一种检测茶树品种和实质性派生关系的方法

1.本发明涉及茶树鉴定技术领域，具体涉及一种检测茶树品种和实质性派生关系的方法。


背景技术：

2.随着国内外种子贸易的发展，基于真实性和纯度的种子质量对于育种者和农民来说越来越重要。实质性派生品种相对于初始品种，除了派生引起的差异外，所表达的由原始品种基因型或基因型组合产生的本质特性与原始品种相同。实质性派生品种作为新品种注册会损害初始品种育种者的利益，降低原有育种创新者的积极性，造成修饰育种的泛滥，也将导致作物品种的遗传背景越来越单一，不利于作物的遗传改良。
3.突变体在茶树品种中发生是一种普遍现象。用于登记或授予植物育种者权利的标准形态和生理特征需足以确定新突变品种的特异性(distinctness)、一致性(uniformity)和稳定性(stability)。然而，形态和生理特征不允许准确地确定遗传一致性。因此，表型不同的突变体很可能被确定为新的品种。中国已于2022年3月正式实施实质性派生品种制度，因此茶树品种及实质性派生品种的鉴定与控制是一个亟待解决的问题。
4.ssr(simple sequence repeats,简单序列重复)标记或snp(single nucleotide polymorphisms，单核酸多态)标记是目前常用的品种鉴定与检测实质性派生关系的方法之一。第二代分子标记ssr存在一些问题，如成本高、长度相差过小或者内部的碱基组成不一样的相同长度的片段难以检测。第3代dna分子标记克服了ssr的不足，而且具有操作简单、快速、重复性好、自动化等特点，已逐步成为主流标记。与主要粮食作物相比，茶树snp分子标记发育较晚，有待进一步完善和补充。开发茶树snp分子标记，建立真实可靠的dna分子检测技术，对实质性派生品种制度的实施具有重要的战略意义。


技术实现要素：

5.为了克服上述现有技术的缺陷，本发明所要解决的技术问题是通过一种检测茶树品种和实质性派生关系的方法，建立真实可靠的dna分子检测技术，探索茶树的实质派生关系。
6.为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种检测茶树品种和实质性派生关系的方法，包括以下步骤：
7.s1：收集不同的茶树品种进行全基因组gbs(genotyping-by-sequencing)高通量测序；
8.s2：将s1获得的序列进行过滤筛选，获得snps(多个单核酸多态)；
9.s3：筛选在茶树基因组15条染色体上均匀分布的snps，得到snps组合；
10.s4：验证snps组合的遗传信息量；
11.s5：计算茶树之间的gs(遗传相似系数，genetic similarity)，鉴定派生品种。
12.本发明的有益效果在于：本发明的检测茶树品种和实质性派生关系的方法，通过
s1～s4筛选得到遗传多态性好，在茶树中缺失率低的snps组合，采用该snps组合计算gs，该gs可靠性高，可作为茶树间是否存在疑似派生关系的参考。
附图说明
13.图1所示为本发明的实施例一的973个snps组合的pca分析图；
14.图2所示为本发明的实施例一的973个snps组合区分349个茶树的系统分类图；
15.图3所示为本发明的实施例二的21个snps组合和14个snps组合鉴别349个茶树的指纹图谱；
16.图4所示为表4引物进行随机一代测序后的分型结果图。
具体实施方式
17.为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。
18.本发明最关键的构思在于：先筛选得到遗传多态性好，在茶树中缺失率低的snps组合，再采用该snps组合计算gs，鉴定派生品种。
19.本发明的一种检测茶树品种和实质性派生关系的方法，包括以下步骤：
20.s1：收集不同的茶树品种进行全基因组gbs高通量测序；
21.s2：将s1获得的序列进行过滤筛选，获得snps；
22.s3：筛选在茶树基因组15条染色体上均匀分布的snps，得到snps组合；
23.s4：验证snps组合的遗传信息量；
24.s5：计算茶树之间的gs，鉴定派生品种。
25.从上述描述可知，本发明的有益效果在于：本发明的检测茶树品种和实质性派生关系的方法，通过s1～s4筛选得到遗传多态性好，在茶树中缺失率低的snps组合，采用该snps组合计算gs，该gs可靠性高，可用来鉴定茶树品种及其派生关系。
26.进一步的，s2中过滤筛选的标准为：miss rate(缺失率)《20％、maf(次等位基因频率)》10％，位点两侧150bp范围内无其它snp。
27.进一步的，s3的筛选条件为：pic(多态信息量值)》0.15,miss rate《5％，maf》15％，均匀分布在茶树基因组15条染色体上。
28.从上述描述可知，筛选出均匀覆盖在茶树15条染色体上的snps组合，该snps组合遗传多态性更好，且在茶树中缺失率更低。
29.进一步的，s4具体为：计算ho值(平均观察杂合度)和gd(基因多样性)平均值，验证snps组合的遗传信息量。
30.从上述描述可知，ho值与gd平均值均＞0.3可认为具有较高的ho值与gd平均值，表明snps组合具有丰富的遗传信息量，且所有snp两侧150bp范围内无其它snp干扰，有较好的鉴别能力，适合用于茶树品种鉴定。
31.进一步的，s5计算后0.9《gs《0.97，该茶树品种为疑似派生品种；gs》0.97，该茶树品种为实质派生品种。
32.从上述描述可知，ciopora(国际无性繁殖园艺植物育种家协会)推荐遗传相似系数gs》0.9作为实质性派生种鉴别的有力证据。然而，以0.9的遗传相似系数作为阈值标准可
能并不适用于所有作物，基于分子标记的实质性派生种dus(显著性、均匀性和稳定性)评价体系需要不同作物不同对待。目前，茶树edv的具体阈值尚未明确，在此只能暂时将0.9的遗传相似系数作为阈值，并将其作为茶树间是否存在疑似派生关系的参考。
33.即使同一品种的个体在不同的地方长期栽培，也会有少量的基因突变积累。根据upov(国际植物新品种保护公约)法案中给出的例子，突变体即可被视为实质性派生种，如果两个个体之间的遗传相似性极高，甚至大于同一品种个体之间的遗传相似性，但它们具有不同的表型，则应为具有派生关系的突变体。因此，本发明以已知属于同一品种但生长在不同地方的6对茶树作为阳性对照，来确定无可争议的派生关系，并根据“末尾原则”("tail principle")，以其中最小的遗传相似值(0.97)作为无可争议的实质性派生关系的阈值。
34.进一步地，在snps组合中筛选出snps位点，依据snps位点制备指纹图谱。
35.进一步地，筛选出snps位点的具体操作为：
36.s1：在snps组合中选择最高可识别的snp作为初始数据集，将剩余snp分别添加到初始数据集，形成数个新数据集；
37.s2：从新数据集中选择出第2个最高可识别的snp，并添加到初始数据集中；
38.s3：重复s2，依次选择第3～n个最高可识别的snp，直至茶树分辨性为100％。
39.从上述描述可知，在snps组合的基础上，以所有样本的成对比较的可辨性为过滤条件，相同辨识度情况下选择pic值高的snp，从而选择出数量最少同时可辨性高的snps位点，可用于品种简单快速鉴定。该snps位点经严格筛选，且这些位点两侧均无其他snp干扰，适合采用snapshot(数据快照)或kasp(竞争性等位基因特异性pcr)技术对茶树进行检测。在该snp位点两侧的保守区域设计引物，所设计引物经过随机一代测序随机检测，可准确测出杂合位点。
40.本发明的实施例一为：
41.一种检测茶树品种和实质性派生关系的方法，包括以下步骤：
42.s1：收集12个省份的349个的茶树品种(见表1～表3)，采用植物基因组dna提取试剂盒(康威cw0553s)提取，按照制造厂商说明书进行检测和全基因组gbs高通量测序，测序获得829.05g高质量测序数据，测序获得的原始数据上传ncbi数据库(项目号bioproject number:prjna924950)。
43.表1
[0044][0045]
[0046]
表2
[0047]
[0048][0049]
表3
[0050][0051]
[0052]
s2：以miss rate《20％、maf》10％，位点两侧150bp范围内无其它snp为筛选条件，将s1获得的序列进行过滤筛选，共获得12,937,679个snps。
[0053]
s3：以pic》0.15,miss rate《5％，maf》15％，均匀分布在茶树基因组15条染色体上为筛选条件从12,937,679个snps中筛选出均匀分布在茶树基因组15条染色体上的973个snps组合，973个snps较均匀地分布在茶树的15条染色体上，在第1至第15条染色体上的个数分别为94，75，62，73，67，63，70，59，69，60，47，44，64，68和58。
[0054]
s4：该973个snps组合在349个茶树中的ho值为0.355，53.04％以上ho值大于0.3。gd平均值为0.319，51.28％以上gd平均值大于0.3。较高的ho值与gd值表明这973个snp具有丰富的遗传信息量，有较好的鉴别能力，适合用于茶树品种鉴定。
[0055]
s5：使用973个snps，利用软件ntsyspc2.11对349个茶树进行遗传相似度分析，计算茶树之间的gs，计算公式见式1；
[0056]
gs＝ns/(ns+nd)
ꢀꢀ
式1；
[0057]
其中ns为相同snp基因型数量，nd为不同snp基因型数量，缺失的基因型被视为无效基因型；
[0058]
经过式1计算后在349个茶树中有11个品种/品类为疑似派生品种/品类(0.9《gs《0.97)，49个被明确为实质性派生品种/品类(gs》0.97)，在具有派生关系的品种中将品种注册日期晚的品种被认为是实质性派生品种，22个已被注册品种被鉴定为实质派生品种(见表4)。
[0059]
表4
[0060]
[0061][0062]
测试：
[0063]
1、对实施例一中s1测序获得的测序数据进行质量检测：
[0064]
测序获得829.05g高质量测序数据，平均每个样品获得2.38g数据，q20(碱基错误率在1％以下)平均占比为98％,q30(碱基错误率在0.1％以下)平均占比为93.05％；平均获得高质量序列条数5,737,108,966，有5,668,097,099的序列条数可以匹配到茶树参考基因组，5,668,097,099/5,737,108,966约为98.83％，表明通过实施例一的测序方法获得的测序数据质量较高。
[0065]
2、针对973个snps组合进行pca分析(见图1)和349个茶树的系统分类(见图2)。由图1可知，该973个snps组合可代表349个茶树的遗传多态性；由图2可知，该973个snps组合具有足够的遗传信息可100％鉴别349个茶树。
[0066]
本发明的实施例二为：
[0067]
一种检测茶树品种和实质性派生关系的快速鉴别方法：在973个snps组合的基础上，使用perl方法以所有349个样本的成对比较的可辨性为过滤条件，筛选出数量少同时可辨性高的snps位点，在该snp位点两侧的保守区域设计引物并制备指纹图谱。具体的筛选过程如下：
[0068]
s1：在973snps组合中选择最高可识别的snp作为初始数据集，将剩余snp分别添加到初始数据集，形成数个新数据集；
[0069]
s2：从新数据集中选择出第2个最高可识别的snp，并添加到初始数据集中；
[0070]
s3：重复s2，依次选择第3～n个最高可识别的snp，直至茶树分辨性为100％。
[0071]
最终选择出21个snps组合可100％鉴别所有茶树，21个snps组合的引物见表5；14个snps组合可鉴别出279个非派生品种。上述组合得到的349个茶树的指纹图谱见图3(a：21个snps组合鉴别349个茶树的指纹图谱；b。14个snps组合鉴别非派生种；xy：杂合型位点；xx；yy：纯合型位点；blank:缺失位点)。
[0072]
表5
[0073]
[0074][0075]
对表4的引物进行随机一代测序，检测得到的分型结果见图4(箭头表示可清晰分辨杂合位点)。由图4可知表4的引物可准确测出杂合位点，准确率为100％。
[0076]
综上所述，本发明提供的本发明的检测茶树品种和实质性派生关系的方法，通过s1～s4筛选得到遗传多态性好，在茶树中缺失率低的snps组合，采用该snps组合计算gs，该gs可靠性高，可用来鉴定茶树品种及其派生关系。还可进一步筛选得到数量少同时可辨性高的snps组合，在该snp位点两侧的保守区域设计引物并制备指纹图谱，可用于简单快速鉴别茶树品种及其派生关系。本发明研究是建立在首次对茶树的实质派生关系进行探索的基础上，所开发的snp位点及简易分子标记为茶树品种鉴别及实质派生制度的实施提供参考。
[0077]
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

技术特征：
1.一种检测茶树品种和实质性派生关系的方法，其特征在于，包括以下步骤：s1：收集不同的茶树品种进行全基因组gbs高通量测序；s2：将s1获得的序列进行过滤筛选，获得snps；s3：筛选在茶树基因组15条染色体上均匀分布的snps，得到snps组合；s4：验证snps组合的遗传信息量；s5：计算茶树之间的gs，鉴定派生品种。2.根据权利要求1所述的检测茶树品种和实质性派生关系的方法，其特征在于，所述s2中过滤筛选的标准为：miss rate<20％、maf>10％，位点两侧150bp范围内无其它snp。3.根据权利要求1所述的检测茶树品种和实质性派生关系的方法，其特征在于，所述s3的筛选条件为：pic>0.15,miss rate<5％，maf>15％，均匀分布在茶树基因组15条染色体上。4.根据权利要求1所述的检测茶树品种和实质性派生关系的方法，其特征在于，所述s4具体为：计算ho值和gd平均值，验证snps组合的遗传信息量。5.根据权利要求1所述的检测茶树品种和实质性派生关系的方法，其特征在于，所述s5计算后0.9<gs<0.97，该茶树品种为疑似派生品种；gs>0.97，该茶树品种为实质派生品种。6.根据权利要求1所述的检测茶树品种和实质性派生关系的方法，其特征在于，在所述snps组合中筛选出snps位点，依据snps位点制备指纹图谱。7.根据权利要求6所述的检测茶树品种和实质性派生关系的方法，其特征在于，所述筛选出snps位点的具体操作为：s1：在所述snps组合中选择最高可识别的snp作为初始数据集，将剩余snp分别添加到初始数据集，形成数个新数据集；s2：从新数据集中选择出第2个最高可识别的snp，并添加到初始数据集中；s3：重复s2，依次选择第3～n个最高可识别的snp，直至茶树分辨性为100％。

技术总结
本发明涉及茶树鉴定技术领域，具体涉及一种检测茶树品种和实质性派生关系的方法。该建立方法，包括以下步骤：先收集不同的茶树品种进行全基因组高通量测序；再将S1获得的序列进行两次过滤筛选，得到SNPs组合；验证SNPs组合的遗传信息量后，计算茶树之间的GS(遗传相似系数)，鉴定派生品种。该检测茶树品种和实质性派生关系的方法，通过S1～S4筛选得到遗传多态性好，在茶树中缺失率低的SNPs组合，采用该SNPs组合计算GS，该GS可靠性高，可作为茶树间是否存在派生关系的参考。是否存在派生关系的参考。是否存在派生关系的参考。


技术研发人员：李力 黎向汝 赵佳林 罗盛财 王飞权 李舒莹 蓝佳鸿 张艳 王柏林
受保护的技术使用者：武夷学院
技术研发日：2023.04.12
技术公布日：2023/7/12