一种野生型枯草芽孢杆菌JCL16多质粒基因编辑系统及其构建与应用

一种野生型枯草芽孢杆菌jcl16多质粒基因编辑系统及其构建与应用
技术领域
1.本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种野生型枯草芽孢杆菌/贝莱斯芽孢杆菌基因编辑系统及其构建与应用。


背景技术：

2.枯草芽孢杆菌属于芽孢杆菌属，为革兰氏阳性菌，它可以以芽孢形式存在，具有抗酸碱能力强、耐高温高压和储藏时间久等优点。枯草芽孢杆菌孢子是一种休眠的、坚韧的、不可繁殖的结构，它被包裹在一种复杂的、多层的蛋白质结构中，称为外衣，dna被保护在它里面。在枯草孢子可分为两个不同的被膜层，外层是b.subtilis表层的电子密集层，由cota(65kda)、cotb(59kda)、cotg(23.9kda)、cotc(11kda)和cotf(8kda)[24]五种主要多肽组成，在保护孢子免受环境破坏方面起着重要作用，并增强它们在高温、ph和湿度水平下的稳定性。到目前为止，已有几个成功的孢子展示例子，利用丰富的结构涂层蛋白cotb、cotc和cotg作为融合伙伴。
[0003]
芽孢杆菌孢子，特别是由枯草芽孢杆菌产生的芽孢，作为不同生物技术应用的细胞工具，已引起越来越多的兴趣。例如，枯草芽孢杆菌(b.subtilis)孢子已被成功地用作人和动物的益生菌，作为验证灭菌过程的生物指标，以及作为热稳定性活疫苗载体，其中目标抗原与孢子外壳蛋白基因融合或在孢子萌发后表达。尽管如此，孢子制剂与活的或灭活的营养细胞，甚至细胞碎片的污染，可能会掩盖由孢子相关抗原诱导的免疫反应。因此，在以孢子为基础的疫苗载体的发展中，高纯度的高产孢子的生产是一个必不可少的过程。
[0004]
crispr-cas9是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源dna。而crispr-cas9基因编辑技术，则是对靶向基因进行特定dna修饰的技术，这项技术也是用于基因编辑中前沿的方法。crispr/cas9系统由tracrrna、crrna和cas9蛋白组成的复合物识别pam序列并行使切割功能，不同微生物来源的crispr/cas9系统识别的pam序列存在差异，对微生物尤其是传统遗传操作较难微生物的基因组编辑，例如碱基或大片段的插入、缺失或突变等更为简单、高效和易操作；crispr/cas9以及crispra和crispri技术，在原核和真核微生物基因表达调控、代谢工程等领域具有巨大的应用潜力，如医药、食品以及工业等相关重要产品的获得。crispr/cas9基因编辑工具具有简便、高效、无需筛选标记以及阳性克隆鉴定简单等优势，能够对微生物基因组中单基因或多基因进行编辑。
[0005]
目前采用在枯草芽孢杆菌中使用crispr-cas9基因编辑系统大多为单质粒基因编辑系统和双质粒基因编辑系统，一次只能编辑一个基因，可同时编辑细菌基因组dna中多个基因的编辑系统鲜有报道，尤其是采用基因编辑系统同时实现芽孢杆菌孢子表面表达多个外源蛋白的报道未有。因此，构建一套具有同时编辑多个基因、且可连续编辑芽孢杆菌基因组dna的基因编辑系统对提高芽孢杆菌基因组的基因编辑效率具有重要意义，也为今后以芽孢杆菌孢子作为纳米展示材料研发新型生物疫苗等生物制品提供技术方法和材料。


技术实现要素：

[0006]
发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供用于一种野生型枯草芽孢杆菌多质粒基因编辑系统，该系统可以对野生型枯草芽孢杆菌jcl16的基因组进行连续编辑，实现孢子表面协同表达多个异源蛋白，提高了枯草芽孢杆菌基因组编辑效率、降低了阳性转化子筛选难度并促进了孢子表面表达技术发展。
[0007]
本发明还提供所述野生型枯草芽孢杆菌多质粒基因编辑系统的构建方法和应用。
[0008]
技术方案：为了实现上述目的，本发明所述一种野生型枯草芽孢杆菌jcl16多质粒基因编辑系统，所述基因编辑系统包括pbe-cas9穿梭质粒载体，以及ptn-cotb-yfp穿梭质粒载体、ptn-cota-rfp穿梭质粒载体和ptc-cgea-gfp穿梭质粒载体三种中的一种或者多种，其序列分别为seq id no.1-4所示。
[0009]
其中，所述穿梭质粒载体pbe-cas9以pbe为基础载体，包含大肠杆菌复制起点(ori)、枯草芽孢杆菌热敏复制起点(rep-ts)、枯草芽孢杆菌p43启动子、cas9蛋白表达框、用于大肠杆菌的筛选标记基因青霉素抗性基因(ampr)和用于芽孢杆菌筛选的红霉素抗性基因ermr。
[0010]
其中，所述穿梭质粒载体ptn-cota-rfp以ptn为基础载体，包含用于大肠杆菌的筛选标记基因青霉素抗性基因(ampr)、用于芽孢杆菌筛选的新霉素抗性基因neor、孢子蛋白表达框cota，荧光蛋白蛋白表达框rfp、大肠杆菌复制起点(ori)、枯草芽孢杆菌热敏复制起点(rep-ts)、枯草芽孢杆菌p43启动子和带有靶标序列的sgrna1。
[0011]
其中，所述穿梭质粒载体ptn-cotb-yfp以ptn为基础载体，包含用于大肠杆菌的筛选标记基因青霉素抗性基因(ampr)、用于芽孢杆菌筛选的新霉素抗性基因neor、孢子蛋白表达框cotb，荧光蛋白蛋白表达框yfp、大肠杆菌复制起点(ori)、枯草芽孢杆菌热敏复制起点(rep-ts)、枯草芽孢杆菌p43启动子和带有靶标序列的sgrna2。
[0012]
其中，所述穿梭质粒载体ptc-cgea-gfp以ptc为基础载体，包含用于大肠杆菌的筛选标记基因青霉素抗性基因(ampr)、用于芽孢杆菌筛选的氯霉素抗性基因clr、孢子蛋白表达框cgea，荧光蛋白蛋白表达框gfp、大肠杆菌复制起点(ori)、枯草芽孢杆菌热敏复制起点(rep-ts)、枯草芽孢杆菌p43启动子和带有靶标序列的sgrna3。
[0013]
其中，所述野生型枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌jcl16。
[0014]
本发明所述的野生型枯草芽孢杆菌/贝莱斯芽孢杆菌基因编辑系统的构建方法，包括如下步骤：
[0015]
(1)设计并合成符合芽孢杆菌密码子偏好性的cas9蛋白表达框p43-cas9；将p43-cas9表达框通过酶切和酶连接克隆至pbe多克隆位点，获得所述的穿梭质粒载体pbe-cas9；
[0016]
(2)设计并合成符合枯草芽孢杆菌密码子偏好性的sgrna1表达框；以孢子表面蛋白cota为靶位点，红色荧光蛋白rfp为重组表达蛋白设计并合成用于枯草芽孢杆菌孢子表面表达的同源重组片段；将设计合成的sgrna1表达框和同源重组片段进行组合依次通过酶切和酶连接克隆至ptn多克隆位点，获得所述穿梭质粒载体ptn-cota-rfp；
[0017]
(3)设计并合成符合芽孢杆菌密码子偏好性的sgrna2表达框；以孢子表面蛋白cotb为靶位点，黄色荧光蛋白yfp为重组表达蛋白设计并合成用于枯草芽孢杆菌孢子表面表达的同源重组片段；将设计合成的sgrna2表达框和同源重组片段进行组合依次通过酶切和酶连接克隆至ptn多克隆位点，获得所述穿梭质粒载体ptn-cotb-yfp；
[0018]
(4)设计并合成符合芽孢杆菌密码子偏好性的sgrna3表达框；以孢子表面蛋白cgea为靶位点，绿色荧光蛋白gfp为重组表达蛋白设计并合成用于枯草芽孢杆菌孢子表面表达的同源重组片段；将设计合成的sgrna3表达框和同源重组片段进行组合依次通过酶切和酶连接克隆至ptc多克隆位点，获得所述的芽孢杆菌基因编辑载体ptc-cgea-gfp。
[0019]
作为优选，本发明在枯草芽孢杆菌jcl16中发现表面活性素启动子(命名为p43)。该dna片段能在芽孢杆菌对数生长后期强启动cas9蛋白表达，可以进一步促进crispr-cas9系统和重组酶在芽孢杆菌基因编辑中的应用。
[0020]
本发明构建了cas9蛋白表达框(命名为p43-cas9)包括p43启动子，编码cas9蛋白基因及t1t2转录终止子，其序列分别如seq id no：5-7所示。
[0021]
本发明根据枯草芽孢杆菌孢子表面蛋白cota、cotb、cgea核酸序列设计合成了sgrna序列，所述的sgrna1，sgrna2和sgrna3序列分别如seq idno.8-10所示。
[0022]
本发明采用重叠pcr技术分别融合枯草芽孢杆菌组成性表达启动子p43和设计的sgrna1，sgrna2和sgrna3序列构建p43-sgrna1，p43-sgrna2和p43-sgrna3转录框，所述p43-sgrna1，p43-sgrna2，p43-sgrna3序列分别如seq id no.11-13所示。
[0023]
本发明根据编码芽孢杆菌孢子表面蛋白cota核酸序列和编码红色荧光蛋白rfp核酸序列设计合成了同源交换片段cota-rfp，其序列如seq id no：14所示。
[0024]
本发明根据编码芽孢杆菌孢子表面蛋白cotb核酸序列和编码黄色荧光蛋白yfp核酸序列设计合成了同源交换片段cotb-yfp，其序列如seq id no：15所示。
[0025]
本发明根据编码芽孢杆菌孢子表面蛋白cgea核酸序列和编码绿色荧光蛋白gfp核酸序列设计合成了同源交换片段cgea-gfp，其序列如seq id no.16所示序列。
[0026]
本发明将p43-sgrna1表达框和同源交换片段cota-rfp依次插入大肠杆菌芽孢杆菌穿梭质粒载体ptn的多克隆位点构建编辑枯草芽孢杆菌jcl16基因组dna的重组质粒ptn-cota-rfp，其序列如seq id no.3所示。
[0027]
本发明将p43-sgrna2表达框和同源交换片段cotb-yfp依次插入大肠杆菌芽孢杆菌穿梭质粒载体ptn的多克隆位点构建编辑枯草芽孢杆菌jcl16基因组dna的重组质粒ptn-cotb-yfp，其序列如seq id no：2所示。
[0028]
本发明将p43-sgrna3表达框和同源交换片段cgea-gfp依次插入大肠杆菌芽孢杆菌穿梭质粒载体ptc的多克隆位点构建编辑枯草芽孢杆菌jcl16基因组dna的重组质粒ptc-cgea-gfp，其序列如seq id no.4所示。
[0029]
本发明所述的大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒载体在芽孢杆菌中穿梭、共存以及进行消除中的应用。本发明所述的大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒载体在外源蛋白的表达，实现对芽孢杆菌基因组dna的编辑中的应用。
[0030]
本发明所述的野生型枯草芽孢杆菌/贝莱斯芽孢杆菌基因编辑系统在野生型枯草芽孢杆菌/贝莱斯芽孢杆菌基因组编辑，实现多基因在其孢子表面共表达中应用。
[0031]
其中，所述应用过程为：
[0032]
(1)将构建好的pbe-cas9质粒和含有荧光蛋白的ptn-cota-rfp、ptn-cotb-yfp、ptc-cgea-gfp质粒分别转入大肠杆菌感受态细胞dh5a，提取转化子；
[0033]
(2)将pbe-cas9质粒分别与ptn-cota-rfp、ptn-cotb-yfp、ptc-cgea-gfp质粒任意一种或者多种结合转入芽孢杆菌感受态；进行培养；
[0034]
(3)涂布在抗性固体平板培养基，挑选紫外灯下发荧光的菌落，再采用pcr检测筛选正确转化子；
[0035]
(4)筛选发荧光正确转化子，经过50℃高温消除多质粒；消除质粒后可以继续做转化可以用，实现连续编辑。
[0036]
本发明所用基础载体pbe、ptc、ptn含有温敏复制起点，在37℃培养条件下可稳定复制，50℃质粒无法复制而消失，解决了因质粒存在影响蛋白表达的问题，pbe、ptk、ptc出发载体基因序列见申请专利“大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒载体及其构建方法和应用(申请号202111297649.0)”。
[0037]
本发明采用了crispr-cas9基因编辑的方法，设计了特定的靶序列，可以将荧光蛋白同源双交换到特定位置，提高了基因编辑的效率；同时，本发明所构建的基因编辑体系可以将荧光蛋白替换为外源蛋白，可以对芽孢杆菌的基因组进行连续编辑，实现孢子表面协同表达多个异源蛋白。目前单独转化一个荧光蛋白表达质粒很难长出菌落或菌落较少，也不发光，本发明采用与pbe-cas9质粒共转后，cas9可以精准识别设计的靶标位点进行剪切，从而提高重组效率，从本发明的各个附图中也能看出，转化子基本都是发光的。
[0038]
本发明是一种采用枯草芽孢杆菌内源启动子表达crispr-cas9系统，辅助荧光蛋白筛选标记和枯草芽孢杆菌温敏复制起点的多质粒基因编辑系统，可用于野生型枯草芽孢杆菌表面协同表达多种异源蛋白或多肽，实现了荧光标记基因和目标基因的替换敲入。本发明的系统融合枯草芽孢杆菌p43启动子的cas9蛋白表达框构建质粒pbe-cas9；从大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒载体ptn、ptc出发，融合p43启动子、(绿色、红色、黄色)荧光蛋白表达框、枯草芽孢杆菌孢子蛋白表达框(cotb、cota、cgea)和sgrna表达框构建质粒ptn-cotb-yfp、ptc-cota-rfp、ptn-cgea-gfp，制得所述的孢子表面表达的多质粒基因组编辑系统。本发明可以精准、快速、连续对野生型枯草芽孢杆菌jcl16基因组进行编辑，实现多基因在其孢子表面共表达。
[0039]
本发明的基因组编辑系统，具有以下独特的有点：1.出发载体含有温敏复制起点，可以在后期通过高温加热的方法消除质粒，将外源蛋白与芽孢杆菌融于一体，消除了因质粒存在而带来的抗生素飘移及残留等负面影响；2.四种出发载体带有了不同的抗性基因，提高了对阳性菌株筛选的效率；3.该基因编辑系统通过组成性表达优化的cas9蛋白，设计的专一性的sgrna序列和同源臂，成功的将三种荧光蛋白整合到芽孢杆菌基因组dna中，根据pcr测序和菌落荧光分析，证明该编辑技术具有高效和精准两大特点。4.该编辑系统含有四种质粒，可同时编辑2-3个基因，含有热敏复制起点可实现连续编辑能力。总之，该基因编辑系统可快速高效的编辑野生型枯草芽孢杆菌基因，为实现益生芽孢杆菌孢子表面表达提供了技术手段和材料。
[0040]
本发明构建的基因编辑系统含有四个质粒，且带有不同的抗性基因，可以同时编辑芽孢杆菌2个以上的基因。相对于以前的单质粒基因编辑系统和双质粒基因编辑系统只能编辑一个基因，编辑效率更加高效。本发明含有热敏复制起点，四个质粒可以在编辑成功后的芽孢杆菌中经过50度高温可以实现消除，因此该基因编辑系统可以实现连续编辑芽孢杆菌基因组dna。本发明成功的实现了三个孢子蛋白分别展示不同的荧光蛋白，为芽孢杆菌孢子表面表达提供了辅助荧光筛选标记。本发明相对于先有的单质粒基因编辑系统和双质粒基因编辑系统，可以同时编辑两个基因及以上，更加高效。
[0041]
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
[0042]
1、本发明的系统出发载体含有温敏复制起点，可以在后期通过高温加热的方法消除质粒，将外源蛋白与芽孢杆菌融于一体，消除了因质粒存在而带来的抗生素飘移及残留等负面影响。
[0043]
2、本发明的系统的四种出发载体带有了不同的抗性基因，可以同时转化至芽孢杆菌，同时编辑2个以上的基因，相对于以前的单质粒基因编辑系统和双质粒基因编辑系统只能编辑一个基因，编辑效率更加高效。
[0044]
3、本发明通过通过组成性表达cas9蛋白，设计的sgrna序列和同源臂，高效的将三种荧光蛋白整合到芽孢杆菌基因组dna中，根据pcr测序和菌落荧光分析，证明该编辑技术具有高效和精准量大特点。
[0045]
4、此编辑系统可同时编辑三种基因，实现连续编辑能力，构建的重组芽孢杆菌，可以同时表达三种不同的外源蛋白，尤其是成功的实现了三个孢子蛋白分别展示不同的荧光蛋白，为芽孢杆菌孢子表面表达提供了辅助荧光筛选标记。为芽孢杆菌作为新型生物纳米材料研制生物疫苗等生物制品奠定了基础。
附图说明
[0046]
图1中a为pbe-cas9穿梭质粒载体构建过程；b为pbe-cas9质粒单双切验证核酸电泳；
[0047]
图2中a为ptn-cota-rfp穿梭质粒载体构建过程；b为ptn-cota-rfp质粒单双切验证核酸电泳；
[0048]
图3中a为ptn-cotb-yfp穿梭质粒载体构建过程；b为ptn-cotb-yfp质粒单双切验证核酸电泳；
[0049]
图4中a为ptc-cgea-gfp穿梭质粒载体构建过程；b为ptc-cgea-gfp质粒单双切验证核酸电泳；
[0050]
图5中a为ptn-cota-rfp枯草芽孢杆菌jcl16转化子平板对比；b为ptn-cota-rfp转化子单个菌株激光共聚焦oil63x物镜下；
[0051]
图6中a为ptc-cgea-gfp枯草芽孢杆菌jcl16转化子平板对比；b为ptc-cgea-gfp转化子单个菌株激光共聚焦oil63x物镜下；
[0052]
图7中a为ptn-cotb-yfp枯草芽孢杆菌jcl16转化子平板对比；b为ptn-cotb-yfp转化子单个菌株激光共聚焦oil63x物镜下；
[0053]
图8中a为不同培养时间阶段红色荧光蛋白表达变化；b为不同培养时间阶段绿色荧光蛋白表达变化。
[0054]
图9利用多质粒基因编辑系统在芽孢杆菌孢子表面协同展示三种荧光蛋白的示意图。
具体实施方式
[0055]
以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
[0056]
本发明实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂家建议的条件。
[0057]
本发明中使用的枯草芽孢杆菌jcl16(保藏编号为：cctcc no：m2018336)在先专利cn111411053a中已经公开保藏，为常规的野生型菌株由淮阴工学院提供，均由常规方法制备成枯草芽孢杆菌感受态细胞。
[0058]
本发明所用基础载体质粒pbe、质粒ptn、质粒载体ptc序列见申请专利“大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒载体及其构建方法和应用(申请号202111297649.0)”。
[0059]
实施例1
[0060]
pbe-cas9穿梭质粒载体的构建
[0061]
(1)以枯草芽孢杆菌(jcl16)基因组为模板，设计apap43f1/p43casr1为上下引通过普通pcr技术扩增枯草芽孢杆菌p43启动子(seq id no.5)；以设计合成的具有枯草芽孢杆菌密码子偏好性的cas9蛋白基因为模板，设计cas9f/cas9r为上下引扩增cas9基因(seq id no.6)；其中引物p43casr1和cas9r分别带有p43启动子下游正反向同源臂片段，将p43启动子和cas9基因的pcr产物纯化回收，通过重叠pcr融合构建p43-cas9(seq id no.17)；设计并合成t1t2带有cas9下游同源臂片段的转录终止子(seq id no.7)，利用同源重组酶将t1t2与p43-cas9融合，组建p43-cas9-t1t2片段(seq idno.18)，将片段p43-cas9-t1t2和基础载体pbe同时使用apa i/xho i进行双酶切，将两段酶切产物与t4连接酶混合，16℃恒温过夜连接，将连接产物转化入大肠杆菌dh5
ɑ
感受态细胞中，然后涂布于含有100mg/l氨苄青霉素抗性平板37℃过夜培养，筛选构建质粒pbe-cas9，筛选重组子，经酶切初步验证正确，参见图1所示，并送生物公司测序，其序列如seq id no.1所示。
[0062]
实施例2
[0063]
荧光蛋白表达质粒ptn-cota-rfp的构建
[0064]
(1)以枯草芽孢杆菌jcl16基因组为模板，设计p43bsf1/p43bsr1为上下引通过普通pcr技术扩增枯草芽孢杆菌p43启动子(seq id no.5)；将p43启动子与设计合成的带有p43片段下游同源臂片段的sgrna1基因序列(seq idno.8)通过同源重组酶融合在一起，组建带有cota靶标序列的p43-sgrna1(seq id no.11)，将片段p43-sgrna1表达框和基础载体ptn同时使用bamh i/xba i进行双酶切，将两段酶切产物与t4连接酶混合，16℃恒温过夜连接，将连接产物转化入大肠杆菌dh5
ɑ
感受态细胞中，然后涂布于含有100mg/l氨苄青霉素抗性平板37℃过夜培养，筛选构建质粒ptn-sgrna1。
[0065]
(2)以枯草芽孢杆菌jcl16基因组为模板，设计引物cotauf/cotaur和cotadf/cotadr通过普通pcr技术扩增cota蛋白的上游与下游；设计并合成具有枯草芽孢杆菌密码子偏好性的红色荧光蛋白基因片段且带有cota蛋白上下游同源臂片段，用同源重组酶将cota蛋白上下游及红色荧光蛋白rfp基因片段融合组建cota-rfp孢子表面表达荧光蛋白同源重组片段(seq id no.14)，将ptn-sgrna1表达框和cota-rfp同源重组表达框同时使用xba i/xho i进行双酶切，将两段酶切产物与t4连接酶混合，16℃恒温过夜连接，将连接产物转化入大肠杆菌dh5
ɑ
感受态细胞中，然后涂布于含有100mg/l氨苄青霉素抗性平板37℃过夜培养，筛选重组子，经酶切初步验证正确，参见图2所示，并送生物公司测序，质粒ptn-cota-rfp其序列如seq id no.3所示。
[0066]
实施例3
[0067]
荧光蛋白表达质粒ptn-cotb-yfp的构建
[0068]
(1)以枯草芽孢杆菌jcl16基因组为模板，设计p43bsf1/p43bsr2为上下引通过普
通pcr技术扩增枯草芽孢杆菌p43启动子(seq id no.5)；将p43启动子与设计合成的带有p43片段下游同源臂片段的sgrna2基因序列(seq idno.9)通过同源重组酶融合在一起，组建带有cotb靶标序列的p43-sgrna2(seq id no.12)，将片段p43-sgrna2表达框和基础载体ptn同时使用bamh i/xba i进行双酶切，将两段酶切产物与t4连接酶混合，16℃恒温过夜连接，将连接产物转化入大肠杆菌dh5
ɑ
感受态细胞中，然后涂布于含有100mg/l氨苄青霉素抗性平板37℃过夜培养，筛选构建质粒ptn-sgrna2。
[0069]
(2)以枯草芽孢杆菌jcl16基因组为模板，设计引物cotbuf/cotbur和cotbdf/cotbdr通过普通pcr技术扩增cotb蛋白的上游与下游；设计并合成具有枯草芽孢杆菌密码子偏好性的黄色荧光蛋白基因片段且带有cotb蛋白上下游同源臂片段，用同源重组酶将cotb蛋白上下游及黄色荧光蛋白yfp基因片段融合组建cotb-yfp孢子表面表达荧光蛋白同源重组片段(seq id no.15)，将ptn-sgrna2表达框和cotb-yfp同源重组表达框同时使用xba i/xho i进行双酶切，将两段酶切产物与t4连接酶混合，16℃恒温过夜连接，将连接产物转化入大肠杆菌dh5
ɑ
感受态细胞中，然后涂布于含有100mg/l氨苄青霉素抗性平板37℃过夜培养，筛选重组子，经酶切初步验证正确，参见图3所示，并送生物公司测序，质粒ptn-cotb-yfp其序列如seq id no.2所示。
[0070]
实施例4
[0071]
荧光蛋白表达质粒ptc-cgea-gfp的构建
[0072]
(1)以枯草芽孢杆菌jcl16基因组为模板，设计p43bsf1/p43bsr3为上下引通过普通pcr技术扩增枯草芽孢杆菌p43启动子(seq id no.5)；将p43启动子与设计合成的带有p43片段下游同源臂片段的sgrna3基因序列(seq idno.10)通过同源重组酶融合在一起，组建带有cgea靶标序列的p43-sgrna3(seq id no.13)，将片段p43-sgrna3表达框和基础载体ptc同时使用bamh i/xba i进行双酶切，将两段酶切产物与t4连接酶混合，16℃恒温过夜连接，将连接产物转化入大肠杆菌dh5
ɑ
感受态细胞中，然后涂布于含有100mg/l氨苄青霉素抗性平板37℃过夜培养，筛选构建质粒ptc-sgrna3。
[0073]
(2)以枯草芽孢杆菌jcl16基因组为模板，设计引物cgeauf/cgeaur和cgeadf/cgeadr通过普通pcr技术扩增cgea蛋白的上游与下游；设计并合成具有枯草芽孢杆菌密码子偏好性的绿色荧光蛋白基因片段且带有cgea蛋白上下游同源臂片段，用同源重组酶将cgea蛋白上下游及绿色荧光蛋白gfp基因片段融合组建cgea-gfp孢子表面表达荧光蛋白同源重组片段(seq idno.16)，将ptc-sgrna3表达框和cgea-gfp同源重组表达框同时使用xba i/xho i进行双酶切，将两段酶切产物与t4连接酶混合，16℃恒温过夜连接，将连接产物转化入大肠杆菌dh5
ɑ
感受态细胞中，然后涂布于含有100mg/l氨苄青霉素抗性平板37℃过夜培养，筛选重组子，经酶切初步验证正确，参见图4所示，并送生物公司测序，其序列如seq id no.4所示。
[0074]
实施例1-4所用引物序列，如表1所示。
[0075]
表1引物序列
[0076][0077]
注：引入的酶切位点用下划线标出。
[0078]
实施例5
[0079]
枯草芽孢杆菌jcl16感受态细胞制备
[0080]
将低温保存于甘油中的枯草芽抱杆菌jcl16划线接种于lb固体培养基，37℃培养12h；挑单菌落接种于新鲜、预热的spⅰ肉汤培养基中(20ml)，调整菌体浓度，使菌体od
600
值约为0.5；恒温水浴振荡培养(37℃，180r/min)，每间隔30min测定一次od值，取对数生长期的菌液2ml接种于200ml预热的spⅱ培养基中，在恒温水浴振荡器中继续培养(37℃，180r/min)90min，8000r离心5min收集菌体沉淀；取1.8ml上清液轻轻重悬菌体沉淀，此时的枯草芽抱杆菌己呈感受态状态可直接用于转化，100μl小份分装，-80℃保存。所用培养基如表2
所示。
[0081]
表2芽孢杆菌转化培养基
[0082][0083]
实施例6
[0084]
枯草芽孢杆菌jcl16孢子蛋白cota表面展示红色荧光蛋白
[0085]
取一支实例5中制备的100ul枯草芽孢杆菌感受态细胞放冰上融化5min，将纯化的红色荧光蛋白质粒ptn-cota-rfp和质粒pbe-cas9各取10ul(2ug左右)加入感受态细胞中，并加入10ul 100x egta，加入1ml lb无菌放入37℃摇床100rpm慢摇30min后提高转速至200rpm，振荡培养1.5h后收集菌体，留取150ul培养基上清重悬沉淀并涂布于红霉素erm
r 10ug/ml和硫酸新霉素neo
r 10ug/ml双抗lb平板，37℃温箱静置培养24-48h，平板在紫外光下可观察到红色荧光单菌落，且在激光共聚焦显微镜下可看到单个红色枯草芽孢杆菌，说明双质粒基因编辑系统成功运行，红色荧光蛋白成功表达在枯草芽孢杆菌孢子蛋白cota表面；如图5所示，同时采用pcr检测证明转化子成功导入，得到正确的重组菌株。
[0086]
实施例7
[0087]
枯草芽孢杆菌jcl16孢子蛋白cotb表面展示黄色荧光蛋白
[0088]
取一支实施例5中制备的100ul枯草芽孢杆菌感受态细胞放冰上融化5min，将纯化的黄色荧光蛋白质粒ptn-cotb-yfp和质粒pbe-cas9各取10ul(2ug左右)加入感受态细胞中，并加入10ul 100x egta，加入1mllb无菌放入37℃摇床100rpm慢摇30min后提高转速至200rpm，振荡培养1.5h后收集菌体，留取150ul培养基上清重悬沉淀并涂布于红霉素erm
r 10ug/ml和硫酸新霉素neo
r 10ug/ml双抗lb平板，37℃温箱静置培养24-48h，平板在紫外光下可观察到黄色荧光单菌落，且在激光共聚焦显微镜下可看到单个红色枯草芽孢杆菌，说明双质粒基因编辑系统成功运行，黄色荧光蛋白成功表达在枯草芽孢杆菌孢子蛋白cotb表面；如图6所示，同时采用pcr检测证明转化子成功导入，得到正确的重组菌株。实施例8
[0089]
枯草芽孢杆菌jcl16孢子蛋白cgea表面展示绿色荧光蛋白
[0090]
取一支实施例5中制备的100ul枯草芽孢杆菌感受态细胞放冰上融化5min，将纯化
的绿色荧光蛋白质粒ptc-cgea-gfp和质粒pbe-cas9各取10ul(2ug左右)加入感受态细胞中，并加入10ul 100x egta，加入1mllb无菌放入37℃摇床100rpm慢摇30min后提高转速至200rpm，振荡培养1.5h后收集菌体，留取150ul培养基上清重悬沉淀并涂布于红霉素erm
r 10ug/ml和氯霉素cl
r 12.5ug/ml双抗lb平板，37℃温箱静置培养24-48h，平板在紫外光下可观察到绿色荧光单菌落，且在激光共聚焦显微镜下可看到单个红色枯草芽孢杆菌,说明双质粒基因编辑系统成功运行，绿色荧光蛋白成功表达在枯草芽孢杆菌孢子蛋白cgea表面；如图7所示，同时采用pcr检测证明转化子成功导入，得到正确的重组菌株。。
[0091]
实施例9
[0092]
探索不同时间段荧光表达情况
[0093]
挑取发光单菌落(实施例6和8的红色荧光和绿色荧光)分别于红霉素ermr10ug/ml和硫酸新霉素neo
r 10ug/ml双抗液体lb培养基或红霉素erm
r 10ug/ml和氯霉素cl
r 12.5ug/ml双抗液体lb培养基中，37℃180rpm下培养，分别在培养12h、24h、36h、48h、60h、72h、六个时间段收集菌体，先用2mg/ml溶菌酶37℃处理30min左右，随后依次用50mm tris-hcl(ph＝7.0)、1m nacl、1m kcl洗涤菌体各三次，最后将处理过的菌体使用无菌水重悬，稀释到10-4
时涂于载玻片上，待菌体即将风干时盖上盖玻片放于激光共聚焦显微镜下观察并记录，可发现枯草芽孢杆菌孢子表面表达荧光蛋白在培养24h时开始表达，48h左右表达量达到最大，60h开始细胞瓦解，荧光蛋白表达量开始逐渐下降，即48h为枯草芽孢杆菌孢子表面表达最优培养时间，如图8所示。
[0094]
实施例10
[0095]
枯草芽孢杆菌孢子蛋白同时展示2-3中荧光蛋白
[0096]
将红色荧光蛋白质粒ptn-cota-rfp、黄色荧光蛋白质粒ptn-cotb-yfp和绿色荧光蛋白质粒ptc-cgea-gfp各取20ul(4ug)俩俩混合，或者三者混合，然后与pbe-cas910ul(2ug)混合。加入实施例5中制备的100ul感受态细胞中，并加入10ul 100x egta，加入1mllb无菌放入37℃摇床100rpm慢摇30min后提高转速至200rpm，振荡培养1.5h后收集菌体，留取150ul培养基上清重悬沉淀并涂布于相应的含有双抗或者三抗的lb平板(红霉素erm
r 10ug/ml，clr12.5ug/ml和硫酸新霉素neo
r 10ug/ml)，37℃温箱静置培养24-48h，平板在紫外光下可观察到绿色、黄色和红色荧光单菌落，且在激光共聚焦显微镜下分别观测绿色、红色和黄色枯草芽孢杆菌，说明多质粒基因编辑系统成功运行，可以同时编辑2-3个基因，基因编辑的效率见表3，转化示意图如图9所示。
[0097]
表3多质粒基因编辑系统同时编辑2-3个基因的编辑效率
[0098][0099]
相对于传统的单质粒编辑系统和双质粒编辑系统只能编辑单个基因，本发明采用多质粒编辑系统，可以在枯草芽孢杆菌jcl16中同时编辑2-3个基因。另外，采用该基因编辑系统，实现了三个荧光蛋白在野生型芽孢杆菌jcl16孢子表面协同表达。本发明还采用了温敏复制起点，多个质粒可以在编辑成功后的基因工程菌株中消除，然后可进行连续编辑。本发明的系统实现了在同一个芽孢杆菌表面同时表达三个蛋白，为后期利用荧光蛋白标记，开发芽孢杆菌孢子作为新型纳米材料比如展示抗原开发多口服疫苗等生物制品提供了成熟的技术方法和材料。

技术特征：
1.一种野生型枯草芽孢杆菌多质粒基因编辑系统，其特征在于，所述基因编辑系统包括pbe-cas9穿梭质粒载体，以及ptn-cotb-yfp穿梭质粒载体、ptn-cota-rfp穿梭质粒载体和ptc-cgea-gfp穿梭质粒载体三种中的任一一种或者多种，其序列分别为seq id no.1-4所示。2.根据权利要求1所述的野生型枯草芽孢杆菌多质粒基因编辑系统，其特征在于，所述穿梭质粒载体pbe-cas9以pbe为基础载体，包含大肠杆菌复制起点(ori)、枯草芽孢杆菌热敏复制起点(rep-ts)、枯草芽孢杆菌p43启动子、cas9蛋白表达框、用于大肠杆菌的筛选标记基因青霉素抗性基因(ampr)和用于芽孢杆菌筛选的红霉素抗性基因ermr。3.根据权利要求1所述的野生型枯草芽孢杆菌多质粒基因编辑系统，其特征在于，所述穿梭质粒载体ptn-cota-rfp以ptn为基础载体，包含用于大肠杆菌的筛选标记基因青霉素抗性基因(ampr)、用于芽孢杆菌筛选的新霉素抗性基因neor、孢子蛋白表达框cota，荧光蛋白蛋白表达框rfp、大肠杆菌复制起点(ori)、枯草芽孢杆菌热敏复制起点(rep-ts)、枯草芽孢杆菌p43启动子和带有靶标序列的sgrna1。4.根据权利要求1所述的野生型枯草芽孢杆菌多质粒基因编辑系统，其特征在于，所述穿梭质粒载体ptn-cotb-yfp以ptn为基础载体，包含用于大肠杆菌的筛选标记基因青霉素抗性基因(ampr)、用于芽孢杆菌筛选的新霉素抗性基因neor、孢子蛋白表达框cotb，荧光蛋白蛋白表达框yfp、大肠杆菌复制起点(ori)、枯草芽孢杆菌热敏复制起点(rep-ts)、枯草芽孢杆菌p43启动子和带有靶标序列的sgrna2。5.根据权利要求1所述的野生型枯草芽孢杆菌多质粒基因编辑系统，其特征在于，所述穿梭质粒载体ptc-cgea-gfp以ptc为基础载体，包含用于大肠杆菌的筛选标记基因青霉素抗性基因(ampr)、用于芽孢杆菌筛选的氯霉素抗性基因clr、孢子蛋白表达框cgea，荧光蛋白蛋白表达框gfp、大肠杆菌复制起点(ori)、枯草芽孢杆菌热敏复制起点(rep-ts)、枯草芽孢杆菌p43启动子和带有靶标序列的sgrna3。6.根据权利要求1所述的野生型枯草芽孢杆菌多质粒基因编辑系统，其特征在于，所述芽孢杆菌优选为枯草芽孢杆菌jcl16。7.一种权利要求1所述的野生型枯草芽孢杆菌多质粒基因编辑系统的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)设计并合成符合芽孢杆菌密码子偏好性的cas9蛋白表达框p43-cas9；将p43-cas9表达框通过酶切和酶连接克隆至pbe多克隆位点，获得所述的穿梭质粒载体pbe-cas9；(2)设计并合成符合枯草芽孢杆菌密码子偏好性的sgrna1表达框；以孢子表面蛋白cota为靶位点，红色荧光蛋白rfp为重组表达蛋白设计并合成用于枯草芽孢杆菌孢子表面表达的同源重组片段；将设计合成的sgrna1表达框和同源重组片段进行组合依次通过酶切和酶连接克隆至ptn多克隆位点，获得所述穿梭质粒载体ptn-cota-rfp；(3)设计并合成符合芽孢杆菌密码子偏好性的sgrna2表达框；以孢子表面蛋白cotb为靶位点，黄色荧光蛋白yfp为重组表达蛋白设计并合成用于枯草芽孢杆菌孢子表面表达的同源重组片段；将设计合成的sgrna2表达框和同源重组片段进行组合依次通过酶切和酶连接克隆至ptn多克隆位点，获得所述穿梭质粒载体ptn-cotb-yfp；(4)设计并合成符合芽孢杆菌密码子偏好性的sgrna3表达框；以孢子表面蛋白cgea为靶位点，绿色荧光蛋白gfp为重组表达蛋白设计并合成用于枯草芽孢杆菌孢子表面表达的
同源重组片段；将设计合成的sgrna3表达框和同源重组片段进行组合依次通过酶切和酶连接克隆至ptc多克隆位点，获得所述的芽孢杆菌基因编辑载体ptc-cgea-gfp。8.一种权利要求1所述的野生型枯草芽孢杆菌多质粒基因编辑系统在野生型枯草芽孢杆菌jcl16基因组编辑，实现多基因在其孢子表面共表达中应用。9.根据权利8所述的应用，其特征在于，所述应用过程为：(1)将构建好的pbe-cas9质粒和含有荧光蛋白的ptn-cota-rfp、ptn-cotb-yfp、ptc-cgea-gfp质粒分别转入大肠杆菌感受态细胞dh5a，大批量扩增提取质粒；(2)将提取的pbe-cas9质粒分别与ptn-cota-rfp、ptn-cotb-yfp、ptc-cgea-gfp质粒任意一种或者多种转入芽孢杆菌感受态；进行培养；(3)涂布在抗性固体平板培养基，挑选紫外灯下发荧光的菌落，再采用pcr检测筛选正确转化子；(4)筛选发荧光正确转化子，经过高温消除多质粒可以用于连续转化编辑。

技术总结
本发明公开了一种野生型枯草芽孢杆菌基因编辑系统及其构建与应用，所述基因编辑系统包括PBE-Cas9穿梭质粒载体，以及PTN-CotB-YFP穿梭质粒载体、pTN-CotA-RFP穿梭质粒载体和pTC-CgeA-GFP穿梭质粒载体三种中的任一一种或者多种，其序列分别为SEQ ID NO.1-4所示。本发明的多质粒基因编辑系统可以同时编辑野生型枯草芽孢杆菌JCL16基因组中2-3个基因，具有连续、精准和快速的基因编辑能力，采用该基因编辑系统实现多个荧光蛋白基因在野生型枯草芽孢杆菌JCL16孢子表面协同共表达。本发明为以枯草芽孢杆菌孢子作为纳米载体研发新型生物疫苗等生物制品提供基因编辑技术和材料。物疫苗等生物制品提供基因编辑技术和材料。物疫苗等生物制品提供基因编辑技术和材料。


技术研发人员：罗楚平 张双玉 李彬 朱桃 王小花 田宝霞 罗科程 李相前 朱晓文 谷晓红
受保护的技术使用者：江苏省农业科学院
技术研发日：2022.12.30
技术公布日：2023/7/12