一种尿液浓缩后提取循环肿瘤DNA的方法与流程

一种尿液浓缩后提取循环肿瘤dna的方法
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种尿液浓缩后提取循环肿瘤dna的方法。


背景技术：

2.晚期癌症患者取样除了肿瘤组织活检外，其自身还具有源自癌细胞裂解/死亡或活性分泌的无细胞dna释放进入循环系统，称为循环肿瘤dna(ctdna)，ctdna存在于血液、尿液、粪便、唾液、痰等体液中，并反映出与肿瘤dna相似的基因组改变。此外，健康患者和癌症患者在ctdna浓度、片段大小等方面均存在差异，使得ctdna成为一种很好的潜在癌症生物标记物，通过检测人循环系统中ctdna含量的变化来反映肿瘤的进展变化，是目前液体活检的主要发展方向。然而，ctdna在体液中所占比例非常低(《0.01％)，对样本突变丰度以及检测方法的灵敏性要求很高。
3.尿液作为一种完全无创的流体类型，以其采集量大、易于获得、含多种生物标志物等特点成为液体活检的理想样本。研究表明，被释放到循环系统中的ctdna可以通过肾脏过滤进入尿液中，用于指示肿瘤基因组中携带的基因突变；同时，由于尿液ctdna整合了多个位点的dna，可以很好地地解决肿瘤异质性带来的挑战，在未来的精准医学时代，ctdna有望在诊断、靶向药物/精准医疗、肿瘤应答和复发监测、抗癌药物耐药性进展等方面发挥越来越大的作用。
4.目前常用的ctdna提取方法有：苯酚-氯仿萃取法和阴离子交换树脂法。苯酚-氯仿萃取法耗时长，且由于肾脏过滤以及尿液中核酸酶活性过强等因素导致尿液ctdna降解严重，提取效果差；阴离子交换树脂法是基于尿液核酸与阴离子交换树脂的结合与licl洗脱技术，导致一些在尿液中碎片化的小片段ctdna(《150bp)易在纯化过程中丢失，从而降低后续ctdna检测的灵敏度。
5.基于上述存在的问题，本发明由此而来。


技术实现要素：

6.针对现有技术存在的上述不足，本发明提供了一种尿液浓缩后提取循环肿瘤dna的方法，通过将初始大量尿液样本浓缩至可操作体积并进行尿液ctdna提取/纯化，可用于后续尿液中微量、片段化ctdna检测等实验。
7.本发明的技术方案为：
8.一种尿液浓缩后提取循环肿瘤dna的方法，包括以下步骤：
9.(1)利用可截留尿液ctdna的超滤管浓缩尿液样本，向离心管中加入蛋白酶k和浓缩后的尿液样本；
10.(2)然后依次加入l1裂解液、l2裂解液，充分混匀后进行加热处理；其中l1裂解液中含有sds(十二烷基硫酸钠)、tris-hcl(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐)和cdta(1,2-环己二胺四乙酸)，l2裂解液中含有naoh和溶菌酶；
11.(3)继续加入缓冲液，充分混匀后立即冰浴处理；
12.(4)利用真空抽吸装置使步骤(3)冰浴后所得溶液过吸附柱，样本中的ctdna附着在吸附柱滤膜上；
13.(5)然后再加入洗涤液及乙醇，使用真空抽吸装置使其过吸附柱；
14.(6)取下吸附柱进行离心处理，然后对吸附柱的滤膜进行加热烘干除去乙醇；
15.(7)将吸附柱放入一个新的离心管中，加入适量洗脱液，室温静置后离心，得到提取后的ctdna。
16.优选地，尿液的浓缩方法为：将尿液加入到3-100kda截留滤膜孔径的超滤管中，然后离心处理，滤出的液体丢弃，收集剩余的所截留的浓缩尿液样本，依次加入剩余尿液样本，直至全部尿液样本浓缩完成。
17.优选地，尿液浓缩方法中离心处理条件为：4-30℃下，2000-16000
×
g运行10-60分钟。
18.优选地，步骤(1)中，浓缩后的尿液样本与蛋白酶k的体积比小于等于10:1。
19.优选地，l1裂解液中sds的质量分数为1-10％，tris-hcl的浓度为5-50mm，ph值为7.0-8.5，cdta的浓度为5-50mm；进一步优选，l1裂解液中sds的质量分数为1％，tris-hcl的浓度为10mm，ph值为8.0，cdta的浓度为10mm；
20.l2裂解液中naoh的浓度为50-1000mm，溶菌酶的浓度为5-50mm；进一步优选，l2裂解液中naoh的浓度为200mm，溶菌酶的浓度为10mm。
21.优选地，步骤(2)中，l1裂解液和l2裂解液的体积之和与浓缩后的尿液样本的体积比大于等于1:1，当蛋白酶k的加入体积为500μl，浓缩后的尿液样本的加入体积小于等于5ml，l1、l2裂解液的体积均介于0.5-5ml之间，进一步优选，l1裂解液加入4ml，l2裂解液加入1ml。
22.优选地，步骤(2)中，加热处理的条件为40-90℃孵育10-40分钟。
23.优选地，步骤(3)中所用的缓冲液为b1缓冲液，b1缓冲液中含有醋酸钠，醋酸钠的浓度为1-10m；b1缓冲液的加入体积与与浓缩后的尿液样本的体积比介于1:1-3:1之间。
24.优选地，步骤(5)中的洗涤液为w1洗涤液、w2洗涤液，w1洗涤液含有nacl、mops(3-吗啉丙磺酸)和异丙醇，其中nacl浓度为100-2000mm，mops浓度为10-200mm，ph值为6.0-8.5，异丙醇的体积分数为5-20％；w2洗涤液含有tris-hcl、edta(乙二胺四乙酸)和乙醇，其中tris-hcl浓度为1-20mm，ph值为7.0-8.5，edta浓度为0.1-10mm，乙醇的体积分数为80％；
25.步骤(5)所用乙醇的体积分数为96-100％；w1、w2洗涤液和乙醇的体积均介于500-1000μl之间。
26.优选地，步骤(7)中所用洗脱液为e1洗脱液，e1洗脱液含有tris-hcl和cdta，tris-hcl的浓度为1-20mm，ph值为7.0-8.5，cdta的浓度为0.1-10mm，e1洗脱液的体积介于20-150μl之间。
27.优选地，步骤(6)中的离心处理条件为2000-20000
×
g离心1-15分钟，烘干条件为45-70℃孵育1-15分钟；步骤(7)中的离心处理条件为室温2000-20000
×
g离心1-15分钟。
28.优选地，吸附柱为二氧化硅吸附柱。
29.优选地，提取得到的ctdna于-20℃保存，或-80℃长期保存。
30.本发明的有益效果是：
31.(1)本发明先将大量尿液浓缩至可操作体积，然后高效富集并提取尿液中片段化
ctdna，可以实现从大量尿液样本中提取有效的循环肿瘤dna(ctdna)；本发明大大提高尿液样本上样量，进而增大初始ctdna总量，提高后续检测ctdna灵敏度；
32.(2)本发明可提取50bp以下的小片段ctdna，结果完整性高，能准确反映病灶肿瘤核酸的整体水平；
33.(3)本发明的提取方法反应时间短，操作简单，成本低。
附图说明
34.下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：
35.图1本发明超滤离心管浓缩示意图；
36.图2本发明尿液ctdna纯化流程图；
37.图3实施例1尿液ctdna凝胶电泳结果示意图，a为尿液样本，b为血基因组对照样本；
38.图4实施例1尿液ctdna片段分析结果示意图；
39.图5对比例1中使用对照方法提取尿液样本ctdna的凝胶电泳结果，a1为尿液样本，b1为血基因组对照样本；
40.图6对比例1使用对照方法提取尿液样本ctdna的ctdna片段分析结果。
具体实施方式
41.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合具体实施方式并参照附图，对本发明进一步详细说明。应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。
42.实施例1：尿液ctdna富集和提取实验
43.1、富集/浓缩
44.从尿液保存管中吸取15ml尿液样本加入3kda截留滤膜孔径的超滤管中，并置于低温离心机中4℃2000
×
g离心20分钟，将截留的液体转移至新的50ml离心管中，并向超滤管中新加入15ml尿液样本，重复上述步骤，进行5次。得到的浓缩液置于同一50ml离心管中。
45.2、提取
46.步骤1：在新的50ml离心管加入500μl蛋白酶k和浓缩后的尿液样本4ml；
47.步骤2：加入4ml l1、1ml l2裂解液，高速涡旋振荡混匀，立即进行下一步骤；
48.步骤3：60℃孵育30min；
49.步骤4：加入9ml b1缓冲液，高速涡旋振荡混匀，冰浴5min；
50.步骤5：组合真空抽滤装置，将步骤4所得混合液转移至安装到吸附柱上的延伸管中；
51.步骤6：打开真空泵开关，液体抽净后关闭真空泵，待压力降至0后移去延伸管；
52.步骤7：加入600μl w1洗涤液，打开真空泵，让溶液过柱，关闭真空泵；
53.步骤8：加入600μl w2洗涤液，打开真空泵，让溶液过柱，关闭真空泵；
54.步骤9：加入750μl乙醇(96-100％)，打开真空泵，让溶液过柱，关闭真空泵；
55.步骤10：关闭吸附柱并取下吸附柱，放入到2ml离心管中，20000
×
g离心1min；
56.步骤11：将吸附柱小心取出放入新的2ml离心管中，56℃孵育10min；
57.步骤12：向吸附柱中加入40μl e1洗脱液，静置5min后20000
×
g离心2min，收集并保存ctdna。
58.其中所使用吸附柱为二氧化硅吸附柱，上述提取方法中涉及l1裂解液，l2裂解液，b1缓冲液，w1洗涤液，w2洗涤液，e1洗脱液包括如下成分，如表1所示：
59.表1
[0060][0061][0062]
3、电泳
[0063]
将纯化后的尿液ctdna与6
×
loading buffer(北京擎科生物科技有限公司)混合后电泳(150v，20min)，血浆gdna作为对照样本，并加入dl5000 dna marker(北京擎科生物科技有限公司)。
[0064]
4、片段分析
[0065]
使用agilent 2100生物分析仪配套高灵敏度dna试剂盒检测纯化后的尿液ctdna片段大小，按照其说明书进行，操作流程如下：
[0066]
将样本dna稀释至5ng/μl实验浓度；
[0067]
制备gel-dye mix：1)取出试剂盒中high sensitivity dna dye和high sensitivity dna gel，平衡到室温约30min，注意避光；2)取15μl high sensitivity dna dye加入到high sensitivity dnagel中，振荡混匀离心后，转移到过滤柱中，2000
×
g离心10分钟；
[0068]
将gel-dye mix加入芯片孔槽：1)取新的high sensitivity dna芯片放置实验台上，取9μl gel-dye mix加入到芯片的c4孔中；2)将芯片放入注胶平台，拉动注射器推杆至1ml刻度并扣紧上盖，压下推杆至固定架卡扣，计时60秒后松开固定架卡扣，松开注胶平台上盖；3)从注胶平台取出芯片，并向a4、b4和d4孔中分别加入9μl gel-dye mix；
[0069]
向a1-3、b1-3和c1-3和d1-3孔槽中分别注入5μl marker；
[0070]
加入ladder和样本：1)取1μl high sensitivity dna ladder加入到芯片的d3孔中；2)向11个样本孔中加入分别加入1μl要检测的样本，无样本孔加入1μl marker；3)将芯片放置到匹配的振荡仪上，2400
×
rpm混匀1分钟；4)将准备好的芯片放置到2100生物分析仪中，立即开始检测。
[0071]
电泳及片段分析结果见附图3-4，其中图3为本发明实施例1的尿液ctdna电泳结果，参照marker和血基因组(b)大小，发现经过尿液样本(a)浓缩及优化的提取方法后，在
100-250bp内有dna条带，此区域为提取到的尿液样本ctdna；图4为提取dna样本的片段大小分布，l1和l2分别为高灵敏度dna ladder的lower marker(35bp)和upper marker(10380bp)峰，样品峰均出现在l1和l2峰之间，且能够很好的区分marker峰和样品峰，图中片段大小为5-140bp的为ctdna，且含有多种小于50bp的ctdna片段。说明，本发明富集和提取方法处理的尿液ctdna效果好。
[0072]
对比例1
[0073]
取尿液样本4ml(尿液样本未经过浓缩富集处理)，使用circulating nucleic acid kit(qiaamp)依据使用说明书进行尿液ctdna提取，并进行电泳和片段分析，具体检测步骤同以上实施例。使用对照提取方法的电泳结果如图5所示，检测结果表明样本(a1)在10-150bp内无dna片段或该区域dna浓度过低无法在凝胶上被识别；使用对照提取方法的片段分析结果如图6所示，样品峰均出现在l1和l2峰之间，且能够很好的区分marker峰和样品峰。检测结果表明样品峰中无200bp以下dna片段，大多数集中在300-600bp范围大小，表明使用对照提取方法所提取的dna中无有效的尿液ctdna片段，提取效果不佳。
[0074]
应当理解的是，本发明的上述具体实施方式仅仅用于示例性说明或解释本发明的原理，而不构成对本发明的限制。因此，在不偏离本发明的精神和范围的情况下所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。此外，本发明所附权利要求旨在涵盖落入所附权利要求范围和边界、或者这种范围和边界的等同形式内的全部变化和修改例。

技术特征：
1.一种尿液浓缩后提取循环肿瘤dna的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)利用可截留尿液ctdna的超滤管浓缩尿液样本，向离心管中加入蛋白酶k和浓缩后的尿液样本；(2)然后依次加入l1裂解液、l2裂解液，充分混匀后进行加热处理；其中l1裂解液中含有sds、tris-hcl和cdta，l2裂解液中含有naoh和溶菌酶；(3)继续加入缓冲液，充分混匀后立即冰浴处理；(4)利用真空抽吸装置使步骤(3)冰浴后所得溶液过吸附柱，样本中的ctdna附着在吸附柱滤膜上；(5)然后再加入洗涤液及乙醇，使用真空抽吸装置使其过吸附柱；(6)取下吸附柱进行离心处理，然后对吸附柱的滤膜进行加热烘干除去乙醇；(7)将吸附柱放入一个新的离心管中，加入适量洗脱液，室温静置后离心，得到提取后的ctdna。2.根据权利要求1所述的一种尿液浓缩后提取循环肿瘤dna的方法，其特征在于，尿液的浓缩方法为：将尿液加入到3-100kda截留滤膜孔径的超滤管中，然后离心处理，滤出的液体丢弃，收集剩余的所截留的浓缩尿液样本，依次加入剩余尿液样本，直至全部尿液样本浓缩完成。3.根据权利要求2所述的一种尿液浓缩后提取循环肿瘤dna的方法，其特征在于，尿液浓缩方法中离心处理条件为：4-30℃下，2000-16000
×
g运行10-60分钟。4.根据权利要求1所述的一种尿液浓缩后提取循环肿瘤dna的方法，其特征在于，步骤(1)中，浓缩后的尿液样本与蛋白酶k的体积比小于等于10:1。5.根据权利要求1所述的一种尿液浓缩后提取循环肿瘤dna的方法，其特征在于，l1裂解液中sds的质量分数为1-10％，tris-hcl的浓度为5-50mm，ph值为7.0-8.5，cdta的浓度为5-50mm；l2裂解液中naoh的浓度为50-1000mm，溶菌酶的浓度为5-50mm；步骤(2)中，l1裂解液和l2裂解液的体积之和与浓缩后的尿液样本的体积比大于等于1:1，l1、l2裂解液的体积均介于0.5-5ml之间。6.根据权利要求1所述的一种尿液浓缩后提取循环肿瘤dna的方法，其特征在于，步骤(2)中，加热处理的条件为40-90℃孵育10-40分钟。7.根据权利要求1所述的一种尿液浓缩后提取循环肿瘤dna的方法，其特征在于，步骤(3)中所用的缓冲液为b1缓冲液，b1缓冲液中含有醋酸钠，醋酸钠的浓度为1-10m；b1缓冲液的加入体积与与浓缩后的尿液样本的体积比介于1:1-3:1之间。8.根据权利要求1所述的一种尿液浓缩后提取循环肿瘤dna的方法，其特征在于，步骤(5)中的洗涤液为w1洗涤液、w2洗涤液，w1洗涤液含有nacl、mops和异丙醇，其中nacl浓度为100-2000mm，mops浓度为10-200mm，ph值为6.0-8.5，异丙醇的体积分数为5-20％；w2洗涤液含有tris-hcl、edta和乙醇，其中tris-hcl浓度为1-20mm，ph值为7.0-8.5，edta浓度为0.1-10mm，乙醇的体积分数为80％；步骤(5)所用乙醇的体积分数为96-100％；w1、w2洗涤液和乙醇的体积均介于500-1000μl之间。9.根据权利要求1所述的一种尿液浓缩后提取循环肿瘤dna的方法，其特征在于，步骤
(7)中所用洗脱液为e1洗脱液，e1洗脱液含有tris-hcl和cdta，tris-hcl的浓度为1-20mm，ph值为7.0-8.5，cdta的浓度为0.1-10mm，e1洗脱液的体积介于20-150μl之间。10.根据权利要求1所述的一种尿液浓缩后提取循环肿瘤dna的方法，其特征在于，步骤(6)中的离心处理条件为2000-20000
×
g离心1-15分钟，烘干条件为45-70℃孵育1-15分钟；步骤(7)中的离心处理条件为室温2000-20000
×
g离心1-15分钟。

技术总结
本发明公开了一种尿液浓缩后提取循环肿瘤DNA的方法，包括以下步骤：1)利用可截留尿液ctDNA的超滤管浓缩尿液样本，向离心管中加入蛋白酶K和浓缩后的尿液样本；2)然后依次加入L1、L2裂解液，充分混匀后进行加热处理；3)继续加入缓冲液，充分混匀后立即冰浴处理；4)利用真空抽吸装置使样本中的ctDNA附着在吸附柱滤膜上；5)然后再加入洗涤液及乙醇，使用真空抽吸装置使其过吸附柱；6)取下吸附柱进行离心处理，然后对吸附柱的滤膜进行加热烘干；7)将吸附柱放入一个新的离心管中，加入洗脱液，室温静置后离心。本发明可以实现从大量尿液样本中提取有效的循环肿瘤DNA，且可提取50bp以下的小片段ctDNA。小片段ctDNA。小片段ctDNA。


技术研发人员：陈谦 曹又元 刘弘扬 刘泓
受保护的技术使用者：苏州索真生物技术有限公司
技术研发日：2023.02.27
技术公布日：2023/7/12