一株蜡样芽胞杆菌噬菌体vB_BceP_LY3及其快速检测方法和应用

一株蜡样芽胞杆菌噬菌体vb_bcep_ly3及其快速检测方法和应用
技术领域：
1.本发明属于微生物领域，具体涉及一株蜡样芽胞杆菌噬菌体vb_bcep_ly3及其快速检测方法和应用。


背景技术：

2.蜡样芽孢杆菌是一种表面粗糙、无荚膜的革兰氏阳性菌，该菌可以产生内生孢子，可以适应高温、紫外、有害化学物质等不利环境。作为食源性致病菌之一，蜡样芽孢杆菌引起的食源性疾病的报告数量在近几年呈上升趋势，在我国由致病菌引起的食物中毒事件排名中位于前五，对人体健康危害较大。蜡样芽孢杆菌在生长繁殖的过程中会释放毒素，引起2种类型的食物中毒，即呕吐和腹泻综合征，耐酸耐热的呕吐型毒素常会引起患者恶心、呕吐，在食品加工过程中不易被分解；腹泻型毒素包括溶血素、非溶血肠毒素和细胞毒素k等多种毒素，引起腹泻和腹痛等症状，人类中毒后还可能导致菌血症、心内膜炎等各种局部和系统感染，甚至导致死亡。蜡样芽孢杆菌广泛分布在牛奶、米饭、新鲜蔬菜等食物中，因此防控蜡样芽孢杆菌是控制食品污染和感染后治疗的关键环节。
3.目前，抗生素仍然是治疗该菌株引起感染的主要方法，但由于抗生素的滥用，蜡样芽孢杆菌耐药情况严峻，导致抗生素防控蜡样芽孢杆菌污染失败。因此，急需寻找新的防控技术。
4.感染细菌的病毒(即噬菌体)成为抗菌新药研究开发的新热点和理想材料。噬菌体治疗细菌感染具有专一性，是天然的抗菌剂。在美国，一些经fda(u.s.food and drug administration)批准的噬菌体类产品，已经被用投入生产应用。根据生活史不同，噬菌体可分为烈性噬菌体和溶原噬菌体。其中烈性噬菌体对哺乳动物细胞无害，对宿主细菌具有高度特异性，能够特异性识别并杀灭细菌，可用于致病微生物的防控。由于噬菌体只能在宿主体内复制增殖，产生子代噬菌体最终裂解细菌，如果缺乏特定细菌病原体存在，其会因没有宿主来进行自我繁殖而无法持续存在。比抗生素更有发展前景的是，噬菌体作为一个动态的实体，能够与宿主菌共同进化，最大程度的发挥治疗作用。
5.目前，噬菌体的检测主要有基于分离培养后的形态学检测等。这些方法需要对样本进行富集与培养、在获得单个噬菌斑后进行显微镜下检查或系列的生化鉴定，实验耗时长、操作繁复、成本高，不利于对噬菌体进行早期识别与鉴定，亦不能进行准确定量分析。近年来，以聚合酶链式反应pcr为基础的分子生物学检测以其快速、简便、准确、费用低等特点，已逐步取代传统培养及生化检测，成为微生物的最具潜力的新型检测技术之一。基于pcr的新型分子检测方法的关键是寻找该物种微生物特有的核苷酸序列进行检测设计。根据该物种特异性序列设计检测引物，已成为更精准的微生物检测方式。
6.目前噬菌体的应用主要受到以下几个方面的限制。
7.首先，目前鉴定噬菌体的方法主要基于分离培养后的形态学检测等，该方法需要对样本进行富集与培养，实验耗时长、操作繁复、成本高，不利于对噬菌体进行早期识别与
鉴定，亦不能进行准确定量分析。
8.其次，噬菌体具有专一和特异侵染菌株的特性，但正因如此，限制了噬菌体在实际应用的扩大生产。一个病症的发生往往是由多种病原菌共同作用的，而不是由单一病原菌引起的。同时由于不同环境或个体中即使发生相同病原菌的感染，也可能存在病原菌的个体差异。
9.再者，一些噬菌体具有溶源能力，在溶原噬菌体的生命周期中，噬菌体将其dna整合到细菌的基因组中，利用细菌的营养物质进行繁殖，这可能导致细菌对某些噬菌体产生抗药性；当溶原噬菌体受到环境胁迫的情况下，进入裂解周期，释放子代噬菌体，这可能导致它将细菌致病基因整合到自己的基因组上，引起基因水平转移，从而使得致病基因在菌株间传播。
10.最后，噬菌体制剂的稳定性也会影响其实际应用，一方面是必须确保噬菌体制剂在储藏、运输与销售过程中保持噬菌体活性及高效价，另一方面是必须确保噬菌体能够稳定存活在所投放应用的环境中，并起到有效作用。
11.目前缺乏能够同时解决以上应用限制并且理化性质应用范围广和遗传信息清晰的蜡样芽孢杆菌噬菌体。


技术实现要素：

12.本发明的第一个目的是提供一种对蜡样芽孢杆菌具有良好抑菌效果、能替代抗生素的生物制剂防控蜡样芽孢杆菌的蜡样芽孢杆菌噬菌体(bacillus cereus phage vb-bcep-ly3)(以下简写为ly3)，菌株的保藏编号为；gdmcc no：62703-b1，保藏单位为：广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)；保藏日期为2022年08月16日；保藏地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070。
13.本发明的专一性强的新型蜡样芽孢杆菌噬菌体(bacillus cereus phage)，是采用沉降-过滤方法从广州市大坦沙污水处理厂采集水样中分离得到。
14.本发明的噬菌体ly3属于有尾噬菌体目salasmaviridae科，通过全基因组测序和平均核苷酸一致性比对，表明该噬菌体与已知噬菌体相似性低，属于一株新型噬菌体。
15.本发明的噬菌体ly3具有seq id no.2所示的核苷酸序列。
16.本发明的噬菌体ly3具有良好的温度、ph和紫外稳定性，在温度4-60℃、ph 4～ph 11和254nm，25w的紫外处理40min内可保持稳定的效价。
17.本发明的噬菌体ly3在tsb肉汤及牛奶中对蜡样芽孢杆菌具有良好抑菌效果。
18.本发明的第二个目的是提供上述噬菌体ly3用于制备防控细菌的制剂中的应用。
19.优选地，所述的细菌是蜡样芽胞杆菌。
20.优选地，所述防控细菌的应用场景为食品基质、运输及保存的过程中。
21.优选地，是噬菌体ly3在制备抑制食品中蜡样芽孢杆菌制剂中的应用。
22.优选地，是噬菌体ly3在制备抑制牛奶中蜡样芽孢杆菌制剂中的应用。
23.本发明的第三个目的是提供一种防控蜡样芽孢杆菌感染的杀菌组合物，其含有上述蜡样芽孢杆菌噬菌体ly3作为活性成分。
24.优选地，所述杀菌组合物还包含其他相配合的杀菌活性成为或助剂。
25.本发明的噬菌体ly3含有seq id no.1所示的特异性分子靶标。
26.本发明的第四个目的是提供检测噬菌体ly3的引物，其包括：
27.正向引物序列：5
′‑
aaaccattaaaccaataccaccc
–3′
；
28.反向引物序列：5
′‑
atttgaaaacaaaggacacgaga
–3′
。
29.本发明的第五个目的是检测蜡样芽孢杆菌噬菌体ly3的方法，包括以下步骤：提取样品的dna，然后用上述用于检测噬菌体ly3的引物进行pcr扩增，如获得条带大小为204bp，则含有噬菌体ly3，否则则不含有。
30.优选地，所述的pcr反应体系为2
×
taq master mix 6.25μl，正向引物10μmol/l 0.5μl，反向引物10μmol/l 0.5μl，模板dna60ng/μl 0.5μl，ddh2o 4.75μl。
31.优选地，所述pcr反应程序为95℃预变性5min；95℃变性30s、62℃退火30s、72℃延伸13s，共进行35个循环；72℃延伸5min。
32.本发明的第六个目的是提供了一种对噬菌体ly3进行定量的qpcr检测方法，包括如下步骤：
33.(1)应用上述用于检测噬菌体ly3的引物绘制噬菌体ly3的标准曲线；
34.(2)应用上述用于检测脆噬菌体ly3的引物对样本进行qpcr扩增，获得样本的ct值，根据标准曲线计算该样品中含噬菌体ly3的含量。
35.优选地，所述的qpcr扩增体系为：2
×
sybr green premix反应液5μl，待测模板dna 1μl，10μmol/l的正向及反向引物各0.5μl，灭菌双蒸水3μl。
36.优选地，所述的qpcr反应程序两步法pcr反应程序：95℃预热30s；两步法扩增95℃5s、60℃退火30s，共进行55个循环。
37.本发明的第七个目的是提供了一种检测噬菌体ly3的试剂盒，其包括上述用于检测噬菌体ly3的引物。
38.优选地，所述的试剂盒还包括：2
×
pcr mix、模板dna和depc水。
39.本发明的第八个目的是提供上述用于检测噬菌体ly3的分子靶标、用于检测噬菌体ly3的引物在检测噬菌体ly3中的应用，所述的分子靶标的核苷酸序列如seq id no.1所示。
40.本发明噬菌体ly3，并具有以下特性：
41.1.该噬菌体具有一条特异性分子靶标，可用于鉴别噬菌体ly3与其它噬菌体。
42.2.该噬菌体潜伏期短，具有较好的稳定性，能够适应较广的紫外、ph和温度条件，有较好的应用前景。
43.3.该噬菌体是不含有溶原性基因的严格烈性噬菌体，并且不存在毒力因子和耐药基因。
44.4.该噬菌体在胰蛋白胨大豆肉汤(tryptone soya broth，tsb)具有较强的消杀蜡样芽孢杆菌的能力。
45.5.该噬菌体在牛奶中具有较强的防控蜡样芽孢杆菌的能力。
46.本发明与现有技术相比具有以下优点：
47.本发明公开了用于鉴别蜡样芽孢杆菌噬菌体ly3与其它噬菌体的特异性检测靶标及相关的检测方法，与现有技术相比，本发明的检测方法具有检测时间短、操作简便、准确度高、费用低廉且无需经过微生物培养等试验，即可在样本中检测噬菌体ly3的存在，具有高度实用性；本发明的特异检测靶标具有单一的特异性，检测结果特异，结果判断简单；本
发明既可定性、又可定量判断样本中噬菌体ly3的存在，应用范围广。
48.本发明提供的烈性噬菌体ly3是一株全新烈性噬菌体，不存在毒力因子，能特异性裂解蜡样芽孢杆菌。潜伏期短，该噬菌体能在较短时间内增殖，更早更好的用于抵抗蜡样芽孢杆菌的污染。同时，噬菌体ly3对高温、酸碱和紫外具有较强的稳定性，对运输与保存的要求低，能够在不同条件的环境中适用，不易在应用过程中失活。该噬菌体具有较广的最佳侵染复数(moi)，moi从0.1～0.0001范围内都能产生最高效价噬菌体滴度，具有高效扩增特性。该噬菌体在tsb液体培养基和牛奶中对目标菌有良好抑制效果。
49.综上所述，本发明采用泛基因组方法获得噬菌体ly3的特异性核心基因，设计获得能灵敏检测噬菌体ly3的特征引物，同时该方法能快速、简便地区分噬菌体ly3和其它噬菌体。本发明具有操作简便快捷、特异性高、可定量、检测费用低廉的优点。噬菌体ly3可用于制备安全高效的抗蜡样芽孢杆菌的药物，解决目前由于抗生素滥用导致蜡样芽孢杆菌耐药问题。
50.bacillus cereus phage vb-bcep-ly3，保藏编号为；gdmcc no：62703-b1，保藏单位为：广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)；保藏日期为2022年08月16日；保藏地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070。
附图说明:
51.图1是蜡样芽孢杆菌噬菌体ly3双层平板噬菌斑图；
52.图2是噬菌体ly3电镜图；
53.图3是噬菌体ly3的ani序列比对热图；
54.图4是噬菌体ly3最佳侵染复数；
55.图5是噬菌体ly3温度稳定性；
56.图6是噬菌体ly3的ph稳定性；
57.图7是噬菌体ly3紫外耐受性；
58.图8是噬菌体ly3一步生长曲线；
59.图9是噬菌体ly3消杀tsb肉汤中蜡样芽孢杆菌生长；
60.图10是噬菌体ly3在37℃中抑制牛奶中蜡样芽孢杆菌生长；
61.图11是噬菌体ly3在25℃中抑制牛奶中蜡样芽孢杆菌生长；
62.图12是噬菌体ly3在4℃中抑制牛奶中蜡样芽孢杆菌生长；
63.图13是噬菌体ly3特异性新检测靶标的检测电泳图；
64.图14是噬菌体ly3的qpcr定量检测结果。
具体实施方式
65.以下将结合本发明实施例中的附图，进一步对本发明做进一步详细说明，并且所描述的内容，不会限制权利要求书中所描述的本发明。显然，所描述的实施例仅为关键的实施例，并非全部的实施例，内容对本领域的技术人员是易理解的。
66.实施例1噬菌体的分离、纯化与增殖
67.1、宿主菌活化与培养
68.本研究使用的食源性蜡样芽孢杆菌由广东省科学院微生物研究所提供，将由30％
甘油保藏的菌株从20℃冰箱取出，用无菌枪头取100μl加到5ml胰酪大豆胨液体培养基(tsb)，并置于37℃，200r/min摇床中培养10小时，再经过甘露醇卵黄多粘菌素琼脂显色平板(myp)划线鉴定后，挑取单菌落接种于5ml tsb液体培养基中，37℃，200r/min，培养10小时，得到单一的悬浊液。
69.2、噬菌体的分离与纯化
70.2022年3月3日，从广东省广州市大坦沙污水处理厂采集2l水样，污水样品在室温条件下，经8000
×
g离心10min，上清液经0.45μm过滤器过滤，除去污水样品中大颗粒杂质及水样中的细菌颗粒，加入固体无水硫酸镁至终浓度为50mm，充分搅拌混匀，室温静置30min后使用抽滤装置将混合液通过0.22μm滤膜过滤，随后将滤膜剪碎后置于50ml洗脱液中(3％牛肉膏，3％吐温80，5mm nacl)，超声15min，将洗脱液用0.22μm滤膜过滤去除杂质，滤液4℃保存备用。
71.纯化：取100μl过夜活化的宿主液到5ml tsb肉汤中培养至对数期，将一定量上述滤液和对数期宿主悬浊液混合加入含2mm cacl2的双料tsb中，培养24小时后通过0.45μm滤头过滤，得到噬菌体过滤培养液。再用双层平板法鉴定噬菌体过滤培养液中是否含有噬菌体(图1)，挑取含有目标宿主噬菌体的过滤培养液，利用双层平板法进行多次纯化，最终在培养基上形成大小形态一致的噬菌斑即纯化完成，该噬菌体命名为ly3。
72.实施例2噬菌体的菌体鉴定
73.1、噬菌体形态鉴定
74.取15μl高滴度(1
×
10
10
pfu/ml)的噬菌体ly3滴加到微孔铜网上，自然沉降15min，用干净的滤纸吸收多余的液体，自然干燥后使用透射电镜(tem，hitachi h-7650)寻找噬菌体颗粒，观察其形态特征，并拍照记录。具体图片参见图2，噬菌体ly3的具有二十面体头部和短的尾巴组成，其头部直径和尾部直径分别为69.83
±
6.35、45.2
±
8.75nm。根据其形态特征与ictv的正式分类守则结合，该噬菌体属于有尾噬菌体目salasmaviridae科，正式命名为bacillus cereus phage vb-bcep-ly3，并保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为；gdmcc no：62703-b1，保藏单位为：广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)；保藏日期为2022年08月16日；保藏地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070。
75.2、噬菌体的分子生物学鉴定
76.将上述获得的噬菌体ly3用peg-nacl法浓缩，4℃过夜静置。次日，12000
×
g，离心20min。用sm buffer重悬沉淀，获得更高滴度的噬菌体后用苯酚，氯仿和异戊醇提取噬菌体dna，通过illumina miseq对dna进行测序并分析。
77.经分析可知，噬菌体ly3的全基因组测序结果如seq id no：2所示，噬菌体ly3是双链dna噬菌体，完整基因组序列长28124bp，gc含量为29.92％。将噬菌体ly3与ncbi blastn已报道的噬菌体进行比对，噬菌体ly3基因组与芽孢噬菌体serpounce(nc_049962.1)、芽孢噬菌体dk3(nc_049969.1)、芽孢噬菌体dk2(nc_049968.1)、芽孢噬菌体aurora(nc_031121.2)、芽孢噬菌体dlc1(nc_055908.1)、芽孢噬菌体konjotrouble(nc_049964.1)、芽孢噬菌体juan(nc_049963.1)、芽孢噬菌体qcm11(nc_049959.1)、芽孢噬菌体thornton(nc_055914.1)、芽孢噬菌体vb_bthp-goe4(nc_049966.1)、芽孢噬菌体stevenherd11(mk084630.1)、芽孢噬菌体radraab(mf156580.1)的基因组相似性分别为76.15％、75.83％、76.49％、81.99％、77.69％、83.25％、83.22％、83.18％、83.00％、82.85％、
83.32％、83.32％，其覆盖度分别是21％、17％、18％、12％、13％、14％、26％、19％、15％、24％、28％、28％。噬菌体ly3与已知的核酸序列相似性＜95.00％，可以初步鉴定为新型噬菌体。再通过计算他们与噬菌体ly3的ani(average nucleotide identity)，热图见参考图3，不同颜色代表不同的ani数值，噬菌体ly3与最相似的芽孢噬菌体radraab的ani值约为75.12％，低于95.00％，进一步证明噬菌体ly3具有新颖性。
78.噬菌体ly3预测含有48个开放阅读框(orf)，其中20个orf(41％)被注释为已知功能的蛋白，这些orf可以分为dna代谢功能域、结构功能域、裂解功能域、包装功能域和其他功能域(表1)。其中dna代谢功能域中含有的nrdh硫氧还原蛋白能够维持细胞内最适的氧化还原内环境，以适应宿主细胞高度氧化型的环境。裂解功能域中含有的内溶素参与了裂解宿主细胞的过程，从而释放成熟的病毒颗粒。包装功能域中含有dna包装蛋白将自身dna包裹在衣壳中，完成病毒基因组的包装。噬菌体ly3不存在毒力因子和溶原基因，因此能够安全应用于食品领域噬菌体治疗。
79.表1噬菌体ly3全基因组开放阅读框功能分类
80.[0081][0082]
实施例3噬菌体ly3生物学特性检测
[0083]
1、噬菌体ly3效价测定
[0084]
噬菌体效价指的是噬菌体的浓度，滴度。是指每毫升样品中含有多少噬菌体颗粒，用pfu/ml来表示。噬菌体效价的测定采用双层平板法测定，首先对纯化后的噬菌体扩培液进行连续10倍倍比稀释，选取适当的稀释度，分别吸取100μl噬菌体稀释液和100μl培养至对数期的蜡样芽孢杆菌365-h菌液，同时加入冷却至于45℃左右的tsb(含0.2％技术琼脂，2mm cacl2)中，充分混匀，倒入tsa平板上，每个稀释度做3个平行重复。待软琼脂凝固后，置于37℃恒温培养箱培养5～8h，观察并统计噬菌斑数目为30～300之间的平板，根据公式：噬菌体效价＝噬菌体稀释倍数
×
噬菌体平均噬菌斑数/噬菌体铺板体积，计算得到噬菌体ly3的效价为6.77
×
10
10
pfu/ml。
[0085]
2、噬菌体ly3最佳感染复数(moi)测定
[0086]
噬菌体moi的测定是指噬菌体颗粒数与宿主菌颗粒数的比值。产生最高噬菌体效价的moi条件被定义为最佳moi。按照常规方法增殖噬菌体ly3和其宿主蜡样芽孢杆菌365-h，测定噬菌体效价和宿主菌浓度，将细菌悬液稀释至1
×
108cfu/ml。根据不同比例的moi＝100，10，1，0.1，0.01，0.001，0.0001和0.00001分别取对应效价的噬菌体和100ul稀释好的蜡样芽孢杆菌菌液加入到5ml tsb培养基中(含2mm cacl2)中，置于37℃，200rpm/min摇床中培养，10h后将培养液通过0.45μm过滤器过滤，最后选取适当梯度的噬菌体稀释液，用双层平板法测定噬菌体效价，并进行三次独立实验。
[0087]
如图4所示，噬菌体ly3侵染蜡样芽孢杆菌365-h，moi在100、10、1和0.1四个比例之间没有显著性差异，而与moi为0.01、0.001、0.0001和0.00001之间表现出极其显著差异。在moi为0.00001、0.0001、0.001、0.01、0.1条件下，噬菌体效价均＞9.12lg，其中，moi为0.0001时，噬菌体效价最大，为3.85
×
10
10
pfu/ml，因此，该噬菌体最佳moi为0.0001。由此可知，噬菌体ly3在较低滴度情况下，都能够对蜡样芽孢杆菌表现出潜在的较强的裂解效果。
[0088]
3、噬菌体ly3的宿主谱
[0089]
使用点样法对噬菌体宿主谱进行测定。简言之，将100μl培养至对数期菌液与5ml(含0.3％技术琼脂和2mm cacl2)的tsb培养基混合，倒入tsa平板上，待软琼脂凝固后，滴入2μl噬菌体ly3培养液，做好标记，放置于37℃培养箱中培养，3h后菌苔在软琼脂上均匀分布，每隔1h噬菌斑形成情况并做好记录，从而确认噬菌体ly3宿主谱。细菌对噬菌体的敏感
性是通过点样区域是否形成清晰透明空斑决定，根据噬菌斑的清晰度，将结果分为两类：点样区清晰(+)和点样区无空斑(-)。
[0090]
如表2所示，采用点样法测定噬菌体对92株蜡样芽孢杆菌的裂解情况，蜡样芽孢杆菌噬菌体ly3对3株蜡样芽孢杆菌有裂解作用，裂解率为3％(3/92)。
[0091]
表2噬菌体ly1宿主谱
[0092]
[0093][0094]
[0095]
4、噬菌体ly3对温度、ph、ua稳定性检测
[0096]
温度对噬菌体的影响：根据测定的噬菌体效价，把噬菌体配制成1
×
108pfu/ml，在1.5ml ep管中各加入1ml噬菌体悬浮液，分别置于不同的水浴温度(4、25、37、50、60、70和80℃)孵育1h，结束后马上冷却至室温，通过双层平板法检测噬菌体悬浮液效价，并进行三次独立实验。
[0097]
具体结果参考图5，噬菌体ly3在4℃到60℃下温育1小时后，效价基本保持不变，在70℃条件下温育1小时，效价减少了约6个lg值，80℃条件下，噬菌体ly3完全失活。因此，噬菌体ly3在4℃至60℃条件下热稳定性较好。
[0098]
ph值对噬菌体的影响：利用氢氧化钠和盐酸将tsb肉汤调成不同的ph(ph＝3～13)，用0.45μm的过滤器过滤除菌。将0.1ml 1
×
109pfu/ml噬菌体加入0.9ml不同ph的tsb溶液中，最终噬菌体的浓度为1
×
108pfu/ml，置于37℃温浴1h，结束后马上冷却至室温并适当稀释，通过双层平板法测定噬菌体的效价，并进行三次独立实验。
[0099]
具体结果参考图6，噬菌体ly3在ph值为4到11范围内能够稳定存在，当ph＝3或12时，噬菌体ly3效价分别减少约2和5个lg值；当ph＝2或13，过酸过碱时，噬菌体完全失活。说明噬菌体ly3在ph为4-11之间保持稳定，能够适应较大范围的酸碱性环境。
[0100]
紫外对噬菌体的影响：将5ml 1
×
108pfu/ml噬菌体悬浮液加到无菌一次性培养皿中，并在生物安全柜内使用紫外灯(254nm，25w)，样品距离紫外灯15cm，从0min开始，每隔5min吸取100μl样品液，通过双层平板法测定噬菌体效价，并进行三次独立实验。
[0101]
具体结果参考图7，噬菌体ly3对紫外的耐受范围较广，紫外照射5min，效价降低约0.68个lg值，直至40min后，噬菌体才会完全失活，表明该噬菌体具有较宽的紫外耐受范围，在运输保存中能够维持稳定。
[0102]
5、噬菌体ly3一步生长曲线
[0103]
将100μl蜡样芽孢杆菌365-h的过夜培养物接种至5ml tsb，置于37℃，200r/min恒温摇床中温育至对数期，并根据od
600
与菌浓度数量关系，吸取一定量菌液于1.5ml ep管中，12000
×
g，离心5min，去除上清液。用1ml的sm buffer重悬沉淀，将细菌细胞悬浮液稀释至1
×
108cfu/ml。然后向0.79ml sm缓冲液中依次加入100μl 1
×
107pfu/ml噬菌体悬浮液、100μl 1
×
108cfu/ml菌悬液、10μl 2mm cacl2，最后将其充分混匀，将混合物在37℃下静置10min后，12000
×
g离心2min，除去上清液中游离噬菌体，并将沉淀物重新悬浮在1ml tsb中备用，再向9.8ml tsb中加入100μl上一步重悬液和100μl 2mm cacl2，充分混匀后，将混合物置于恒温摇床，在37℃和200rpm/min条件下振荡培养，从0min开始，每隔5min，吸取一定量样品液通过0.45μm过滤器过滤，并采用双层平板法测定噬菌体滴度。根据公式算出裂解量。裂解量＝平稳期平均数/潜伏期平均数。
[0104]
具体结果参考图8，最终测得噬菌体ly3的潜伏期为0～15min，裂解期为15～35min，裂解量为33pfu/cell。快速生长的噬菌体可以在短时间内破坏宿主细胞，能够在短时间内快速的裂解宿主菌，有利于保护食品免于细菌定殖。
[0105]
6、噬菌体ly3在tsb中消杀蜡样芽孢杆菌365-h能力的测定
[0106]
蜡样芽孢杆菌365-h在37℃下孵育直至对数期，并根据od
600
与菌浓度数量关系，吸取一定量菌液于1.5ml离心管中，12000
×
g，离心5min。去除上清液，用1ml的sm buffer重悬沉淀，将细菌细胞悬浮液稀释至1
×
107cfu/ml。吸取100μl上述菌悬液至5ml tsb液体培养
基中(含2mm cacl2)，实验组根据不同的moi 1、0.1、0.01、0.001、0.0001分别加入不同浓度的噬菌体稀释悬浮液，充分混匀，分别在4℃静置培养和37℃，200rpm/min条件下振荡培养，分别于0、2、4、6、8、10、12、24h取样，并进行适当稀释涂布计数。
[0107]
具体结果参考图9，蜡样芽孢杆菌365-h在2h内能达到稳定期，与对照组相比，实验组能够在前2h明显抑制蜡样芽孢杆菌的生长，在前6h用噬菌体处理后的细菌浓度都低于对照组，说明噬菌体ly3具有较好的对蜡样芽孢杆菌的消杀效果，能够在病原菌爆发的前2h，将病原菌杀死，起到提前杀灭病原菌的作用。
[0108]
7、噬菌体ly3在牛奶中抑菌能力的测定
[0109]
蜡样芽孢杆菌365-h在37℃下孵育直至对数期，并根据od
600
与菌浓度数量关系，吸取一定量菌液于1.5ml离心管中，12000
×
g，离心5min。去除上清液，用1ml的sm buffer重悬沉淀，将细菌细胞悬浮液稀释至1
×
106cfu/ml。依次向9.7ml牛奶中加入100μl细菌细胞悬浮液，100μl cacl2(2mm)，根据不同的moi 10000、1000、100、10、1、0.1加入相对应浓度的100μl噬菌体混合，对照组不需添加噬菌体悬浮液。分别在4℃静置培养和37℃，200rpm/min条件下振荡培养，分别于0、2、4、6、8、10、12、24h取样，并进行适当稀释涂布计数。
[0110]
具体结果参考图10、11、12，在37℃培养2h后，与对照组相比，moi为1000、100、10和1实验组中细菌数量显著降低，抑菌效果分别达到了79.57％(降低0.81log
10
cfu/ml)、70.79％(降低0.77log
10
cfu/ml)、55.11％(降低0.56log
10
cfu/ml)、63.34％(降低0.70log
10
cfu/ml)。与对照组相比，噬菌体ly3在2-6h能够明显抑制细菌生长。
[0111]
在25℃培养4h后，与对照组相比，moi为10000、1000、100、10和1实验组中细菌数量减少到最低值，抑菌效果分别达到了79.67％(降低1.36log
10
cfu/ml)、72.74％(降低1.33log
10
cfu/ml)、85.89％(降低1.15log
10
cfu/ml)、69.69％(降低0.85log
10
cfu/ml)、39.49％(降低0.31log
10
cfu/ml)。从整体上看，噬菌体ly3在25℃处理时能够在24h内抑制菌株生长，具有较好的防控效果。
[0112]
在4℃培养2h后，与对照组相比，moi为1的实验组抑菌效果不明显。moi为10000、1000、100、10实验组中细菌数量显著降低，抑菌效果分别达到了99.49％(降低2.30log
10
cfu/ml)、86.14％(降低0.47log
10
cfu/ml)、81.98％(降低0.69log
10
cfu/ml)、50.27％(降低0.37log
10
cfu/ml)，且在24h内一直抑制细菌生长。值得注意的是，在moi为10000处理4-24h内，细菌浓度降低到检测限以下(《10cfu/ml)，抑菌效果几乎达到100％。说明噬菌体ly3具有较好的防控蜡样芽孢杆菌的效果，在4℃处理24h抑菌效果明显，甚至moi为10000时在4℃处理8h后，没有看到菌株生长，对防控食品中蜡样芽孢杆菌的污染有较大的潜力。
[0113]
实施例4噬菌体ly3的检测靶标挖掘
[0114]
下载ncbi中genbank数据库内及发明人团队前期建立的噬菌体全基因组数据库，提取蜡样芽孢杆菌噬菌体ly3的核酸序列，逐个比对ncbi非冗余核酸数据库，去除在其它物种亦同时存在的序列，获取与相近物种相比的连续的特异性序列作为ly3的潜在特异性分子靶标。
[0115]
应用ncbi数据库primer-blast对潜在的特异性分子靶标进行引物设计，获得相应检测引物及检测目标片段。将检测目标片段再次比对ncbi非冗余基因数据库，去除在其它物种存在相似度》85％的序列，获得适用于分子检测的菌种特异性分子靶标。后续将所筛选
靶标应用于实际样品中检测，选取在实际样品中仍具备良好检测特异性及敏感性的靶标作为检测蜡样芽孢杆菌噬菌体ly3的特异性分子靶标。
[0116]
根据上述流程，进行进一步筛选及验证分析，获得具有特异鉴定蜡样芽孢杆菌噬菌体ly3的特异性分子靶标序列seq id no.1，即蜡样芽孢杆菌噬菌体ly3的特异性识别核苷酸序列如seq id no.1所示。
[0117]
实施例5噬菌体ly3的新检测靶标快速检测方法的建立
[0118]
(1)本实施例提供了一种检测蜡样芽孢杆菌噬菌体ly3的方法，具体操作如下：
[0119]
根据实施例4获得的蜡样芽孢杆菌噬菌体ly3特异性检测靶标seq id no.1，采用primer-blast软件设计能特异性扩增目标靶标并获得目标片段的引物如表3所示，获得快速检测方法，包括以下步骤：
[0120]
表3蜡样芽孢杆菌噬菌体ly3特异性pcr检测引物序列
[0121][0122]
pcr检测体系及扩增程序：
[0123]
采用苯酚法氯仿提取待测的噬菌体基因组dna，后加入蜡样芽孢杆菌噬菌体ly3的pcr检测反应体系中。蜡样芽孢杆菌噬菌体ly3的pcr反应体系配制如下：
[0124][0125]
以下为pcr反应条件如下：
[0126][0127]
pcr结束后取5μl pcr产物进行2％琼脂糖电泳。若电泳结果显示扩增产物在目标条带处出现单一扩增条带，则说明样本中含有检测对应的蜡样芽孢杆菌噬菌体ly3；若没有出现相应的单一扩增条带，则样本中不含有蜡样芽孢杆菌噬菌体ly3。本发明中，检测蜡样芽孢杆菌噬菌体ly3的目标条带大小为204bp，进行sanger测序可获得如seq id no.1下划线段序列所示的核苷酸序列。
[0128]
(2)噬菌体ly3特异性新检测靶标快速检测方法的敏感性、特异性评价
[0129]
采用上述步骤(1)的方案(引物ly3_f和ly3_r)对8株不同来源的蜡样芽孢杆菌噬菌体、15株其它噬菌体及噬菌体ly3宿主365-h进行检测，电泳结果如图13所示，结果判读如表4所示。
[0130]
表4蜡样芽孢杆菌噬菌体ly3特异性新检测靶标的检测结果
[0131][0132]
实施例6噬菌体ly3特异性新检测靶标的定量检测方法
[0133]
(1)本实施例提供了一种对样本中蜡样芽孢杆菌噬菌体ly3进行定量检测的方法，
采用引物ly3_f和ly3_r作为qpcr扩增反应的引物，具体操作如下：
[0134]
噬菌体ly3识别特异性核苷酸的引物
[0135]
正向引物序列seq.id no.2
[0136]5′‑
aaaccattaaaccaataccaccc
–3′
[0137]
反向引物序列seq.id no.3
[0138]5′‑
atttgaaaacaaaggacacgaga
–3′
[0139]
①
模板dna制备：采用苯酚氯仿法提取蜡样芽孢杆菌噬菌体ly3的dna，作为待检测模板；
[0140]
②
qpcr检测体系及扩增程序：
[0141]
噬菌体ly3检测的qpcr反应体系配制如下：
[0142][0143]
以下为qpcr扩增程序：
[0144][0145]
③
qpcr结果读取：
[0146]
利用roche96荧光定量扩增仪上对体系进行扩增检测，利用软件96sw 1.1读取扩增结果。在空白对照不存在荧光信号前提下，如果产生荧光信号，说明样品中含有检测引物对应的蜡样芽孢杆菌噬菌体ly3；如果不产生荧光信号，则样品中不含检测引物对应的蜡样芽孢杆菌噬菌体ly3。
[0147]
(2)新检测方案对蜡样芽孢杆菌噬菌体ly3检测灵敏度评价
[0148]
应用将浓度为1.67
×
101ng/μl的蜡样芽孢杆菌噬菌体ly3的dna按照10倍梯度进行稀释，得浓度为1.67
×
100、10-1
、10-2
、10-3
、10-4
、10-5
、10-6
、10-7
ng/μl的待测样本dna，按上述qpcr方案进行样本中蜡样芽孢杆菌噬菌体ly3的定量检测，每个浓度样品分别进行三次平行实验。
[0149]
绘制标准曲线：以样品中蜡样芽孢杆菌噬菌体ly3的dna浓度的对数为横坐标，以相应的qpcr的实时ct值为纵坐标，拟合所得曲线即为蜡样芽孢杆菌噬菌体ly3定量检测的标准曲线。标准曲线如图14所示，引物对样本中蜡样芽孢杆菌噬菌体ly3的检测限为1.67
×
10-7
ng/μl。结果提示，所述蜡样芽孢杆菌噬菌体ly3检测的拟合标准曲线为y＝-4.7615x+7.3633，相关系数r2为0.9974。
[0150]
(3)实际样本中蜡样芽孢杆菌噬菌体ly3的qpcr定量检测
[0151]
采集污水样品1l，使用苯酚氯仿法提取样品中的噬菌体dna，后按实施例6(1)进行
qpcr检测。采用蜡样芽孢杆菌噬菌体ly3特异引物进行qpcr检测，发现检测样本的ct值为22.30
±
0.13，根据标准曲线计算可知该样品中含蜡样芽孢杆菌噬菌体ly3的dna量为1
×
10
3.14
ng/μl。
[0152]
1、噬菌体ly3的特异性识别核苷酸序列seq id no.1
[0153]
gaaatagcgtaaaccattaaaccaataccacccattaagaatactattaaacctgtaaataaacccgacatttttcatttcccctttgttttaatttctataattattatagcatatattttcaattacgtaaatagataagatagaaaaagaagtaaaaacttcttaatctttcttaattattcttatgatctcgtgtcctttgttttcaaattcaattatttcttgttttgaataaaaagataagtatgtaatcatacctgattttaattttactttagcattatacatattaaaaacctccaagtaatctttatttaatttctataattattataacattattaaattaaaaatacaagtcatttacgtaaataaaaatgaaataaatatatatttaaaatcataaataaataattatgtcaatagttaaataggggaaaatgaaaataaagtgtaccataacacattt。
[0154]
2.噬菌体ly3的核苷酸序列seq id no.2
[0155]
cccccccccccccccccccccccccccccccccccccccttttttttttcaagcagaagacggcatacgagattggcacgggtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctaaatgtgggtgggtacacttttttcggatttttcacccataaaatgtaacccctgtcaacaaaatctttaaaatcttttaaattattttattcaattttacttgatttattttgttaaaaatgttatatattatattatcatttatttgtcaagttatttattataaaaaatacgatcttataagtgatcgttttatatattttaaattcaattttattaaggtgaaaaccttgctactaatttcacctttaggctactttcacaaggctttctagtaagttcattacagtctgtattgcaaggcatatccagtacccaatttttaacggcactttttacagtgggaaacccgatcaaaatacaatatggaagacttaatgtcttactttaataagtataacataaaatcttccatttgtcaataattattttttaagtgttataaaatatctttcattaccttgctcattcatatcattagaaattgaagttaaattataatcagtagtcttaattaaattttctatatgaatcatacatctttctttattagaaaacgttaattcttttatatctttaattctacctaatttataaatatttatatgtaatttaacactctttttatcaatatatctaacatcaacatttttttgtttctttttattttcttcaatagtaaaatccatcaattattttcctctagtttctttctgtaaaattcatatttatttaaatcttgttctttactgttattatcttttttacccgcacgataccaatactttatcatgttcattttatagaaaccattcatttcttctttagttaaaatagattcaccaatagctataggatcaataccgttaccatgataatgactaggcttatttataatatcttctttttgtttttcttgattatctgtattttcgtttatttttccaaaaatactttctttcatattacaatatgagtccaaatcaattccatgtttatcagctatatttctacaaaaatcacaataaactctaactttacattcctctcgttttttattgcaatgtctacatctcatcaataccactccattaaatttttattttaagtcgctttcttttacaaaaacaccgttgatcatttttccttttctatctttaatttcattataagcaatttcaacacagtcttcaattttaacacctaattgcattgataggattgtcattacaacatacatatctcctatactatcaattaccaattcttcattacctttcgctaaaccctgacataattccccaaattcttcacctaattttaacatttgtttgttaggatcagctacatccaaatttctatctttaccccattctttaattaaattagttgtttcttgcaagtttatcataaccccaaaacccccataattttgcccatattttcttcaaaaccaattaaaggtttttcataatccccattaataacaaaagtaggtaaagtgttaacacccattttttcagttaaaattcttttagccatttgatcaacatcaacatttctttcaattaattttaaattctctttaatatgaggtggaaggttactaagattaaacttagcacctttacatttcccacaattattacctgtaaacattacaacttcaatcatttttcttttcctccattattttatttaatgattgtacagcagaaaacaattcttctgctgtaaatccagcttccttagtaacctcaacaatatacagcatacaatcacttgatttcttagcaaacttcaacattttgtttatattttgcaaattatccattatcattgcacctccatcattttatattgaacccaattattagaatccataccaattatttcttctaattcttcttttggttgcggatcaagaataacatttttacgaatccctaaagaat
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[0156]
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[0157]
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[0158]
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[0159]
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[0161]
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[0169]
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[0170]
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[0173]
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[0176]
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[0188]
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[0189]
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[0220]
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[0221]
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[0222]
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[0223]
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[0224]
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[0226]
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[0431]
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[0432]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施内容方式不收上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、代替、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围。

技术特征：
1.蜡样芽孢杆菌噬菌体(bacillus cereus phage vb-bcep-ly3)，保藏编号为；gdmcc no：62703-b1。2.权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌噬菌体在用于制备防控细菌的制剂中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的细菌是蜡样芽胞杆菌；优选，所述防控细菌，其应用场景为食品基质、运输及保存的过程中。4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，是蜡样芽孢杆菌噬菌体在制备抑制食品中蜡样芽孢杆菌制剂中的应用，优选是在制备抑制牛奶中蜡样芽孢杆菌制剂中的应用。5.一种防控蜡样芽孢杆菌感染的杀菌组合物，其特征在于，含有权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌噬菌体作为活性成分。6.一种检测权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌噬菌体的引物，其特征在于，包括：正向引物序列：5
′‑
aaaccattaaaccaataccaccc
–3′
；反向引物序列：5
′‑
atttgaaaacaaaggacacgaga
–3′
。7.一种检测权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌噬菌体的方法，其特征在于，包括以下步骤：提取样品的dna，然后用权利要求6所述的引物进行pcr扩增，如获得条带大小为204bp，则含有蜡样芽孢杆菌噬菌体，否则则不含有。8.一种对权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌噬菌体进行定量的qpcr检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)应用权利要求6所述的引物绘制蜡样芽孢杆菌噬菌体的标准曲线；(2)应用权利要求6所述的引物对样本进行qpcr扩增，获得样本的ct值，根据标准曲线计算该样品中含蜡样芽孢杆菌噬菌体的含量。9.一种检测权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌噬菌体的试剂盒，其特征在于，包括权利要求6所述的引物。10.用于检测权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌噬菌体的分子靶标、权利要求6所述的引物在检测权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌噬菌体中的应用，所述的分子靶标的核苷酸序列如seq id no.1所示。

技术总结
本发明公开了一株蜡样芽胞杆菌噬菌体vB_BceP_LY3及其快速检测方法和应用。蜡样芽孢杆菌噬菌体(Bacillus cereus phage vB-BceP-LY3)，菌株的保藏编号为；GDMCC No：62703-B1。本发明提供的烈性噬菌体LY3是一株全新烈性噬菌体，不存在毒力因子，能特异性裂解蜡样芽孢杆菌。潜伏期短，该噬菌体能在较短时间内增殖，更早更好的用于抵抗蜡样芽孢杆菌的污染。同时，噬菌体LY3对高温、酸碱和紫外具有较强的稳定性，对运输与保存的要求低，能够在不同条件的环境中适用，不易在应用过程中失活。该噬菌体具有较广的最佳侵染复数(MOI)，MOI从0.1～0.0001范围内都能产生最高效价噬菌体滴度，具有高效扩增特性。该噬菌体在TSB液体培养基和牛奶中对目标菌有良好抑制效果。牛奶中对目标菌有良好抑制效果。牛奶中对目标菌有良好抑制效果。


技术研发人员：杨美艳 吴清平 谭诗琳 黄士轩 张菊梅 陈谋通 李滢 叶青华 吴诗 古其会 刘振杰 林秀华
受保护的技术使用者：华南农业大学
技术研发日：2023.03.27
技术公布日：2023/7/12