用于选择性扩增MYD88基因L265P突变型的组合物、试剂和应用的制作方法

用于选择性扩增myd88基因l265p突变型的组合物、试剂和应用
技术领域
1.本发明涉及基因突变检测技术领域，尤其是涉及用于选择性扩增myd88基因l265p突变型的组合物、试剂和应用。


背景技术：

2.原发性玻璃体视网膜淋巴瘤(primary vitreoretinal lymphoma,pvrl)是一种罕见的眼内恶性淋巴瘤。pvrl可导致视力丧失，且预后效果不佳，目前总生存时间为诊断后3年。pvrl的临床表现包括视力模糊、视力下降、红眼和飞蚊症的出现，这些症状并不是vrl特有的，其他眼病中也有这类症状，例如葡萄膜炎，因此pvrl的病理诊断存在一定的难度，临床上pvrl常被误诊为葡萄膜炎，与葡萄膜炎鉴别较为困难，容易导致延迟确诊。目前，临床上诊断依赖于眼内(玻璃体)液体活检，细胞学技术是目前临床上主要的鉴定手段，但由于眼部组织的细胞数量有限，常导致诊断结果假阴性率较高，并且鉴定结果高度依赖于病理医生的经验与水平。
3.近年来，已有不少研究证实了myd88与vrl存在一定的相关性，作为vrl的分子标志物能够辅助医生对患者进行早期的筛查诊断。有文献报道，66％～88％的pvrl病例中存在髓样分化初级反应基因88(myd88)的致癌突变，该突变将氨基酸位置265位的亮氨酸突变为脯氨酸。其中，ngo等人首次发现myd88编码序列的794位碱基的l265p突变，导致myd88蛋白编码区第265位的亮氨酸错义突变为脯氨酸，异常激活il-1r介导的nf-κb、mapk和jak-stat3信号通路，导致肿瘤的发生。且myd88 l265p是一种致癌突变，在非肿瘤性增殖中不存在，因此可通过检测该位点的突变情况初步判别vrl。
4.数字pcr(digital pcr)是一种新型的dna分子定量检测技术，无需标准物质即可直接测量样品中dna靶分子拷贝数。目前的数字pcr技术基于芯片式(chipdigital pcr,cd pcr)和微滴式(dropletdigit-alpcr,dd pcr)两种平台。微滴数字化pcr(dd pcr)可通过微滴发生器对pcr反应体系进行微滴化处理，将dna样本随机分装进数万个独立的纳升级油包水液滴，每个微滴都是独立的pcr微反应器；乳液pcr反应结束后，使用微滴检测器逐一检测每个微滴的荧光信号，根据荧光信号的强弱，将微滴分为阳性微滴和阴性微滴，阴性微滴不含靶标dna分子，阳性微滴中含有至少1个拷贝的靶标dna分子。阳性微滴的数量跟靶标dna含量正相关，两者的关系符合泊松分布，即：p＝1-e(-λ)。其中p为阳性微滴的比例，e为自然常数，λ为平均每个微滴中的靶标dna拷贝数。计算软件根据阳性微滴的比例自动计算出目标dna分子的拷贝数浓度(copies/μl)。dd pcr已被广泛运用到科学研究及临床应用，如突变检测，拷贝数变异分析以及特定核酸种类的量化。dd pcr有助于肿瘤潜在基因突变的识别，尤其是具有细胞异质性的临床样品；还可用于分析体细胞突变的等位基因分数(allelic fraction)，判断等位基因是否具有差异表达。
5.但常规的扩增反应过程中，野生型的干扰，会影响检测结果的灵敏度和特异性，鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于，提供选择性扩增myd88基因l265p突变型的组合物、试剂或试剂盒，其中包含使用肽核酸修饰的阻断探针，期望将该组合物、试剂或试剂盒用于对含有myd88基因l265p突变型的样本进行pcr扩增，以期提高靶标的检出灵敏度及特异性。
7.为了解决上述技术问题，实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
8.第一方面，本发明提供了用于选择性扩增myd88基因l265p突变型的组合物，所述组合物包括引物对1和阻断探针，所述阻断探针靶向myd88基因的核酸片段覆盖编码第265位氨基酸的cds片段，所述引物对1包括靶向阻断探针上游的正向引物和靶向阻断探针下游的反向引物；所述阻断探针为肽核酸修饰探针。
9.在可选的实施方式中，所述阻断探针靶向myd88基因的片段范围包括编码第265位氨基酸的密码子的上游至少3个核苷酸和/或下游至少3个核苷酸，所述阻断探针的核苷酸长度为13～20bps。
10.优选地，所述阻断探针靶向myd88基因的片段范围包括编码第265位氨基酸的密码子的上游至少7个核苷酸和/或下游至少6个核苷酸，所述阻断探针的核苷酸长度为14bps。
11.优选地，所述阻断探针的核苷酸序列如seq id no:1(aagcgactgatccc)所示，其中加粗并下划线标记的碱基为突变位点。
12.在可选的实施方式中，所述引物对1的正向引物的核苷酸序列如seq id no:2(ggcctgatgccagcatg)所示，所述引物对1的反向引物的核苷酸序列如seq id no:3(tcttcattgccttgtactt)所示。
13.在可选的实施方式中，所述组合物还包括用于定性或定量检出myd88基因l265p突变型扩增结果的检测探针1。
14.优选地，所述检测探针1连有荧光基团，或者，所述检测探针1连有荧光基团和淬灭基团。
15.优选地，所述荧光基团选自fam、vic、rox或cy5。
16.优选地，所述淬灭基团选自mgb、bhq1、bhq2或bhq3。
17.优选地，所述检测探针1的核苷酸序列如seq id no:4(aagcgaccgatcc)所示。
18.第二方面，本发明提供了前述实施方式任一项所述的组合物在myd88基因l265p突变型选择性扩增或在myd88基因l265p突变型检测中的应用。
19.第三方面，本发明提供了用于选择性扩增myd88基因l265p突变型的试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒包括前述实施方式任一项所述的组合物，和用于检测内参基因的引物对2和检测探针2；所述内参基因包括rnase p基因。
20.在可选的实施方式中，所述引物对2的正向引物的核苷酸序列如seq id no:5(ggcggtgtttgcagatttgg)所示，所述引物对2的反向引物的核苷酸序列如seq id no:6(ctgtctccacaagtccgc)所示，所述检测探针2的核苷酸序列如seq id no:7(agcgggttctgacct)所示。
21.优选地，所述检测探针2连有荧光基团，或者，所述检测探针2连有荧光基团和淬灭基团，且所述检测探针2的荧光基团和检测探针1的荧光基团不同。
22.优选地，所述荧光基团选自fam、vic、rox或cy5。
23.优选地，所述淬灭基团选自mgb、bhq1、bhq2或bhq3。
24.第四方面，本发明提供了选择性扩增myd88基因l265p突变型的方法，将待测样本和前述实施方式任一项所述的试剂加入pcr扩增体系中，经扩增得到富含myd88基因l265p突变型的扩增产物。
25.在可选的实施方式中，所述pcr包括数字pcr或荧光定量pcr。
26.在可选的实施方式中，所述pcr的扩增程序为：95℃下预变性10min，循环1次；95℃下变性30s，72℃下pna结合30s，58℃下退火延伸1min，循环45次。
27.本发明提供的组合物含有pna修饰的特异性靶向野生型的阻断探针，能够用于选择性扩增myd88基因l265p突变型，尤其是利用超灵敏的dd pcr技术，从而实现突变位点的高灵敏检测。本发明中涉及的pna(peptide nucleic acid)，又称肽核酸，pna是一种合成核酸类似物，它是由肽链酰胺2-氨基乙基甘氨酸键取代了dna中的戊糖磷酸二酯键骨架，稳定性远高于dna。pna不带有负电荷，因此与核酸结合的稳定性和特异性都很高。pna不能作为引物被dna polymerase识别并扩增，可以通过watson-crick碱基配对的形式识别并结合dna或rna序列，形成稳定的双螺旋结构。与dna/dna的结合相比，在不存在错配的情况下，pna/dna的结合稳定性更强；在存在错配的情况下，pna/dna的结合稳定性则很差。除此之外，本发明还对dd pcr扩增程序进行优化，有利于减少数字pcr“离散点”问题。
附图说明
28.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
29.图1为本发明实施例1的扩增结果对比；
30.图2为本发明实施例2中不同循环次数扩增对比；
31.图3为本发明实施例3中灵敏度评价结果；
32.图4为本发明实施例3中特异性评价结果。
具体实施方式
33.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
34.在某次实施方式中，第一方面，本发明提供了用于选择性扩增myd88基因l265p突变型的组合物，所述组合物包括引物对1和阻断探针，所述阻断探针靶向myd88基因的核酸片段覆盖编码第265位氨基酸的cds片段，所述引物对1包括靶向阻断探针上游的正向引物和靶向阻断探针下游的反向引物；所述阻断探针为肽核酸修饰探针。
35.在可选的实施方式中，所述阻断探针靶向myd88基因的片段范围包括编码第265位氨基酸的密码子的上游至少3个核苷酸和/或下游至少3个核苷酸，所述阻断探针的核苷酸
长度为13～20bps。
36.优选地，所述阻断探针靶向myd88基因的片段范围包括编码第265位氨基酸的密码子的上游至少7个核苷酸和/或下游至少6个核苷酸，所述阻断探针的核苷酸长度为14bps。
37.优选地，所述阻断探针的核苷酸序列如seq id no:1(aagcgactgatccc)所示，其中加粗并下划线标记的碱基为突变位点。
38.在可选的实施方式中，所述引物对1的正向引物的核苷酸序列如seq id no:2(ggcctgatgccagcatg)所示，所述引物对1的反向引物的核苷酸序列如seq id no:3(tcttcattgccttgtactt)所示。
39.在可选的实施方式中，所述组合物还包括用于定性或定量检出myd88基因l265p突变型扩增结果的检测探针1。
40.优选地，所述检测探针1连有荧光基团，或者，所述检测探针1连有荧光基团和淬灭基团。
41.优选地，所述荧光基团选自fam、vic、rox或cy5。
42.优选地，所述淬灭基团选自mgb、bhq1、bhq2或bhq3。
43.优选地，所述检测探针1的核苷酸序列如seq id no:4(aagcgaccgatcc)所示。
44.第二方面，本发明提供了前述实施方式任一项所述的组合物在myd88基因l265p突变型选择性扩增或在myd88基因l265p突变型检测中的应用。
45.第三方面，本发明提供了用于选择性扩增myd88基因l265p突变型的试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒包括前述实施方式任一项所述的组合物，和用于检测内参基因的引物对2和检测探针2；所述内参基因包括rnase p基因。
46.在可选的实施方式中，所述引物对2的正向引物的核苷酸序列如seq id no:5(ggcggtgtttgcagatttgg)所示，所述引物对2的反向引物的核苷酸序列如seq id no:6(ctgtctccacaagtccgc)所示，所述检测探针2的核苷酸序列如seq id no:7(agcgggttctgacct)所示。
47.优选地，所述检测探针2连有荧光基团，或者，所述检测探针连有荧光基团和淬灭基团，且所述检测探针2的荧光基团和检测探针1的荧光基团不同。
48.优选地，所述荧光基团选自fam、vic、rox或cy5。
49.优选地，所述淬灭基团选自mgb、bhq1、bhq2或bhq3。
50.第四方面，本发明提供了选择性扩增myd88基因l265p突变型的方法，将待测样本和前述实施方式任一项所述的试剂加入pcr扩增体系中，经扩增得到富含myd88基因l265p突变型的扩增产物。
51.在可选的实施方式中，所述pcr包括数字pcr或荧光定量pcr。
52.在可选的实施方式中，所述pcr的扩增程序为：95℃下预变性10min，循环1次；95℃下变性30s，72℃下pna结合30s，58℃下退火延伸1min，循环45次。
53.下面结合附图，对本发明的一些实施方式作详细说明。在不冲突的情况下，下述的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
54.实施例1、检测引物、探针组设计
55.根据ncbi公布的myd88基因l265p序列设计特异性检测引物和探针，通过百力格生物科技(上海)股份有限公司合成，利用设计pna修饰来达到特异性封闭需求，引物、探针、
pna修饰序列的具体情况如表1所示。突变模板是包含myd88基因l265p序列突变质粒，野生型模板是promega公司的human genomic dna，将突变模板与野生型模板掺比混合，将20000拷贝数的野生型模板和100拷贝的突变模板混合作为实验模板，运用设计的引物、探针及pna扩增，同时与只添加引物探针，但未添加pna的扩增实验对比。扩增结果如表2、图1所示，添加引物、探针及pna扩增的突变拷贝数为107.3，野生型则为19863.2个拷贝数；而未添加pna扩增的突变结果为9847.5个拷贝数，野生型则为10223.7个拷贝数。这是由于pna与完整匹配的目标dna链结合十分坚固，构成pna/dna双链的遇热不解链的能力远强于dna双链，而若有一个碱基错配，pna也不能与单链稳定结合。基于pna以上特性，pcr扩增时，将pna与野生型基因结合而抑制其扩增。当存在突变时，由于出现碱基错配导致pna/dna双链解链，使突变dna链得以继续延伸、扩增，致使突变能够成功检出，而未添加pna的扩增结果显示特异性很差，如图1所示。
56.表1myd88基因l265p和rp基因涉及的引物探针及pna修饰
[0057][0058][0059]
表2扩增对比
[0060] 仅有引物探针组引物探针组+pnafam(突变)/copies9847.5107.3vic(内参)/copies10223.719863.2
[0061]
实施例2、扩增程序的优化
[0062]
液滴数字聚合酶链式反应(dd pcr)是正、负液滴利用泊松分布，不使用外部标准物来确定dna数量。然而，由于部分液滴具有中间荧光值，在图中以“离散点的形式出现，有时甚至不能清楚地划分为阳性液滴和阴性液滴。因此减少“离散点”，消除模棱两可的结果，有利于提高dd pcr的准确性和可信度。通过pcr循环程序的改变，如优化循环次数，改善了“离散点”出现。本发明设置了40cycles、45cycles、50cycles进行测试。实验结果如图2所示，40cycles扩增时，两通道的“离散点”均较多，但将循环次数增至45cycles和50cycles时，“离散点”明显减少。
[0063]
因此，本发明将45cycles作为扩增循环数，dd pcr扩增程序及步骤如表3所示。
[0064]
表3扩增条件及程序
[0065][0066]
实施例3、性能评价-灵敏度和特异性评价
[0067]
灵敏度评价：将包含myd88基因l265p序列的突变质粒和野生型模板human genomic dna按不同浓度梯度掺比稀释，配置成50％、5％、0.5％、0.25％、0.05％、0.025％、0％，即在20000个拷贝数的human genomic dna中投加10000copies、1000copies、100copies、50copies、10copies、5copies、0copy的突变质粒，外加双重灭菌水作为阴性对照，检测结果如表4和图3所示，本发明构建的突变体系能够检测至0.025％。
[0068]
表4灵敏度评价
[0069][0070]
特异性评价：设计的myd88基因l265p检测引物、探针及pna修饰检测human genomic dna，将dna模板稀释为20000copies、10000copies、5000copies，外加灭菌水作为阴性对照。考察突变相关检测体系对于野生型dna的检出情况。结果如图4所示，仅添加myd88基因l265p特异性检测引物、探针及pna修饰，无法扩增出野生型dna，外加的pna修饰具有高度的特异性。
[0071]
实施例4、临床样本检测
[0072]
待测样本为：经过临床鉴定为pvrl的眼内液样本10例和经过临床鉴定的健康者的眼内液样本10例，共计20例临床样本。通过此发明涉及的体系进行检测。
[0073]
检测结果如表所示：
[0074][0075]
结果表明，本发明构建的肽核酸修饰的dd pcr检测myd88基因l265p突变的检测方法在检测临床20例样本时，临床符合率较高，灵敏度为90％，特异性达至100％。
[0076]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

技术特征：
1.用于选择性扩增myd88基因l265p突变型的组合物，其特征在于，所述组合物包括引物对1和阻断探针，所述阻断探针靶向myd88基因的核酸片段覆盖编码第265位氨基酸的cds片段，所述引物对1包括靶向阻断探针上游的正向引物和靶向阻断探针下游的反向引物；所述阻断探针为肽核酸修饰探针。2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述阻断探针靶向myd88基因的片段范围包括编码第265位氨基酸的密码子的上游至少3个核苷酸和/或下游至少3个核苷酸，所述阻断探针的核苷酸长度为13～20bps；优选地，所述阻断探针靶向myd88基因的片段范围包括编码第265位氨基酸的密码子的上游至少7个核苷酸和/或下游至少6个核苷酸，所述阻断探针的核苷酸长度为14bps；优选地，所述阻断探针的核苷酸序列如seq id no:1所示。3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述引物对1的正向引物的核苷酸序列如seq id no:2所示，所述引物对1的反向引物的核苷酸序列如seq id no:3所示。4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括用于定性或定量检出myd88基因l265p突变型扩增结果的检测探针1；优选地，所述检测探针1连有荧光基团，或者，所述检测探针1连有荧光基团和淬灭基团；优选地，所述荧光基团选自fam、vic、rox或cy5；优选地，所述淬灭基团选自mgb、bhq1、bhq2或bhq3；优选地，所述检测探针1的核苷酸序列如seq id no:4所示。5.权利要求1～4任一项所述的组合物在myd88基因l265p突变型选择性扩增或在myd88基因l265p突变型检测中的应用。6.用于选择性扩增myd88基因l265p突变型的试剂或试剂盒，其特征在于，所述试剂或试剂盒包括权利要求1～4任一项所述的组合物，和用于检测内参基因的引物对2和检测探针2；所述内参基因包括rnase p基因。7.根据权利要求6所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述引物对2的正向引物的核苷酸序列如seq id no:5所示，所述引物对2的反向引物的核苷酸序列如seq id no:6所示，所述检测探针2的核苷酸序列如seq idno:7所示；优选地，所述检测探针2连有荧光基团，或者，所述检测探针2连有荧光基团和淬灭基团，且所述检测探针2的荧光基团和检测探针1的荧光基团不同；优选地，所述荧光基团选自vic、fam、rox或cy5；优选地，所述淬灭基团选自mgb、bhq1、bhq2或bhq3。8.选择性扩增myd88基因l265p突变型的方法，其特征在于，将待测样本和权利要求6或7所述的试剂加入pcr扩增体系中，经扩增得到富含myd88基因l265p突变型的扩增产物。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述pcr包括数字pcr或荧光定量pcr。10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述pcr的扩增程序为：95℃下预变性10min，循环1次；95℃下变性30s，72℃下pna结合30s，58℃下退火延伸1min，循环45次。

技术总结
本发明涉及基因突变检测技术领域，尤其是涉及用于选择性扩增MYD88基因L265P突变型的组合物、试剂和应用。本发明提供的组合物含有PNA修饰的特异性靶向野生型的阻断探针，能够用于选择性扩增MYD88基因L265P突变型，尤其是利用超灵敏的dd PCR技术，从而实现突变位点的高灵敏检测。高灵敏检测。高灵敏检测。


技术研发人员：陶勇 陆成慧 盛怡
受保护的技术使用者：智德明创生物科技（无锡）有限公司
技术研发日：2023.04.06
技术公布日：2023/7/12