡胚(北京梅里亚实验动物技术有限公司)。37℃培养3天后，无菌收取尿囊液并混合，提取病毒rna后进行qrt-pcr鉴定。检测用引物：
103.n-f：5
′‑
ttgaaggtagyggygttcctgan-3
′
和
104.o-n-r：5
′‑
cagmaacccacactataccatc-3
′
105.上述引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；鉴定结果如下：
106.由表1可知，在攻毒后14天内，blp-s1和h120组在攻毒后第3天于口咽拭子和泄殖腔拭子中检测到病毒rna，但此后再未检出。与免疫组相比，pbs对照组的排毒率直至攻毒后第14天仍然高达87.5％。
107.表1
[0108][0109]
6、eid
50
测定(鸡胚半数感染量测定)
[0110]
为了检测免疫攻毒后组织内的病毒载量，于攻毒后第5、7、10、14天，随机无菌采集各组3只鸡的肺脏和肾脏，将组织剪碎研磨，4℃，5,000rpm离心10min后，上清用0.22μm滤器过滤除菌；将组织研磨上清液经10倍倍比稀释后，取100μl经尿囊腔接种9～11日龄spf鸡胚，37℃培养3天后，按照reed-muench法测定组织中病毒的eid
50
，结果如下：
[0111]
由图7可知，在攻毒后第5天和第7天，可以在blp-s1和h120免疫组鸡只的肺脏(图7a)和肾脏(图7b)检测到病毒，而至攻毒后第10天和第14天已经检测不到病毒。
[0112]
7、攻毒后动物的临床症状
[0113]
为了说明blp-s1的免疫保护效果，统计了各组鸡在感染ibv后14天内的死亡情况。在攻毒后第3天，pbs组部分鸡只出现甩头、流鼻液等症状，有1只鸡死亡。攻毒后第4～8天时，流鼻液、甩头明显，在此期间共有死亡9只鸡，剖检发现鸡的气管和喉头黏液分泌旺盛。虽然此后该组鸡的症状有所减轻，未再出现死亡，但是第14天时仍有鸡出现啰音，鼻液黏稠现象。blp-s1组鸡在攻毒后未出现典型的ib症状和不良反应，保护率达到100％；由此表明，blp-s1对鸡只具有良好的免疫保护作用，保护率可达100％。
[0114]
相应的，本发明提供一种鸡传染性支气管炎细菌样颗粒在制备治疗鸡传染性支气管炎疫苗中的应用。

技术特征：
1.一种鸡传染性支气管炎细菌样颗粒疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：杆状病毒重组杆粒的构建基因合成的ibv毒株h120表面刺突蛋白s1基因序列，并设计s1基因的特异性引物；s1-f：5
′‑
cggatccatgttggggaagtc-3
′
根据锚钩蛋白pa，即乳酸乳球菌mg1363的acma序列设计引物s1-r-pa-f和pa-r，其中，s1-r-pa-f序列的5
′
端包含s1基因的下游序列；s1-r-pa-f：5
′‑
aacaagttgttcttatgttaggagcttcttcagctggaaa-3
′
和pa-r：5
′‑
ccgctcgagttattttattcgtag-3
′
以基因合成的s1基因为模板，利用引物s1-f和s1-r-pa-f扩增含有pa基因5
′
端序列的s1基因，以s1-r-pa-f和pa-r扩增含有s1基因3
′
端序列的pa基因；利用s1-f和pa-r通过重叠pcr扩增3
′
端带有pa基因的s1基因后，将其克隆至杆状病毒表达载体pfastbac1；将连接产物转化至e.coli dh5α中，提取重组表达质粒并进行双酶切鉴定；将重组表达质粒转化至e.coli dh10bac，通过蓝白斑筛选获得重组杆粒；步骤二：重组杆状病毒的构建sf9(spodoptera frugiperda)昆虫细胞在含有5％胎牛血清的sf900iii昆虫细胞培养基中于27℃培养，取重组杆粒置于100μl sf900iii昆虫细胞培养基，加入转染试剂cellfectin
tm
ii，充分混匀后室温孵育，然后滴加至含有sf9昆虫细胞的细胞培养皿中，27℃条件下培养后，获取第一代重组杆状病毒，连续传代至第四代；取第四代重组杆状病毒感染后的细胞上清进行western blot鉴定：一抗用h120疫苗免疫后获得的鸡血清，4℃孵育过夜后加入hrp标记的羊抗鸡酶标二抗，期间以pbst清洗3-6次，室温孵育1h-2h后通过ecl显色观察；步骤三：gem的制备将乳酸乳球菌mg1363株在m17培养基中30℃培养过夜后，用m17培养基将菌液稀释，30℃，180rpm培养至菌液od值至0.4～0.6之间，此时收获菌液，7000rpm室温离心，弃上清后用10mm pbs重悬沉淀，相同条件再次离心；用10％三氯乙酸重悬菌体，煮沸30min后7000rpm室温离心10-15min以去除酸液，再用pbs洗涤5次后进行细菌计数；以2.5
×
109为1u，将样品真空干燥、喷金镀膜后置于透射电子显微镜下观察；步骤四：表面展示s1蛋白blp的制备将第四代重组杆状病毒接种到悬浮培养的sf9昆虫细胞中，27℃，180rpm培养4-5天后收取悬浮细胞，4℃，4000rpm条件下离心；将pbs重悬后的细胞沉淀进行超声破碎，4℃，12000rpm条件下离心，上清即为s1蛋白；利用bca蛋白定量试剂盒对s1蛋白进行定量；取1u的gem离心后分别与不同浓度的s1蛋白重悬，室温120rpm孵育后，4℃，2000rpm离心10-20min；将收集的沉淀经pbs洗涤后，进行sds-page鉴定和透射电子显微镜观察，经鉴定，1u的gem最多可以结合130μg的s1蛋白，将结合了130μg s1蛋白的gem命名为blp-s1。2.根据权利要求1中所述的一种鸡传染性支气管炎细菌样颗粒疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤二中重组杆粒取用剂量为：1-5μg；所述转染试剂cellfectin
tm
ii加入剂量为：5-10μl。3.根据权利要求2中所述的一种鸡传染性支气管炎细菌样颗粒疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤二中充分混匀后室温孵育时间为30-60min；所述27℃条件下培养时间为
72-96h。4.根据权利要求3中所述的一种鸡传染性支气管炎细菌样颗粒疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤二中一抗所用h120疫苗免疫后获得的鸡血清抗体稀释倍数为1∶500-1∶1000；所述羊抗鸡酶标二抗抗体稀释倍数为1∶1000-1∶5000。5.根据权利要求4中所述的一种鸡传染性支气管炎细菌样颗粒疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤三中m17培养基将菌液稀释至300-500倍；所述收获菌液后，7000rpm室温条件下离心时间为10-15min。6.根据权利要求5中所述的一种鸡传染性支气管炎细菌样颗粒疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤三中收取悬浮细胞后，4℃，4000rpm条件下离心时间为20-30min；所述超声破碎厚，4℃，12000rpm条件下离心时间为10-20min；7.一种鸡传染性支气管炎细菌样颗粒在制备治疗鸡传染性支气管炎疫苗中的应用。

技术总结
本发明公开了一种鸡传染性支气管炎细菌样颗粒疫苗的制备方法和应用，属于疫苗制备技术领域。该方法包括以下步骤：步骤一：杆状病毒重组杆粒的构建、步骤二：重组杆状病毒的构建、步骤三：GEM的制备和步骤四：表面展示S1蛋白BLP的制备。本申请是通过利用昆虫细胞-杆状病毒系统表达了GI基因型IBV的S1蛋白，并立足于GEM-PA表面展示技术构建了表面展示S1蛋白的BLP，提供一种新型有效的鸡传染性支气管炎细菌样颗粒疫苗，已解决现有技术中活疫苗株与病毒发生基因重组的问题。毒发生基因重组的问题。毒发生基因重组的问题。


技术研发人员：张鹏举 张涛 丛彦龙 李信涛 王伟霞 胡念之
受保护的技术使用者：吉林省农业科学院
技术研发日：2023.04.14
技术公布日：2023/7/12