检测麦类白粉菌的RPA引物和探针、试剂盒及检测方法

检测麦类白粉菌的rpa引物和探针、试剂盒及检测方法
技术领域
1.本发明涉及麦类白粉菌或叶片中是否存在潜伏侵染麦类白粉菌的检测引物和探针，尤其涉及检测小麦或大麦白粉菌或小麦叶片中是否存在潜伏侵染麦类白粉菌的rpa引物和探针、检测试剂盒及检测方法，属于麦类白粉菌或叶片是否存在潜伏侵染麦类白粉菌的分子检测领域。


背景技术：

2.由布氏白粉菌属小麦专化型(blumeria graminis f.sp.tritici)引起的小麦白粉病在中国发生面积广，危害大(黄冲等,2020)，是影响小麦高产稳产的重要因素(刘和邵1994,1998)。
3.小麦白粉菌越夏菌源和秋苗菌源与春季流行密切相关，但在实地调查过程中常受不利气候条件影响，病菌往往处于潜伏状态而不表现症状，无法肉眼识别，传统的叶片或幼苗取样法耗时、费力、且灵敏性较差，存在诸多限制。开展小麦叶片中潜伏侵染白粉菌的检测技术体系研究，可以提前检测田间小麦白粉病潜伏侵染情况，尤其是近年来，随着分子生物学的快速发展，pcr等技术已经广泛的运用在小麦叶片中潜伏侵染白粉菌的检测中。zeng等(2009)和zheng等(2013)先后利用巢式pcr技术和实时荧光定量pcr技术实现对该病菌潜伏阶段的早期检测。以pcr为基础的分子检测方法一定程度上弥补了病菌潜伏侵染阶段无法识别的缺陷。但pcr检测需要热循环仪在“变性-退火-延伸”多个温度间重复25-40个循环，另需凝胶电泳和成像系统(紫外仪)等昂贵的专业仪器和分子生物学试剂，且需要分子生物学专业技术人员操作，以上检测不仅对仪器设备和实验人员要求严格，并且对实验室环境要求较高，通常需将pcr实验室分成彼此间空气不流通的四个区域(试剂配制区，样品处理区，核酸扩增区，产物分析区)，检测耗费时间较长，限制了pcr检测方法在生产中的推广应用，在小麦白粉菌侵染早期的田间快速检测过程中，迫切需要一种快速简便的检测操作。
4.piepenburg等于2006年开发了重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplificarion，rpa)技术。该技术模拟了生物体内dna复制，其技术核心是依赖重组酶结合寡核苷酸引物帮助dna模板的解链和促使引物和模板之间发生链置换；单链dna结合蛋白(ssb)同置换出来的单链dna结合；dna聚合酶再利用dntp合成子代dna。由于上述三种酶及其混合物在常温下即具有活性，在30℃-42℃内任一恒温条件下均可扩增出目标产物，通过添加特异性探针并结合胶体金层析技术(lateral flow dipstic，lfd)呈现检测结果。因rpa技术反应迅速，特异性强，灵敏度高，能够在田间现场操作，已广泛用于真菌(kang et al.,2021；chen et al.,2022；liang et al.,2022；edith et al.,2022)、病毒(londono et al.2016；zhou et al.,2022)、线虫(chi et al.,2020；yao et al.,2021；shao et al.,2022)等植物病害的诊断与检测，但对于小麦白粉菌特别是小麦叶片中潜伏侵染白粉菌的rpa快速检测目前均尚未报道。
5.设计得到高特异性和灵敏度的引物和探针才可以使rpa-lfd检测方法的灵敏度和
特异度得到保证。目前，限制rpa-lfd的一个重要技术瓶颈是其引物和探针既没有明确的设计原则，也没有专业的设计软件。研究者通常需要手动设计不同的引物和探针(于灵芝.可视化核酸检测技术rpa-lfd的研究和应用进展.实验动物与比较医学.dec.2021,41(6))。探针长度以及探针相对于引物的最佳位置并没有固定的设计规则，这导致有很多种可能的组合，不仅会增加该方法中引物和探针合成及筛选的成本，而且在筛选获得高特异性和灵敏度的引物或探针具有一定的难度。


技术实现要素：

6.本发明的目的之一是提供一组检测麦类白粉菌、小麦或大麦叶片中是否潜伏侵染麦类白粉菌的rpa特异性引物和探针；
7.本发明的目的之二是提供了检测麦类白粉菌、小麦或大麦叶片中是否潜伏侵染、白粉菌的rpa-lfd检测试剂盒；
8.本发明的目的之三是提供了麦类白粉菌、小麦或大麦叶片中潜伏侵染麦类白粉菌的rpa-lfd快速检测方法。
9.本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
10.本发明的一方面是提供了一组检测麦类白粉菌、小麦或大麦叶片中是否潜伏侵染麦类白粉菌的rpa引物和探针，所述的rpa引物由一对特异性的上游引物和下游引物组成，其中，所述上游引物的核苷酸序列为seq id no.7所示，所述下游引物的核苷酸序列为seq id no.8所示，所述探针的核苷酸序列如seq id no.11所示。
11.作为本发明一种优选的具体实施方式，所述的白粉菌是是禾布氏白粉菌(blumeria graminis)，更优选的，所述禾布氏白粉菌是小麦白粉菌(blumeria graminis f.sp.tritici)或大麦白粉菌(blumeria graminis f.sp.hordei)。
12.本发明基于小麦白粉菌基因组dna上特异性序列设计出5对rpa引物并从所设计的5对rpa引物中筛选出bgtrpa-f4、bgtrpa-r4及探针bgt-probe可特异性检测到小麦白粉菌和大麦白粉菌，选择的代表性菌株分别为e09、e18、e21、e26、e31和21005-1、1523182、21023-2，对小麦其他病害(主要为叶部病害)的病原物均未能检测到，特异性强。由于小麦白粉菌(blumeria graminis f.sp.tritici)和大麦白粉菌(blumeria graminis f.sp.hordei)均为禾布氏白粉菌(blumeria graminis)，属于同种不同专化型，仅侵染各自寄主且不互相侵染，因此本发明除了可用于小麦白粉菌的田间快速检测还可为大麦白粉菌的田间快速检测提供参考。
13.作为本发明一种优选的具体实施方式，在所述下游引物的核苷酸序列的5’末端标记生物素。
14.作为本发明一种优选的具体实施方式，自5’至3’端计数，在所述探针的第32位和第33位之间连接一个脱碱基位点类似物四氢呋喃(thf)。
15.作为本发明一种优选的具体实施方式，在所述探针的5’末端标记荧光基团，更优选的，所述荧光基团是fam荧光基团；在所述探针的3’末端标记阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团，更优选的，所述阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团是c3-spacer。
16.本发明中所述的探针采用nfo探针。nfo探针位于上下游引物之间，在探针的5’末端标记荧光基团，中部标记有四氢呋喃位点，在3’末端标记扩增位阻基团。当四氢呋喃位点
两侧碱基与目标模板配对时，nfo酶被激活从而切割四氢呋喃位点，扩增位阻基团从探针上被切除，最后形成的扩增产物5’端连接荧光基团，3’端连接生物素。
17.本发明的另一方面是提供了检测麦类白粉菌、小麦或大麦叶片中是否潜伏侵染麦类白粉菌的rpa-lfd检测试剂盒，包括：a buffer，b buffer，rpa-lfd检测上、下游引物和探针，ddh2o和侧流层析胶体金试纸条；其中，所述rpa-lfd检测上游引物的核苷酸序列为seq id no.7所示，所述rpa-lfd检测下游引物的核苷酸序列为seq id no.8所示，在rpa-lfd检测下游引物的5’末端标记生物素；所述的探针的核苷酸序列为seq id no.11所示。
18.其中，在所述探针的第32位和第33位之间连接一个脱碱基位点类似物四氢呋喃(thf)。在所述探针的5’末端标记荧光基团，更优选的，所述荧光基团是fam荧光基团；在所述探针的3’末端标记阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团，更优选的，所述阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团是c3-spacer。
19.本发明利用侧流层析胶体金试纸条将检测结果可视化，所述侧流层析胶体金试纸条在结合垫上预埋抗荧光素抗体并与胶体金相连；在检测线上预埋链霉亲和素(与生物素特异性结合)；在质控线上预埋二抗，该二抗与抗荧光素抗体特异性结合。当扩增产物添加到样品孔后，向结合垫移动，到达检测线时，生物素与链霉亲和素结合使检测线显示为红色，当样品到达质控线时，与胶体金相连的坑荧光素抗体与二抗结合使质控线显示为红色，当质控线显示为红色时表示检测结果可信，没有质控线为无效结果。如果待测样品包含小麦或大麦白粉菌样品，在试纸条上同时出现质控线和特异性检测线双条带，反之，则仅出现质控线。
20.本发明的再一方面是提供了麦类白粉菌、小麦或大麦叶片中潜伏侵染麦类白粉菌的rpa-lfd快速检测方法，包括：
21.(1)提取待测样品的dna；
22.(2)以提取的dna为扩增模板，采用核苷酸序列为seq id no.7和8所示的rpa上、下游引物和核苷酸序列为seq id no.11所示的探针建立扩增体系进行pcr扩增；
23.(3)将扩增反应的产物用ddh2o稀释，取稀释后的产物添加到侧流层析胶体金试纸条的样品孔；当检测线与质控线均显示红色时，表明待检测样品中含有麦类白粉菌或者叶片中潜伏侵染麦类白粉菌；当检测线不显示红色，质控线显示红色时，表明待检测样品中不含有麦类白粉菌或者叶片中没有潜伏侵染麦类白粉菌；当质控线不显示红色时为无效检测结果。
24.作为一种优选的具体实施方式，步骤(2)中所建立的扩增体系包括：a buffer 29.4μl，b buffer2.5μl，(购于安普未来(常州)生物科技有限公司，编号:wln8203kit)rpa上、下游引物各2μl，探针0.6μl，dna模板2μl，dd h2o 11.5μl；总计50μl。
25.作为一种优选的具体实施方式，步骤(2)中所述的pcr扩增的反应条件为：扩增温度为30-50℃，优选为40-50℃，最优选为40℃；扩增时间为5-40min，优选为20-40min，最优选为30min。
26.本发明利用rpa快速检测技术，基于小麦白粉菌基因组dna上的特异性序列设计出5对rpa引物从中筛选出特异性引物bgtrpa-f4、bgtrpa-r4及探针bgt-probe，能够从不同病原菌或者叶片中特异性检测出小麦或大麦白粉菌或叶片中是否潜伏侵染小麦白粉菌。本发明进一步利用设计所筛选出的特异性引物和探针结合侧流层析胶体金试纸条建立了麦类
白粉菌的rpa-lfd检测方法，实现小麦或大麦白粉菌潜伏侵染阶段的早期可视化快速检测，利用该检测方法成功用于田间小麦叶片中潜伏侵染白粉菌的检测，实现对田间潜伏侵染的病叶率进行定量估测，可以特异性检测未显症小麦或大麦叶片中是否存在目标病原菌，并且操作便捷，检测速度快，结果能够通过肉眼直接判读，适用于田间现场检测工作的进行。灵敏度结果显示所建立的rpa-lfd检测方法的检测阈值为1fg小麦白粉菌基因组dna，灵敏度是普通pcr检测的104倍，是实时荧光定量pcr检测的100倍。在检测体系中存在大量小麦或大麦叶片基因组dna的情况下，不影响检测效果；结合侧向流层析试纸条，整个检测过程可以在1小时内完成。
27.综上，本发明所建立的麦类白粉菌的rpa-lfd检测方法是一种简单、快速、特异、灵敏度高和直观的方法，可以适用在田间快速检测小麦或大麦叶片中是否存在潜伏侵染麦类白粉菌，并可实现对田间潜伏侵染的病叶率进行定量估测，为该病害的预测预报提供依据。
附图说明
28.图1为本发明rpa扩增技术的正向引物和反向引物的筛选结果；bgtrpa-f1/r1、bgtrpa-f2/r2、bgtrpa-f3/r3、bgtrpa-f4/r4和bgtrpa-f5/r5这5对候选引物分别对100ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、10-1
ng/μl、10-2
ng/μl 5种不同浓度梯度的小麦白粉菌e09菌株提取的dna和水(ntc)做常规pcr扩增。
29.图2为本发明不同引物组合下的rpa-lfd可视化结果图，编号1-5分别为bgtrpa-f1/r1、bgtrpa-f2/r2、bgtrpa-f3/r3、bgtrpa-f4/r4和bgtrpa-f5/r5这五对引物分别与bgt-probe进行组合的rpa-lfd可视化结果图。
30.图3为本发明rpa-lfd检测方法的温度和反应时间体系优化结果；a:小麦白粉菌rpa温度优化筛选结果(20-65℃)；b:小麦白粉菌rpa反应时间优化筛选结果(5-40min)。
31.图4为本发明rpa-lfd检测方法的特异性检测结果图；a:小麦白粉菌特异性检测侧流层析胶体金试纸条结果图；b:小麦白粉菌特异性检测电泳结果图；c:小麦叶片dna的特异性检测侧流层析胶体金试纸条结果图；d:小麦叶片dna的特异性检测电泳结果图。
32.图5为采用不同的检测方法针对小麦白粉菌不同浓度梯度gdna的灵敏度检测结果；a:rpa-lfd灵敏度检测结果；b:普通pcr灵敏度检测结果；c:实时荧光定量pcr灵敏度检测结果。
33.图6为本发明rpa-lfd检测方法针对小麦白粉菌不同浓度梯度gdna在有小麦叶片gdna存在下rpa-lfd灵敏度的检测结果。
34.图7为室内小麦白粉菌不同接种梯度下潜伏侵染阶段采用本发明的rpa-lfd检测方法进行检测的灵敏度检测结果；a:接菌后12h；b:接菌后24h。
35.图8为两省四地自然发病田块小麦白粉菌潜伏侵染阶段采用本发明的rpa-lfd检测方法的检测结果；1-5：河南灵宝；6-10：陕西长武；11-15：陕西眉县；16-20：河南巩义。
36.图9为基于本发明建立的rpa-lfd检测方法实现田间潜伏侵染病叶率定量估测的操作流程。
具体实施方式
37.以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而
更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
38.以下实施例中所述试剂均为市售；所用小麦白粉菌菌株本发明人实验室均有保存，本发明人可以向有进行相关科学实验需要的社会公众免费提供。
39.主要试剂：ctab提取液、核酸抽提液(25:24:1)购自北京库来博科技有限公司；rnase a、proteinase k购自北京索莱宝科技有限公司；dna marker、普通pcr扩增taq酶、核酸染料购自北京全式金生物技术有限公司；实时荧光定量pcr预混液(染料法)购自赛默飞世尔科技公司；引物、探针均由上海生工生物技术有限公司合成；胶体金试条型dna恒温快速扩增试剂盒购自安普未来(常州)生物科技有限公司；侧流层析胶体金试纸条购自杭州优思达生物技术有限公司。
40.本发明共收集并使用了包括小麦主要叶部病害病原菌以及大麦白粉菌blumeria graminis f.sp.hordei(小麦白粉菌的同种不同专化型)和稻瘟病菌pyricularia oryzae(稻瘟菌的小麦致病型侵染小麦引起麦瘟病，两者基因组dna序列整体一致性超过99％)，所用病原菌及其所致病害名称、小种或菌株(系)代号和来源见表1。
41.表1供试菌株名称、代号和来源
42.[0043][0044]
本发明所选用小麦品种见表2，均由本发明人实验室保存提供。
[0045]
表2供试小麦品种及编号
[0046]
[0047][0048]
实施例1小麦白粉菌病原菌及小麦叶片dna的提取
[0049]
利用ctab法提取小麦叶片、小麦白粉菌以及其他对照病菌样品(亚洲镰孢菌、禾谷镰孢菌、假禾谷镰孢菌、麦根腐平脐蠕孢菌、水稻稻瘟菌、小麦叶锈菌、小麦条锈菌、大麦白粉菌作为对照)的基因dna，所得基因组dna用nano drop nd-2000分光光度计对dna浓度进行量化，并用2％琼脂糖泳凝胶电泳检测所提dna完整性，-80℃保存。
[0050]
实施例2小麦白粉菌rpa-lfd检测方法的建立
[0051]
依据dna恒温快速扩增试剂盒说明书来设计rpa引物和探针。
[0052]
根据小麦白粉菌(bgt)基因组的特异性its序列(genebank:ab022377.1)，结合rpa引物设计特点，特异性扩增子长度为100bp-300bp，引物长度建议30-35bp，且不低于25bp的原则，设计5组引物对(表3)。筛选引物对，用ncbi分析产物序列，并选择与下游引物同源性低的片段设计探针。
[0053]
表3 rpa和常规pcr引物
[0054][0055]
采用上述设计的5组引物对进行常规pcr反应并进行琼脂糖凝胶电泳检测。
[0056]
常规pcr扩增小麦白粉菌的20μl反应体系包括：10μl 2
×
taq pcr starmix(dye)(购于北京康润诚业生物科技有限公司，编号:a012-100)；正反引物(10μm)各0.6μl；模板1μl；ddh2o 7.8μl。
[0057]
常规pcr反应程序:94℃预变性3min；94℃变性1min，62℃退火30sec，72℃延伸30sec。30个循环；72℃延伸7min；4℃保存。pcr产物在用gelstain荧光核酸凝胶染料(购自北京全式金生物技术股份有限公司，编号:gs101-01)染色的1.5％琼脂糖凝胶上分离，然后使用champgel
tm 6000全自动凝胶成像分析系统(购自北京赛智创业科技有限公司)拍照。
[0058]
5组引物对常规pcr反应的电泳检测结果如图1所示(图中，bgtrpa-f1/r1、bgtrpa-f2/r2、bgtrpa-f3/r3、bgtrpa-f4/r4和bgtrpa-f5/r5这5对候选引物分别对100ng/μl、
10ng/μl、1ng/μl、10-1
ng/μl、10-2
ng/μl 5种不同浓度梯度的小麦白粉菌e09菌株提取的dna和水(ntc)做常规pcr扩增；m：marker-2000)，电泳检测结果表明5对候选引物虽均能够扩增目的条带(片段大小分别为265bp、221bp、219bp、205bp和226bp)，但扩增效率存在明显差异：
[0059]
引物对bgtrpa-f4/r4在100ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、10-1
ng/μl、10-2
ng/μl这5种浓度下均能获得清晰明亮的电泳条带，而在利用引物对bgtrpa-f2/r2和bgtrpa-f3/r3扩增低浓度模板时电泳条带较弱，证明利用该两种引物扩增得到的产物量较低；此外，bgtrpa-f2/r2、bgtrpa-f3/r3、bgtrpa-f1/r1和bgtrpa-f5/r5这四对引物在扩增时均产生大量的引物二聚体，可证明该四对引物的扩增效率要明显低于bgtrpa-f4/r4。考虑到rpa-lfd反应的灵敏性高度依赖所设计引物的扩增效率，而本发明用于田间小麦白粉菌潜伏侵染叶片检测时高度依赖于检测的灵敏性，因此对上述候选引物进行筛选是有必要的；筛选结果表明，引物对bgtrpa-f4/f4作为rpa反应的上下游引物为最优。
[0060]
进一步地，将bgtrpa下游引物的5’端标记一个修饰基因(生物素biotin)。荧光探针设计：选取扩增产物与下游引物序列同源性低的片段设计探针，在上下游引物中间，设计一段长度为48bp且与目的片段互补的序列；5’末端标记fam荧光基团，该序列自5’端到3’端的第32位和第33位之间连接一个脱碱基位点类似物四氢呋喃dspacer(thf)，用于nfo(核酸内切酶ⅳ)的识别；3’末端标记阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团c3-spacer，本发明针对rpa反应所用引物对和探针信息见表4。
[0061]
表4为针对rpa反应设计的引物和探针
[0062][0063]
利用表4的特异性rpa引物和探针以及dna恒温快速扩增试剂盒(购于安普未来(常州)生物科技有限公司，编号:wln8203kit)，扩增小麦白粉菌(bgt)特异性基因组片段(seq id no.12)。
[0064]
rpa的反应体系为：a buffer 29.4μl，上下游引物bgtrpa-f4/bgtrpa-r4(10μm/l)各2μl，bgt-probe(探针)0.6μl(10μm)，dna模板2μl，ddh2o 11.5μl，b buffer 2.5μl，共50μl。扩增反应条件为：40℃恒温反应20min，4℃保存。
[0065]
反应结束后，将10μl扩增产物于190μl ddh2o中稀释，并使用侧流层析胶体金试纸
条(购于杭州优思达生物技术有限公司，编号:d003-03)检测扩增产物，2-5min后进行视觉观察，若试纸条同时呈现质控线和检测线，则待测样品为小麦白粉菌或包含小麦白粉菌(bgt)；若试纸条仅呈现质控线而不呈现检测线，则待测样品不为小麦白粉菌或不包含小麦白粉菌。
[0066]
试验例1 5对rpa引物进行小麦白粉菌rpa-lfd可视化检测的性能比较试验
[0067]
为进一步验证bgtrpa-f4/f4作为rpa反应中的上下游引物并结合胶体金试纸条技术进行可视化检测是最优的，分别利用bgtrpa-f1/r1、bgtrpa-f2/r2、bgtrpa-f3/r3、bgtrpa-f4/r4和bgtrpa-f5/r5这5对候选引物，且下游引物的5’端均分别标记一个修饰基因(生物素biotin)，并结合所设计的探针bgt-probe进行rpa-lfd可视化检测的性能比较。以较低的bgt gdna浓度(10-2
ng/μl)分别进行反应(扩增体系反应条件同实施例2)。
[0068]
图2为本发明不同rpa引物组合下的rpa-lfd可视化结果图，从图2中可直观看出，在小麦白粉菌dna含量较低时，利用bgtrpa-f4/r4引物对及bgt-probe探针进行的rpa反应结合试纸条检测能获得更明显的阳性检测线条带，检测性能最佳，这对进一步将该引物组合用于检测叶片中潜伏侵染的小麦白粉菌是必须的，而其他引物组合无法在同等条件下达到检测需求和目的。
[0069]
试验例2 rpa-lfd检测体系的优化试验
[0070]
在实施例2的基础上，为了进一步确定最佳反应温度，以小麦白粉菌(bgt)基因组dna(100ng/ul)为模板，分别在8个不同的反应温度(20、25、30、35、40、45、50和65℃)下进行rpa扩增；此外，在40℃下进行了7个不同时间(5、10、15、20、25、30和40min)的rpa扩增反应。
[0071]
rpa扩增结果如图3所示，rpa-lfd检测可以在30℃至50℃的宽温度范围内同时观察到质控线和检测线；并且检测线条带亮度在30℃至40℃之间逐渐增强；而在40℃和50℃之间，条带的亮度没有明显增强；当反应温度为65℃时仅呈现质控线，说明具有常温或低温活性的重组酶、聚合酶和单链结合蛋白(rpa反应的关键酶或蛋白)在较高温度下丧失活性(图3a)，故检测线最佳反应温度为40-50℃。此外，在40℃下进行了7次不同时间的rpa反应，结果显示，当反应时间为5至40分钟时，检测线都可以看到条带(图3b)；在反应时间为5-20分钟时，检测线条带强度逐渐加强；而反应进行20-40分钟所得检测线条带强度无明显变化，均为强阳性条带，故检测线最佳反应时间为20至40分钟。
[0072]
试验例3采用建立的rpa-lfd检测方法对小麦白粉菌的特异性检测试验
[0073]
选取采集自田间并经申请人实验室分离纯化后的小麦白粉菌菌株e09、e18、e21、e26和e31，将亚洲镰孢菌、禾谷镰孢菌、假禾谷镰孢菌、麦根腐平脐蠕孢菌、水稻稻瘟菌、小麦叶锈菌、小麦条锈菌、大麦白粉菌作为对照菌样(表1)，所有供试菌以及供试10个小麦品种(表2)，分别提取各病原菌基因组dna和小麦叶片基因组dna，dna浓度全部稀释为100ng/ul后进行常规pcr扩增和rpa反应，并分别通过电泳检测及侧流层析胶体金试纸条检测其特异性，采用bgtrpa-f4/r4引物对及bgt-probe探针进行扩增。在无模板对照(ntc)反应中使用灭菌ddh2o。
[0074]
特异性检测结果如图4所示(图4a和b：禾谷镰孢菌fg、亚洲镰孢菌fa、假禾谷镰孢菌fpg、麦根腐平脐孺孢菌bs、水稻稻瘟菌po、小麦条锈菌pst、小麦叶锈菌pt、小麦白粉菌bgt和大麦白粉菌bgh；图4c和d：10个小麦品种和阳性对照小麦白粉菌e09菌株；m：m:marker-2000)，在侧流层析胶体金试纸条检测中仅在含有小麦白粉菌gdna的rpa扩增反应
中，观察到包括检测线和质控线的双条带，而在其他非目标小麦病原菌、小麦叶片和无模板对照(灭菌ddh2o)中则没有检测线，只呈现质控线条带(图4a和c)。此外，以bgtrpa-f4/r4引物对进行的常规pcr检测(反应体系及程序同实施例2)，琼脂糖凝胶电泳结果表明(图4b和d)，小麦白粉菌能特异性扩增到205bp的目的产物，其他小麦病原菌及小麦叶片均未发生扩增。由此说明，该引物对bgtrpa-f4/r4对小麦白粉菌具有较高的特异性。
[0075]
由于小麦白粉菌(blumeria graminis f.sp.tritici)和大麦白粉菌(blumeria graminis f.sp.hordei)均为禾布氏白粉菌(blumeria graminis)，属于同种不同专化型，在含有大麦白粉菌gdna的rpa扩增反应和常规pcr反应中，分别利用侧流层析试纸条和凝胶电泳进行检测，结果显示，能够同时呈现检测线和质控线双条带(图4a)以及扩增出205bp的目的产物(图4b)。但小麦白粉菌和大麦白粉菌仅侵染各自寄主(小麦、大麦)且不互相侵染，故该引物bgtrpa-f4/r4对大麦白粉菌也具有特异性。
[0076]
试验例4本发明建立的rpa-lfd检测方法对小麦白粉菌灵敏度检测试验
[0077]
为了确定本发明建立的rpa-lfd检测方法的灵敏度，提取小麦白粉菌e09菌株gdna，10倍梯度连续稀释后得到浓度分别为100ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、100fg/μl和10fg/μl、1fg/μl、100ag/μl，分别以其为dna模板进行rpa-lfd检测(参照试验例1中最适反应温度和时间分别为40℃、20min，采用bgtrpa-f4/r4引物对及bgt-probe探针进行rpa-lfd扩增)、常规pcr检测和实时荧光定量pcr检测(引物、反应体系及反应程序参照：曾晓葳，2009和郑亚明，2010)，并对比检测结果。
[0078]
灵敏度检测结果如图5所示，当使用本发明建立的rpa-lfd检测方法进行检测时，小麦白粉菌dna浓度在100ng-1fg/μl之间均在检测线上观察到了阳性条带(图5a)，而浓度100ag/μl和无模板对照试纸条仅呈现质控线，表明本发明建立的rpa-lfd检测方法最低可检测到1fg/μl的小麦白粉菌dna。用同浓度的小麦白粉菌gdna进行常规pcr检测和实时荧光定量pcr检测，结果表明，常规pcr检测到dna的浓度下限为10pg/μl(图5b)，实时荧光定量pcr的检测下限为100fg/μl(图5c)。综上可见，本发明建立的rpa-lfd检测方法比常规pcr的灵敏度高104倍，比实时荧光定量pcr高100倍，表明本发明建立的rpa-lfd检测方法对小麦白粉菌具有较高灵敏度。
[0079]
试验例5小麦基因组dna对rpa-lfd检测白粉菌的影响试验
[0080]
在10倍连续稀释的小麦白粉菌gdna(浓度分别为10ng/μl、1ng/μl、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、100fg/μl和10fg/μl)中分别加入100ng小麦gdna，将加入小麦gdna的白粉菌dna与未加小麦gdna的白粉菌dna同时按试验例3所述进行rpa-lfd检测。
[0081]
结果显示，在10ng/μl-10fg/μl的小麦白粉菌dna中加入大量的小麦gdna不会对检测结果产生影响，含与未含有小麦gdna的检测结果均同时呈现检测线和质控线双条带(图6)。此外，当小麦白粉菌dna浓度为100fg/μl和10fg/μl时，含与未含有小麦gdna的检测结果相比，检测线的阳性条带稍浅，但仍不影响对结果的准确判读。
[0082]
试验例6应用本发明建立的rpa-lfd检测方法快速检测早期潜伏侵染的小麦白粉菌
[0083]
分别以不同浓度定量接种室内小麦盆栽苗：将称取好的不同质量的小麦白粉菌孢子粉于5ml电子氟化液(购自深圳市派旗纳米技术有限公司，编号:fc110)中制成孢子悬浮液，浓度梯度由高到低依次为(40mg/μl、32mg/μl、16mg/μl、8mg/μl、4mg/μl和0mg/μl)，不同
接种梯度下的各5ml孢子悬浮液全部均匀喷布在每盆(含100株)小麦幼苗上，无菌对照处理仅喷布5ml的电子氟化液。以接种后12h、24h、48h、72h和96h进行取样，每个接种梯度随机采集3份叶片，并以其作为rpa反应模板进行扩增(采用bgtrpa-f4/r4引物对及bgt-probe探针进行rpa-lfd扩增)并进行侧流层析试纸条检测。无菌ddh2o作为无模板阴性对照。
[0084]
根据检测结果可见，不同接种梯度均在接种12h后能够通过rpa-lfd检测到小麦叶片中潜伏侵染的白粉菌，且随着接种量的增加，检测线上的阳性条带逐渐增强(图7a)。当接种时间达24h时，所有接种量下的小麦叶片均可通过rpa-lfd检测到强阳的检测线条带且条带亮暗无明显差异(图7b)。检测结果表明，本发明所建立的rpa-lfd检测方法对小麦叶片中潜伏侵染的白粉菌同样具备较高的灵敏性，能够对其进行早期检测。
[0085]
试验例7采用本发明建立的rpa-lfd检测方法在田间潜伏侵染小麦白粉菌检测中的试验
[0086]
在河南和陕西距离小麦白粉菌越夏区附近共采集了20份田间白粉菌潜伏侵染的小麦叶片，提取基因组dna如实施例1所述，利用本发明建立的rpa-lfd检测方法(参照试验例1中最适反应温度和时间分别为40℃、20min，采用bgtrpa-f4/r4引物对及bgt-probe探针进行rpa-lfd扩增)以及实时荧光定量pcr检测(zheng et al.,2013)技术检测是否有白粉菌发生。
[0087]
应用本发明已建立的rpa-lfd检测方法对采自河南和陕西2省4个地区的20份小麦叶片进行检测，检测结果如图8及表5所示，结果显示所有叶片均检测到了小麦白粉菌，且rpa-lfd检测结果与实时荧光定量检测结果100％吻合。表明本发明所建立的rpa-lfd检测方法能够用于潜伏侵染阶段小麦白粉菌的田间检测。
[0088]
此外，同一地区所采集的5份样品，利用实时荧光定量pcr技术获得的分子病情指数(白粉菌dna/小麦dna；参见zheng et al.,2013)与本发明建立的rpa-lfd可视化结果相吻合，分子病情指数较高的潜伏侵染病叶其基于侧流层析试纸条获得的阳性检测条带也较亮，而分子病情指数较低的病叶其rpa-lfd的检测条带相对较弱。故在应用本发明rpa-lfd检测方法检测田间潜伏侵染小麦白粉菌时，还可通过阳性的检测条带强弱，获得一定的半定量信息。
[0089]
表5 rpa-lfd在田间潜伏侵染小麦白粉菌检测中的应用
[0090][0091]
注：“+”表示阳性；
“‑”
表示阴性。
[0092]
试验例8应用建立的rpa-lfd检测方法进行田间潜伏侵染病叶率的定量估测试验
[0093]
应用本发明已建立的rpa-lfd检测方法(采用bgtrpa-f4/r4引物对及bgt-probe探针进行rpa-lfd扩增)对田间采集的小麦叶片样本进行检测，整个操作流程如图9所示：将获得的整张叶片的全部基因组dna用于rpa反应，20min后将扩增产物进行稀释，并结合侧流层析试纸条进行可视化判读，如果小麦叶片中存在潜伏侵染的白粉菌，则试纸条同时出现检测线和质控线两条条带，通过计算检测阳性的小麦叶片数与采集的小麦叶片总数之比即可实现对田间潜伏侵染的病叶率进行定量估测，为此病害的预测预报提供依据。

技术特征：
1.一组检测麦类白粉菌或叶片中是否存在潜伏侵染麦类白粉菌的rpa引物和探针，所述的rpa引物由一对特异性的上游引物和下游引物组成，其特征在于，所述上游引物的核苷酸序列为seq id no.7所示，所述下游引物的核苷酸序列为seq id no.8所示，所述探针的核苷酸序列为seq id no.11所示。2.根据权利要求1所述的rpa引物和探针，其特征在于，所述的麦类白粉菌是禾布氏白粉菌(blumeria graminis)，优选的，所述禾布氏白粉菌是小麦白粉菌(blumeria graminis f.sp.tritici)或大麦白粉菌(blumeria graminis f.sp.hordei)。3.根据权利要求1所述的rpa引物和探针，其特征在于，所述下游引物的核苷酸序列的5’末端标记有生物素。4.根据权利要求1所述的rpa引物和探针，其特征在于，自5’至3’端计数，在所述探针的第32位和第33位之间连接一个脱碱基位点类似物四氢呋喃。5.根据权利要求1所述的rpa引物和探针，其特征在于，在所述探针的5’末端标记荧光基团，优选的，所述荧光基团是fam荧光基团；在所述探针的3’末端标记阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团，优选的，所述阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团是c3-spacer。6.权利要求1-5任何一项所述的rpa引物和探针在检测麦类白粉菌或叶片中是否存在潜伏侵染麦类白粉菌中的应用；优选的，所述的麦类白粉菌是禾布氏白粉菌(blumeria graminis)，优选的，所述禾布氏白粉菌是小麦白粉菌(blumeria graminis f.sp.tritici)或大麦白粉菌(blumeria graminis f.sp.hordei)。7.检测麦类白粉菌或叶片中是否存在潜伏侵染麦类白粉菌的rpa-lfd检测试剂盒，包括：a buffer，b buffer，rpa-lfd检测上、下游引物和探针，ddh2o和侧流层析胶体金试纸条；其特征在于，所述rpa-lfd检测上游引物的核苷酸序列为seq id no.7所示，所述rpa-lfd检测下游引物的核苷酸序列为seq id no.8所示；所述的探针的核苷酸序列为seq id no.11所示。8.根据权利要求7所述的rpa-lfd检测试剂盒，其特征在于，在所述rpa-lfd检测下游引物的5’末端标记生物素；在所述探针的第32位和第33位之间连接一个脱碱基位点类似物四氢呋喃；在所述探针的5’末端标记荧光基团，优选的，所述荧光基团是fam荧光基团；在所述探针的3’末端标记阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团，优选的，所述阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团是c3-spacer；优选的，所述的麦类白粉菌是禾布氏白粉菌(blumeria graminis)，更优选的，所述禾布氏白粉菌是小麦白粉菌(blumeria graminis f.sp.tritici)或大麦白粉菌(blumeria graminis f.sp.hordei)。9.一种麦类白粉菌或者叶片中是否存在潜伏侵染麦类白粉菌的rpa-lfd检测方法，其特征在于，包括：(1)提取待测样品的dna；(2)以提取的dna为扩增模板，采用核苷酸序列为seq id no.7和8所示的rpa上、下游引物和核苷酸序列为seq id no.11所示的探针建立扩增体系进行pcr扩增；(3)将扩增反应的产物用ddh2o稀释，取稀释后的产物添加到侧流层析胶体金试纸条的样品孔；当检测线与质控线均显示红色时，表明待检测样品中含有麦类白粉菌或者叶片中存在潜伏侵染麦类白粉菌；当检测线不显示红色，质控线显示红色时，表明待检测样品中不含有麦类白粉菌或者叶片中没有潜伏侵染的麦类白粉菌；当质控线不显示红色时为无效检
测结果。10.根据权利要求9所述的rpa-lfd检测方法，其特征在于，所述的麦类白粉菌是禾布氏白粉菌(blumeria graminis)，优选的，所述禾布氏白粉菌是小麦白粉菌(blumeria graminis f.sp.tritici)或大麦白粉菌(blumeria graminis f.sp.hordei)；步骤(2)中所建立的扩增体系包括：a buffer 29.4μl，b buffer 2.5μl，rpa上、下游引物各2μl，探针0.6μl，dna模板2μl，dd h2o 11.5μl；总计50μl；步骤(2)中所述的pcr扩增的反应条件为：扩增温度为30-50℃，优选为40-50℃，最优选为40℃；扩增时间为5-40min，优选为20-40min，最优选为30min。

技术总结
本发明公开了检测麦类白粉菌的RPA引物和探针、试剂盒及检测方法。本发明基于小麦白粉菌基因组DNA上特异性序列设计出5对RPA引物从中筛选出从不同病原菌或者叶片中是否存在潜伏侵染麦类白粉菌的特异性引物及探针，结合侧流层析胶体金试纸条建立了麦类白粉菌的RPA-LFD检测方法，成功用于田间小麦或大麦叶片中是否存在潜伏侵染麦类白粉菌的可视化检测，其检测灵敏度分别是普通PCR检测和实时荧光定量PCR检测的104倍和100倍；操作便捷，检测速度快，适用于在田间快速检测小麦或大麦叶片中是否存在潜伏侵染的麦类白粉菌，实现对田间潜伏侵染的病叶率进行定量估测并为麦类白粉菌病害的预测预报提供依据。害的预测预报提供依据。害的预测预报提供依据。


技术研发人员：刘伟 王奥霖 范洁茹 周益林 胡小平
受保护的技术使用者：中国农业科学院植物保护研究所
技术研发日：2023.03.09
技术公布日：2023/7/12