桃金娘MYB转录因子RtMYB1及其应用

桃金娘myb转录因子rtmyb1及其应用
技术领域
1.本发明属于基因工程技术领域，特别是涉及桃金娘myb转录因子rtmyb1及其应用。


背景技术：

2.转录因子也称反式作用因子，是能与顺式作用元件、增强子或沉默子结合从而参与调节靶基因转录效率的一组蛋白。花青素次级代谢合成途径中的基因调控一直都是研究的热点。花青素合成相关的关键基因受basic-helix-loop-helix(bhlh)，r2r3-myb转录因子和作为mbw(myb/bhlh/wd40)复合体一部分的wd40调控，三类转录因子可以单独调控结构基因或者相互结合组成myb-bhlh-wd40(mbw)复合体共同调控结构基因。
3.myb是植物中最大的转录因子家族,根据含有的结构域数目可分为r1-myb、r2r3-myb、r1r2r3-myb和4r-myb四类。其中r2r3-myb转录因子在调控花青素合成过程中起着重要的作用，其能直接调控花青素生物合成结构基因的表达水平，因此在花青素的生物合成调控中处于核心地位，目前已从多种模式植物与观赏植物中分离鉴定出参与花青素合成正向调控的r2r3-myb转录因子。在玉米中第一个报道了能特异调控玉米糊粉层花青素合成的myb类基因c1。拟南芥中的pap1已被证实参与调控整条花青素合成途径结构基因的表达水平，同时在紫罗兰与玫瑰中异源表达pap1也能提高花青素的含量。拟南芥中pap2、myb113和myb114也可在特定环境或发育阶段激活dfr和ans等基因的表达，且激活程度弱于pap1。烟草本体中过表达ntan2能使烟草的营养器官与生殖器官大量积累花青素。葡萄风信子中maan2与mamyba能与bhlh蛋白互作共同调控花青素合成。dhmyb2、ogmyb1、cymyb1分别是调控石斛兰、文心兰以及大花惠兰花青素的主要转录因子。
4.桃金娘(rhodomyrtus tomentosa(ait.)hask)为桃金娘科(myrtaceae)桃金娘属常绿小灌木，别名岗稔、山稔等，原产于我国南部、西南部、东南部以及亚洲热带和亚热带地区。桃金娘对贫瘠土壤适应性好，对华南地区荒山绿化、水土保持贡献巨大，是我国南方常见酸性土指示植物之一。桃金娘富含多糖、单宁、黄酮类、花青素及花色苷等多种活性成分，果实成熟后富含花青素类物质，因此桃金娘具有极好的抗菌抗炎抗氧化活性。
5.花青素作为重要的次生代谢产物，在植物中具有广泛的生物学功能，可以使花卉、蔬菜和水果等呈现丰富的色彩，具有抗氧化、抗癌、预防心脑血管疾病等多种生理功能。由于天然植物提取物的开发利用具有较高安全性，因此在色素开发领域花青素植物资源具有广泛的发展空间和前景。
6.本发明通过桃金娘成熟果实，发现一个新的myb转录因子。


技术实现要素：

7.基于此，本发明的目的是提供一种桃金娘myb转录因子rtmyb1及其应用。
8.为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案为：一种桃金娘myb转录因子rtmyb1，所述氨基酸序列如seq id no：1所示。
9.上述所述的桃金娘myb转录因子rtmyb1的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列
master mix(sybr premix ex taqtm.takara)10μl，cdna模板1μl，引物各1μl，加水至20μl。反应条件为：95℃变性5分钟，然后进行40个循环pcr反应(95℃变性5秒，55℃退火30秒，72℃延申30秒)。相对表达量利用2-δδct
方法计算。每个样品做3个重复，结果进行统计分析，结果如图1所示，从图1右侧坐标及线型图中可以看出，rtmyb1基因的表达量在果实发育青果期几乎不表达，而在黄果期和红果期高表达，尤其是红果期。
26.实施例2
27.rtmyb1基因的核苷酸如seq id no.2所示，其编码的蛋白序列如seq id no.1所示。
28.通过pcr克隆从桃金娘的红果期的cdna克隆出rtmyb1基因的编码序列，并克隆到pcambia1301(酶切位点为kpnⅰ和bamhⅰ)载体上，得到35s：rtmyb1表达载体，如图2a所示。
29.35s：rtmyb1表达载体转化根癌农杆菌gv3101，并利用浸泡法转化桃金娘愈伤组织，通过潮霉素筛选得到抗性转化体。将非转基因的桃金娘愈伤组织(wt)和转基因的桃金娘愈伤组织(oe-rtmyb1)置于光照下培养7天，结果如图2b所示，从图2b可以看出，转基因的桃金娘愈伤组织上表现为紫红色斑块。
30.愈伤组织中花青素的含量测定方法如下：将0.2克愈伤组织放入10毫升预冷的盐酸/甲醇(1/99，v/v)中提取，在黑暗中提取2小时，提取液通过分光光度计测量530纳米和600纳米波长的吸收值。花青素含量的相对值q以od
530-od
600
计算，为方便比较，q＝0.01定义为1个花青素单位。愈伤组织中花青素的含量测定结果如图2c所示，从图2c可以看出，转基因的桃金娘愈伤组织(oe-rtmyb1)和非转基因的桃金娘愈伤组织(wt)中花青素含量的差异，以非转基因的桃金娘愈伤组织作为对照，转基因的桃金娘愈伤组织中花青素合成明显增加。
31.因此，桃金娘myb转录因子rtmyb1可以作为转基因标记应用在筛选高产花青素的转基因材料中。
32.实施例3
33.提取花青素合成通路上的关键基因(rtufgt1)的启动子(见seq id no：3)，设计克隆序列引物(f：tatctcgagtaaacctattttgagag；r：tatggatcccttatgagtttgcgtc)，模板为桃金娘基因组dna，扩增其全长序列，用t4连接酶与pgreenii 0800-luc载体(酶切位点为xhoⅰ和bamhⅰ)连接，获得对应的启动子重组载体。将启动子重组载体、35s：rtmyb1表达载体以及空白对照组35s(pcambia1301)分别转入gv3101农杆菌，发酵培养至对数生长期，然后将转入启动子重组载体、35s：rtmyb1表达载体的农杆菌菌液等体积混合最终浓度od600值调为0.5，以35s为空白对照组，实验组1为rtmyb1和rtufgt1的组合菌液(35s：rtmyb1)，分别注射进烟草，共培养3d后使用1mmol
·
l
–1萤火素底物d-luciferin反应液喷湿叶片的背面，在植物活体成像仪(lb985 nightshade，germany)下进行活体发光定性分析，检测rtmyb1对花青素合成通路上的关键基因(rtufgt1)的启动子激活效应。
34.实验结果如图3所示，rtmyb1可以转录激活花青素合成结构基因rtufgt1启动子。通过实验得出rtmyb1调控花青素合成的途径：通过直接调控花青素合成基因rtufgt提高花青素的合成。
35.seq id no：1
[0036][0037]
seq id no：2
[0038][0039][0040]
seq id no：3
[0041]
[0042][0043]
以上所述仅为本发明的具体实施方式，不是全部的实施方式，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。

技术特征：
1.桃金娘myb转录因子rtmyb1，其特征在于，氨基酸序列如seq id no：1所示。2.权利要求1所述的转录因子rtmyb1的编码基因。3.根据权利要求2所示的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如seq id no：2所示。4.含有权利要求2或3所述的转录因子rtmyb1的编码基因的重组载体。5.含有权利要求4所述的重组载体的重组基因工程菌。6.权利要求2或3所述的桃金娘myb转录因子rtmyb1的编码基因作为转基因标记在筛选花青素合成的转基因材料中的应用。7.权利要求1所述的桃金娘myb转录因子rtmyb1或其编码基因在调控花青素合成中的应用。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，通过超表达桃金娘myb转录因子rtmyb1的编码基因提高花青素合成，进而提高花青素含量。9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，通过超表达桃金娘myb转录因子rtmyb1的编码基因提高花青素合成，进而提高蔬菜、水果及观赏植物中花青素含量。10.根据权利要求7-9任一项所述的应用，其特征在于，转录因子rtmyb1调控花青素合成的途径：通过直接调控花青素合成基因rtufgt。

技术总结
本发明公开了一种桃金娘MYB转录因子RtMYB1及其应用。所述桃金娘MYB转录因子RtMYB1的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。所述桃金娘MYB转录因子RtMYB1作为转基因标记在筛选转基因材料中的应用。所述桃金娘MYB转录因子RtMYB1在调控花青素合成中的应用。RtMYB1的新发现实桃金娘种的一个转录因子，转基因研究表明。在桃金娘愈伤组织中过表达该MYB转录因子，可促使愈伤组织中花青素的合成。该基因对花青素合成结构基因的表达起调控作用，从而调控花青素的合成。该基因可以用于转基因研究，作为转基因标记，方便转基因材料的筛选，也可以用于植物基因工程，通过超表达，在蔬菜、水果及观赏植物中提高花青素含量。及观赏植物中提高花青素含量。及观赏植物中提高花青素含量。


技术研发人员：杨玲 邓书林 吕善武 方瑜婕
受保护的技术使用者：中国科学院华南植物园
技术研发日：2023.03.31
技术公布日：2023/7/12