一种纳米药物柠檬酸钠及其制备方法和应用

1.本发明属于生物医用纳米材料技术领域，尤其涉及一种纳米药物柠檬酸钠及其制备方法和应用。


背景技术：

2.1986年，friedlander指出用炭疽致死毒素(lt)处理原代小鼠巨噬细胞会导致细胞死亡和细胞内容物的快速释放，这是最早对细胞焦亡的研究。1989年首次发现caspase-1蛋白，并逐渐证明了caspase-1蛋白是一种炎症性的caspase蛋白，能将il-1β前体加工成成熟的il-1β。1999年，zychlinsky团队又发现通过敲除caspase-1蛋白可以有效阻止细菌感染细胞的死亡，说明caspase-1蛋白的激活与沙门氏菌引起的细胞死亡密切相关。由于当时对细胞死亡认识的限制，这种细胞死亡形式最初被认为是细胞凋亡，因为它的某些特征类似于细胞凋亡，例如caspase蛋白依赖性、dna损伤和核浓缩。直到2001年，brad cookson和lawrence h.boise团队才阐明这种细菌感染引起的巨噬细胞死亡是一种完全不同于细胞凋亡的死亡方式，并将这种caspase-1依赖的程序性坏死正式定义为“焦亡”。焦亡的细胞会表现出特定的形态特征，在细胞膜破裂之前会形成气泡样囊泡，细胞体积增大，细胞器变形，细胞核变小，失去细胞膜的完整性，细胞内的促炎分子能迅速有效地从细胞中释放出来，从而引发炎症。细胞焦亡释放炎症介质，刺激树突细胞成熟并激活毒性t淋巴细胞，从而导致强烈的免疫反应。
3.研究发现，很多化疗药物和纳米材料都能诱导不可控的细胞焦亡，在杀伤肿瘤细胞的同时，对正常组织和细胞产生毒性，导致严重的生物安全性问题。因此，迫切需要发展可控的且能特异性诱导肿瘤细胞焦亡的纳米药物用于癌症治疗。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种纳米药物柠檬酸钠及其制备方法和应用，该纳米药物柠檬酸钠能够诱导肿瘤细胞焦亡。
5.本发明提供了一种纳米药物柠檬酸钠，由油酸钠和柠檬酸氨微乳液法反应制得。
6.在本发明中，所述纳米药物柠檬酸钠的粒径为10～300nm。
7.本发明提供了一种上述技术方案所述纳米药物柠檬酸钠的制备方法，包括以下步骤：
8.将柠檬酸铵水溶液与油酸钠有机溶液混合后，微乳液法反应，得到纳米药物柠檬酸钠。
9.在本发明中，所述油酸钠有机溶液中的有机溶剂选自正己烷、无水乙醇和油胺的混合物。
10.在本发明中，所述正己烷、无水乙醇和油胺的体积比为(10～15)ml:(3～5)ml:(1～2)ml。具体实施例中，所述正己烷、无水乙醇和油胺的体积比为10:3:1；或10:5:1；或15:3:1；或10:3:2。
11.在本发明中，所述柠檬酸铵水溶液的浓度为50～100mg/ml；具体实施例中，所述柠檬酸铵水溶液的浓度为100mg/ml、或50mg/ml。
12.所述油酸钠有机溶液的浓度为1.05～1.43mg/ml。具体实施例中，所述油酸钠有机溶液的浓度为20mg/14ml；或20mg/16ml；或20mg/19ml；或20mg/15ml。
13.在本发明中，柠檬酸铵水溶液和油酸钠有机溶液混合具体包括：
14.在500～1000rpm搅拌下，将柠檬酸铵水溶液逐滴加入油酸钠有机溶液中。
15.在本发明中，所述微乳液法反应的温度为20～40℃，微乳液法反应的时间为5～60min。
16.本发明提供了一种肿瘤治疗药物，包括上述技术方案所述的纳米药物柠檬酸钠。
17.本发明提供了一种纳米药物柠檬酸钠，由油酸钠和柠檬酸氨微乳液法反应制得。该纳米相柠檬酸钠将钠离子和柠檬酸根离子绕过细胞对离子运输的调控，并通过胞吞作用进入肿瘤细胞内部，具有良好的肿瘤细胞选择性，激活细胞焦亡通路，诱导免疫原性细胞死亡，提高肿瘤治疗效果。本发明提供的制备纳米药物柠檬酸钠的方法简单，条件温和，环境友好，可重复性强，能实现批量制备，且原料成本低廉，具有很大的应用前景。
附图说明
18.图1为本发明实施例1得到的纳米药物的透射电镜图像；
19.图2为本发明实施例9得到的自组装纳米药物的透射电镜图像；
20.图3为本发明实施例9得到的自组装纳米药物进一步放大的透射电镜图像；
21.图4为本发明实施例1得到的自组装纳米药物对小鼠乳腺癌细胞(4t1)和小鼠正常细胞(3t3)的抑制结果图。
22.图5为本发明实施例9得到的自组装纳米药物对小鼠乳腺癌细胞(4t1)和小鼠正常细胞(3t3)的抑制结果图。
具体实施方式
23.为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种纳米药物柠檬酸钠及其应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
24.实施例1
25.在室温下，将100mg柠檬酸铵分散于1ml去离子水中，20mg油酸钠分散于10ml正己烷、3ml乙醇和1ml油胺的有机溶液中。将有机溶液置于30℃水浴锅中，750rpm搅拌下，逐滴加入53μl柠檬酸铵水溶液，搅拌反应10min。离心收集沉淀，正己烷和无水乙醇混合溶液洗涤2次，无水乙醇洗涤1次，得到柠檬酸钠纳米药物。
26.采用透射电子显微镜对柠檬酸钠纳米药物进行形貌表征，结果如图1所示，可以看出微乳液法制得的柠檬酸钠纳米药物为尺寸均一的球形颗粒。
27.实施例2
28.在室温下，将100mg柠檬酸铵分散于1ml去离子水中，20mg油酸钠分散于10ml正己烷、3ml乙醇和1ml油胺的有机溶液中。将有机溶液置于30℃水浴锅中，750rpm搅拌下，逐滴加入106μl柠檬酸铵水溶液，搅拌反应10min。离心收集沉淀，正己烷和无水乙醇混合溶液洗涤2次，无水乙醇洗涤1次，得到柠檬酸钠纳米药物。
29.实施例3
30.在室温下，将50mg柠檬酸铵分散于1ml去离子水中，20mg油酸钠分散于10ml正己烷、3ml乙醇和1ml油胺的有机溶液中。将有机溶液置于30℃水浴锅中，750rpm搅拌下，逐滴加入53μl柠檬酸铵水溶液，搅拌反应10min。离心收集沉淀，正己烷和无水乙醇混合溶液洗涤2次，无水乙醇洗涤1次，得到柠檬酸钠纳米药物。
31.实施例4
32.在室温下，将100mg柠檬酸铵分散于1ml去离子水中，20mg油酸钠分散于10ml正己烷、5ml乙醇和1ml油胺的有机溶液中。将有机溶液置于30℃水浴锅中，750rpm搅拌下，逐滴加入53μl柠檬酸铵水溶液，搅拌反应5min。离心收集沉淀，正己烷和无水乙醇混合溶液洗涤2次，无水乙醇洗涤1次，得到柠檬酸钠纳米药物。
33.实施例5
34.在室温下，将100mg柠檬酸铵分散于1ml去离子水中，20mg油酸钠分散于15ml正己烷、3ml乙醇和1ml油胺的有机溶液中。将有机溶液置于30℃水浴锅中，750rpm搅拌下，逐滴加入53μl柠檬酸铵水溶液，搅拌反应60min。离心收集沉淀，正己烷和无水乙醇混合溶液洗涤2次，无水乙醇洗涤1次，得到柠檬酸钠纳米药物。
35.实施例6
36.在室温下，将100mg柠檬酸铵分散于1ml去离子水中，20mg油酸钠分散于10ml正己烷、3ml乙醇和2ml油胺的有机溶液中。将有机溶液置于30℃水浴锅中，1000rpm搅拌下，逐滴加入53μl柠檬酸铵水溶液，搅拌反应10min。离心收集沉淀，正己烷和无水乙醇混合溶液洗涤2次，无水乙醇洗涤1次，得到柠檬酸钠纳米药物。
37.实施例7
38.在室温下，将100mg柠檬酸铵分散于1ml去离子水中，20mg油酸钠分散于10ml正己烷、3ml乙醇和1ml油胺的有机溶液中。将有机溶液置于30℃水浴锅中，500rpm搅拌下，逐滴加入53μl柠檬酸铵水溶液，搅拌反应20min。离心收集沉淀，正己烷和无水乙醇混合溶液洗涤2次，无水乙醇洗涤1次，得到柠檬酸钠纳米药物。
39.实施例8
40.在室温下，将100mg柠檬酸铵分散于1ml去离子水中，20mg油酸钠分散于10ml正己烷、3ml乙醇和1ml油胺的有机溶液中。将有机溶液置于37℃水浴锅中，750rpm搅拌下，逐滴加入53μl柠檬酸铵水溶液，搅拌反应10min。离心收集沉淀，正己烷和无水乙醇混合溶液洗涤2次，无水乙醇洗涤1次，得到柠檬酸钠纳米药物。
41.实施例9
42.在室温下，将100mg柠檬酸铵分散于1ml去离子水中，20mg油酸钠分散于10ml正己烷、3ml乙醇和1ml油胺的有机溶液中。将有机溶液置于30℃水浴锅中，750rpm搅拌下，逐滴加入53μl柠檬酸铵水溶液，搅拌反应10min。离心收集沉淀，无水乙醇洗涤3次，得到柠檬酸钠纳米药物。
43.本发明对实施例1得到的自组装纳米药物进行体外细胞毒性分析的测试，测试方法如下：
44.采用mtt法测定细胞毒性：4t1细胞以每孔6000个细胞的密度接种于96孔板，在rmpi培养基中培养12h。3t3细胞以每孔6000个细胞的密度接种于96孔板，在mem培养基中培
养12h。加入不同浓度的柠檬酸钠纳米药物(浓度范围为0-200μg
·
ml-1
)共孵育24h，利用mtt检测法检测细胞增殖。
45.测试结果如图4所示，图4为本发明实施例1得到的柠檬酸钠纳米药物对小鼠乳腺癌细胞(4t1)和小鼠正常细胞(3t3)的抑制结果图。由图4可以看出，柠檬酸钠纳米药物通过细胞焦亡能够对4t1细胞实现一定的抑制作用，并且具有剂量依赖性，药物浓度低于50μg
·
ml-1
时对小鼠癌细胞以及正常细胞无明显毒性，药物浓度达到100μg
·
ml-1
时4t1细胞存活率仅为50％左右而3t3细胞存活率为80％以上，纳米药物对3t3细胞的毒性显著低于4t1，可以看出柠檬酸钠纳米药物具有较好的肿瘤细胞选择性。
46.本发明对实施例9得到的自组装纳米药物进行体外细胞毒性分析的测试，测试方法如下：
47.采用mtt法测定细胞毒性：4t1细胞以每孔6000个细胞的密度接种于96孔板，在rmpi培养基中培养12h。3t3细胞以每孔6000个细胞的密度接种于96孔板，在mem培养基中培养12h。加入不同浓度的柠檬酸钠纳米药物(浓度范围为0-200μg
·
ml-1
)共孵育24h，利用mtt检测法检测细胞增殖。
48.测试结果如图5所示，图5为本发明实施例1得到的柠檬酸钠纳米药物对小鼠乳腺癌细胞(4t1)和小鼠正常细胞(3t3)的抑制结果图。由图5可以看出，柠檬酸钠纳米药物通过细胞焦亡能够对4t1细胞实现一定的抑制作用，并且具有剂量依赖性，药物浓度低于50μg
·
ml-1
时对小鼠癌细胞以及正常细胞无明显毒性，药物浓度达到100μg
·
ml-1
时4t1细胞存活率仅为10％左右而3t3细胞存活率为60％左右，纳米药物对3t3细胞的毒性显著低于4t1，可以看出柠檬酸钠纳米药物具有较好的肿瘤细胞选择性。
49.由以上实施例可知，本发明提供了一种纳米药物柠檬酸钠，由油酸钠和柠檬酸氨微乳液法反应制得。所述纳米药物柠檬酸钠的制备方法简单，反应条件温和，环境友好，可重复性强，能够实现批量制备，且原料成本低廉，同时具有良好的肿瘤细胞杀伤效果，通过胞吞作用将大量离子带入细胞内，突然过量的离子会导致细胞内渗透压和稳态失衡，激活细胞焦亡通路，诱导免疫原性细胞死亡，调节免疫抑制的肿瘤微环境，进而激活全身抗肿瘤免疫反应，以对抗肿瘤的复发和转移。
50.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种纳米药物柠檬酸钠，由油酸钠和柠檬酸氨微乳液法反应制得。2.根据权利要求1所述的纳米药物柠檬酸钠，其特征在于，所述纳米药物柠檬酸钠的粒径为10～300nm。3.一种权利要求1～2任一项所述纳米药物柠檬酸钠的制备方法，包括以下步骤：将柠檬酸铵水溶液与油酸钠有机溶液混合，微乳液法反应，得到纳米药物柠檬酸钠。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述油酸钠有机溶液中的有机溶剂选自正己烷、无水乙醇和油胺的混合物。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述正己烷、无水乙醇和油胺的体积比为(10～15)ml:(3～5)ml:(1～2)ml。6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述柠檬酸铵水溶液的浓度为(50～100)mg/ml；所述油酸钠有机溶液的浓度为(1.05～1.43)mg/ml。7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，柠檬酸铵水溶液和油酸钠有机溶液混合具体包括：在500～1000rpm搅拌下，将柠檬酸铵水溶液逐滴加入油酸钠有机溶液中。8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述微乳液法反应的温度为20～40℃，微乳液法反应的时间为5～60min。9.一种肿瘤治疗药物，其特征在于，包括权利要求1～2任一项所述的纳米药物柠檬酸钠或权利要求3～8任一项所述制备方法制备的纳米药物柠檬酸钠。

技术总结
本发明提供了一种纳米药物柠檬酸钠及其制备方法和应用，纳米药物柠檬酸钠由油酸钠和柠檬酸氨微乳液法反应制得。所述纳米药物柠檬酸钠的制备方法简单，反应条件温和，环境友好，可重复性强，能够实现批量制备，且原料成本低廉，同时具有良好的肿瘤细胞杀伤效果，通过胞吞作用将大量离子带入细胞内，突然过量的离子会导致细胞内渗透压和稳态失衡，激活细胞焦亡通路，诱导免疫原性细胞死亡，调节免疫抑制的肿瘤微环境，进而激活全身抗肿瘤免疫反应，以对抗肿瘤的复发和转移。对抗肿瘤的复发和转移。


技术研发人员：林君 李晶 马平安 丁彬彬
受保护的技术使用者：中国科学院长春应用化学研究所
技术研发日：2023.04.12
技术公布日：2023/7/12