一种肢端型黑色素瘤诊疗标志物组合及其应用

1.本发明属于生物医药技术领域，特别涉及一种肢端型黑色素瘤诊疗标志物组合及其应用。


背景技术：

2.肢端型黑色素瘤是一种起源于肢端部位黑色素细胞的原发性恶性皮肤肿瘤。肢端型黑色素瘤是我国主要的致死性皮肤恶性肿瘤，尽管恶性黑色素瘤的发病率较低，但每年新增恶性黑色素瘤患者约20000人，且发病人数以每年3％到5％的速度增长，是全球增速最快的恶性肿瘤。相较于其它黑色素瘤亚型，肢端型黑色素瘤原发灶的发现时期更晚，预后更差，社会危害性极大。手术切除是肢端型黑色素瘤的主要治疗方式，而包括大剂量干扰素治疗、化疗、免疫治疗等在内的其它治疗方案的临床有效率低，患者术后五年生存率仅为65％。因此，肢端型黑色素瘤亟需新的诊断和治疗策略，鉴定适用于肢端型黑色素瘤的诊疗标志物是目前亟需克服的关键瓶颈。
3.肿瘤免疫微环境在塑造肿瘤表型、影响肿瘤侵袭和促进肿瘤转移等方面具有重要作用。然而，肢端型黑色素瘤由于发病率低、样本收集困难等原因，其免疫微环境没有被深入研究。目前基于免疫微环境的肢端型黑色素瘤的分子诊疗标志物有限，亟待寻找更多的分子标志物，为肢端型黑色素瘤的临床诊疗提供参考，为肢端型黑色素瘤患者的治疗带来希望。


技术实现要素：

4.针对目前肢端型黑色素瘤缺乏有效的肿瘤诊疗标志物的问题，本发明的目的在于提供一种肢端型黑色素瘤诊疗标志物组合及其应用，所述的诊疗标志物组合可用于制备评估肿瘤恶性程度、预测患者预后和靶向治疗的制品；所述的肿瘤诊疗标志物组合包括apoe和cd163基因及其表达产物。
5.本发明的目的是这样实现的：
6.本发明的第一方面提供了一种肢端型黑色素瘤诊疗标志物组合，所述肢端型黑色素瘤诊疗标志物组合为apoe和cd163。
7.进一步的，所述标志物组合为rna或其逆转录的cdna，或蛋白质。
8.本发明的第二方面提供了所述标志物组合在制备评估肢端型黑色素瘤恶性程度、预测患者预后和靶向治疗制品中的应用，其中，所述制品中利用定量试剂检测apoe和cd163基因的表达量改变，从而评估肢端型黑色素瘤恶性程度、预测患者预后和靶向治疗。所述的apoe和cd163的rna表达量和蛋白质表达量的改变，这些检测指标可以单独使用，也可以组合使用。
9.进一步的，所述应用中包括：
10.s1，联合利用apoe和cd163基因及其产物的表达来对肢端型黑色素瘤进行恶性程度和患者预后判断；
11.s2，apoe联合cd163基因及其产物后与其它潜在指标联合后用来对肢端型黑色素瘤进行恶性程度和患者预后判断。
12.进一步的，所检测的样本为：肢端型黑色素瘤组织；所述定量试剂的范围包括：基因表达的rna、其逆转录得到的cdna、以及蛋白水平；所用的检测方法涉及：rt-pcr、荧光定量pcr、mrna sequencing、mrnaarray检测技术、免疫组化、免疫荧光、western blot、elisa、流式细胞术检测、免疫学检测、化学法检测。所述rt-pcr包括普通pcr、荧光定量pcr、巢式pcr、多重pcr、数字pcr等。
13.本发明的第三方面提供了一种用于评估肢端型黑色素瘤的试剂盒，所述试剂盒包含检测上述标志物组合表达量的定量试剂。
14.本发明的第四方面提供了一种用于评估肢端型黑色素瘤恶性程度和患者预后的装置，所述装置包括检测装置、分析装置和结果输出装置；
15.检测装置：用于检测样本中上述标志物组合的表达量，所述样本为肢端型黑色素瘤组织；
16.分析装置：基于所述标志物组合的表达量，评估肢端型黑色素瘤的恶性程度和患者预后；
17.结果输出装置：用于输出分析装置得到的结果，所述分析包括肢端型黑色素瘤的恶性程度分析和患者预后分析。
18.进一步的，所述检测装置采用的试剂包括基因表达的rna、其逆转录得到的cdna、以及蛋白水平检测试剂；所用的检测方法涉及：rt-pcr、荧光定量pcr、mrna sequencing、mrnaarray检测技术、免疫组化、免疫荧光、western blot、elisa、流式细胞术检测、免疫学检测、化学法检测。
19.本发明的第五方面提供了抑制所述标志物组合表达的药物在制备治疗肢端型黑色素瘤的药物组合物中的应用，抑制所述标志物组合表达的药物包括：
20.s1，联合抑制apoe和cd163基因的转录、或表达、或功能的试剂或化合物；
21.s2，联合抑制apoe和cd163基因与其它潜在指标的转录、或表达、或功能的试剂或化合物。
22.本发明的第六方面提供了一种治疗或预防肢端型黑色素瘤的药物组合物包含：药学有效量的针对apoe和cd163的抑制剂或结合其蛋白产物的抗体/免疫学活性片段，还包含药剂学上能接受的载体。
23.本发明的优点和有益效果是：
24.1、本发明首次发现apoe和cd163的表达量改变在肢端型黑色素瘤的诊断预后和治疗方面具有重要作用，可以作为肢端型黑色素瘤的诊疗标志物；
25.2、目前临床上使用肿瘤的侵袭深度作为评估肢端型黑色素瘤恶性程度和患者预后的指标，这一指标与肿瘤的发病时间密切相关，通常病程越长，肿瘤的侵袭深度越深。因此，肿瘤的侵袭深度这一指标缺乏在早期分辨恶性肿瘤的能力。与肿瘤的侵袭深度相比，本发明以apoe和cd163的表达量改变反映了肿瘤及其所处微环境的内在特性，可以简便精确判断肢端型黑色素瘤的恶性程度和患者预后，进一步的，可以分辨出早期的高恶性程度和不良预后的肢端型黑色素瘤，提供早期干预肢端型黑色素瘤的可能；
26.3、目前临床上使用的肿瘤的侵袭深度这一指标不具有可靶向治疗的特性，与之相
比，apoe和cd163基因可以作为治疗靶点，具有可成药性，以apoe和cd163基因为诊疗标志物的靶向疗法为肢端型黑色素瘤的治疗提供了新的方向，对于肢端型黑色素瘤的诊疗具有重大的应用推广价值。
附图说明
27.下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
28.图1为高通量转录组测序结果：apoe在不同肢端型黑色素瘤患者中的表达及表达量与患者术后预后间的关系。其中，(a)不同肢端型黑色素瘤患者分组中apoe的表达量；(b)apoe表达量高低可以有效地将不同预后的患者区分开。
29.图2为高通量转录组测序结果：cd163在不同肢端型黑色素瘤患者中的表达及表达量与患者术后预后间的关系。其中，(a)不同肢端型黑色素瘤患者分组中cd163的表达量；(b)cd163表达量高低可以有效地将不同预后的患者区分开。
30.图3为高通量转录组测序结果：结合apoe和cd163的表达量预测肢端型黑色素瘤患者预后结果的能力。其中，(a)结合apoe和cd163的表达量可以有效地将不同预后的患者区分开；(b)结合apoe和cd163的表达量比任何单一基因具有更好的预测效果。
31.图4为免疫组化结果：apoe在不同肢端型黑色素瘤患者中的染色结果及其与肢端型黑色素瘤患者术后预后间的关系。其中，(a)apoe在肢端型黑色素瘤患者中的染色情况；(b)apoe染色结果可以有效地将不同预后的患者区分开。
32.图5为免疫组化结果：cd163在不同肢端型黑色素瘤患者中的染色结果及其与肢端型黑色素瘤患者术后预后间的关系。其中，(a)cd163在肢端型黑色素瘤患者中的染色情况；(b)cd163染色结果可以有效地将不同预后的患者区分开。
33.图6为免疫组化结果：apoe和cd163在不同肢端型黑色素瘤患者中的染色结果及其与肢端型黑色素瘤患者术后预后间的关系。结合apoe和cd163的染色结果可以有效地将不同预后的患者区分开。
具体实施方式
34.实施例1——人肢端型黑色素瘤肿瘤组织的apoe基因的高通量测序及分析
35.收集62例肢端型黑色素瘤原发灶病例组织，提取rna，通过qubit 3荧光定量仪测定所提取的rna的浓度和纯度，使用毛细管电泳仪判定所提取rna样品的质量是否合格，从而判断是否可以用于进一步的高通量建库测序及转录组分析。
36.测序平台为illumina公司的novaseq平台，进行高通量转录组测序，本实施例利用fastqc软件对测序数据进行质量评估。之后使用star软件将测序结果比对到参考基因组并使用rsem软件进行基因表达定量。根据得到的apoe的tpm值，将62例患者分为高表达和低表达两组，进一步的，生存分析显示高表达apoe组的患者术后无进展生存时间显著短于低表达apoe组的患者(具体见图1)。
37.实施例2——人肢端型黑色素瘤肿瘤组织的cd163基因的高通量测序及分析
38.通过与实施例1相同的分析方法，本实施例将62例肢端型黑色素瘤患者按照cd163基因的表达量分为两组，分析结果显示：高表达cd163组的患者术后无进展生存时间显著短于低表达cd163组的患者(具体见图2)。
39.实施例3——人肢端型黑色素瘤肿瘤组织的apoe和cd163基因的高通量测序及分析
40.通过与实施例1相同的分析方法，本实施例将62例肢端型黑色素瘤患者按照apoe和cd163基因的表达量的平均值分为两组，研究结果表明：将apoe和cd163的高通量转录组测序结果相结合，可以有效地区分不同生存预期的肢端型黑色素瘤患者(具体见图3)，并且可以提高对肿瘤恶性程度及预后评估的灵敏度和特异度(具体见表1)。
41.表1.apoe和cd163的高通量转录组测序结果分析肢端型黑色素瘤患者术后进展
[0042][0043]
实施例4
[0044]
本实施例进行了人肢端型黑色素瘤肿瘤组织的apoe免疫组化染色及分析，具体方法为：
[0045]
一、材料和方法
[0046]
1.材料
[0047]
收集67例人肢端型黑色素瘤组织，对其进行编号。
[0048]
2.方法
[0049]
将临床新鲜组织样本用4％多聚甲醛固定24h以上，之后将组织修理平整后放入脱水盒在梯度酒精中进行脱水。脱水浸蜡后再包埋机内完成包埋，之后将蜡块置于石蜡切片机上切成4μm的组织切片。
[0050]
在室温下对组织切片脱蜡并用梯度酒精进行水化，然后配制抗原修复液在加热条件下完成抗原修复。用免疫组化笔圈出包含组织的反应空间，在圈出的反应空间中滴加3％过氧化氢，室温孵育10分钟，然后加入封闭液封闭非特异性位点。与apoe抗体(abcam)(一抗)4℃孵育过夜，pbst洗涤三次，二抗室温孵育20分钟，pbst洗涤三次。每张片子滴加2滴dab溶液用来显色，在显微镜下观察至染色合适时取下玻片放入水中终止反应。滴加苏木素复染3分钟，自来水冲洗，用盐酸酒精分化2至3秒后立刻置于氨水中反蓝。反蓝结束后用梯度酒精脱水，晾干片子后滴加二甲苯和中性树脂封片，静置晾干后即可观察结果。
[0051]
对于每一例样本，同时对至少连续两张切片进行染色，其中至少一张为阴性对照，即用缓冲液代替一抗，其余步骤与上述步骤完全相同，以用作实验阴性对照，提高实验结果判断准确性。
[0052]
二、实验结果
[0053]
根据样本染色情况，将所有样本分为apoe染色阳性和染色阴性两组，生存分析结果显示：与apoe染色阴性的肢端型黑色素瘤患者相比，apoe染色阳性的患者预后较差，生存期更短；用apoe染色可以将具有不同术后生存结局的肢端型黑色素瘤患者区分开；用apoe染色结果对患者预后评估的效率好，灵敏度高，特异性较好(具体见图4)。
[0054]
实施例5
[0055]
本实施例进行了人肢端型黑色素瘤肿瘤组织的apoe免疫组化染色及分析，所用材
料及方法均与实施例4相同，区别在于本实施例对每例样本进行cd163的染色。
[0056]
根据样本染色情况，将所有样本分为cd163染色阳性和染色阴性两组，生存分析结果显示：与cd163染色阴性的肢端型黑色素瘤患者相比，cd163染色阳性的患者预后较差，生存期更短；用cd163染色可以将具有不同术后生存结局的肢端型黑色素瘤患者区分开；用cd163染色结果对患者预后评估的效率好，灵敏度高(具体见图5)。
[0057]
实施例6
[0058]
本实施例进行了人肢端型黑色素瘤肿瘤组织的apoe和cd163免疫组化染色及分析，所用材料及方法均与实施例4相同，区别在于本实施例对每例样本进行apoe和cd163的染色。
[0059]
根据样本染色情况，将所有样本分为apoe和cd163染色双阳以及其它染色情况两组，生存分析结果显示：与其它染色情况组相比，apoe和cd163染色双阳组的患者预后更差，生存期更短(具体见图6)；将apoe染色与cd163染色相结合，可以提高对肿瘤恶性程度及术后预后评估的特异度，优于任何单一指标(具体见表2)。
[0060]
表2.apoe和cd163的免疫组化染色结果分析肢端型黑色素瘤患者术后进展
[0061][0062]
实施例7
[0063]
本实施例提供了一种用于评估肢端型黑色素瘤的试剂盒，所述试剂盒包含检测标志物组合apoe和cd163表达量的定量试剂。该试剂盒包含apoe和cd163的rna的上、下游引物。利用本实施例所述试剂盒结合常用的rna提取试剂以及反转录试剂，可以特异性地检测样本中apoe和cd163的表达量，可以精确判断肢端型黑色素瘤的恶性程度和患者预后。
[0064]
可以在肢端型黑色素瘤患者进行手术或者病灶穿刺、切取活检取得肢端型黑色素瘤组织后即刻测定。
[0065]
实施例8
[0066]
本实施例提供了一种用于评估肢端型黑色素瘤恶性程度和患者预后的装置，所述装置包括检测装置、分析装置和结果输出装置。
[0067]
检测装置：用于检测样本中标志物组合apoe和cd163的表达量，所述样本为肢端型黑色素瘤组织；采用的试剂为rt-pcr定量试剂，包括apoe和cd163的上、下游引物。
[0068]
分析装置：基于所述标志物组合apoe和cd163的表达量，评估肢端型黑色素瘤的恶性程度和患者预后。
[0069]
结果输出装置：用于输出分析装置得到的结果，所述分析包括肢端型黑色素瘤的恶性程度分析和患者预后分析。
[0070]
实施例9
[0071]
本实施例提供了抑制所述标志物组合表达的药物在制备治疗肢端型黑色素瘤的药物组合物中的应用，抑制所述标志物组合表达的药物包括：
[0072]
s1，联合抑制apoe和cd163基因的转录、或表达、或功能的试剂或化合物；
[0073]
s2，联合抑制apoe和cd163基因与其它潜在指标的转录、或表达、或功能的试剂或化合物。
[0074]
实施例10
[0075]
本实施例提供了一种治疗或预防肢端型黑色素瘤的药物组合物包含：药学有效量的针对apoe和cd163的抑制剂或结合其蛋白产物的抗体/免疫学活性片段，还包含药剂学上能接受的载体。
[0076]
所述药剂学上能接受的载体为在制剂时通常利用的载体，该载体包含乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯橡胶、磷酸钙、藻酸盐、凝胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、丙基羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁及矿物油等，但并非局限于此。
[0077]
所述药物组合物除了上述成分以外还可以包含润滑剂、湿润剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂等。药剂学上能接受的载体和制剂详细记载于雷明登氏药学全书。
[0078]
所述药物组合物能通过口服或非口服进行给药，作为非口服给药时，能通过静脉内注射，鼻腔内注射，局部注射，脑室内注射，脊髓腔注射，皮下注射，腹腔注射，经皮给药等方式进行给药。
[0079]
所述药物组合物的适合的给药剂量根据制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病态、食物、给药时间、给药途径、排泄速度及反应灵敏性之类的因素而可以进行多种处方，通常，熟练的医生能够容易地决定及处方对所希望的治疗或预防有效的给药剂量。
[0080]
所述药物组合物根据本发明所属技术领域的普通技术人员可以容易实施的方法，利用药剂学上能接受的载体和/或赋形剂来进行制剂化，从而能够以单位用量形态制备或者内装在多容量容器内来制备。此时，剂型是油性或者水性介质中的溶液、悬浮液或乳化液形态，或者也可以是浸膏剂、粉末剂、颗粒剂、片剂或者胶囊剂形态，还可以包括分散剂或者稳定剂。
[0081]
最后应说明的是，以上仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳布置方案对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

技术特征：
1.一种肢端型黑色素瘤诊疗标志物组合，其特征在于，所述肢端型黑色素瘤诊疗标志物组合为apoe和cd163。2.根据权利要求1所述的肢端型黑色素瘤诊疗标志物组合，其特征在于，所述标志物组合为rna或其逆转录的cdna，或蛋白质。3.权利要求1或2所述标志物组合在制备评估肢端型黑色素瘤恶性程度、预测患者预后和靶向治疗制品中的应用，其特征在于，所述制品中利用定量试剂检测apoe和cd163基因的表达量改变，从而用于评估肢端型黑色素瘤恶性程度、预测患者预后和靶向治疗。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用中包括：s1，联合利用apoe和cd163基因及其产物的表达来对肢端型黑色素瘤进行恶性程度和患者预后判断；s2，apoe联合cd163基因及其产物后与其它潜在指标联合后用来对肢端型黑色素瘤进行恶性程度和患者预后判断。5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所检测的样本为：肢端型黑色素瘤组织；所述定量试剂的范围包括：基因表达的rna、其逆转录得到的cdna、以及蛋白水平；所用的检测方法涉及：rt-pcr、荧光定量pcr、mrna sequencing、mrnaarray检测技术、免疫组化、免疫荧光、westernblot、elisa、流式细胞术检测、免疫学检测、化学法检测。6.一种用于评估肢端型黑色素瘤的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含检测权利要求1或2所述标志物组合表达量的定量试剂。7.一种用于评估肢端型黑色素瘤恶性程度和患者预后的装置，其特征在于，所述装置包括检测装置、分析装置和结果输出装置；检测装置：用于检测样本中权利要求1或2所述标志物组合的表达量，所述样本为肢端型黑色素瘤组织；分析装置：基于所述标志物组合的表达量，评估肢端型黑色素瘤的恶性程度和患者预后；结果输出装置：用于输出分析装置得到的结果，所述分析包括肢端型黑色素瘤的恶性程度分析和患者预后分析。8.根据权利要求7所述的装置，其特征在于，所述检测装置采用的试剂包括基因表达的rna、其逆转录得到的cdna、以及蛋白水平检测试剂；所用的检测方法涉及：rt-pcr、荧光定量pcr、mrnasequencing、mrnaarray检测技术、免疫组化、免疫荧光、westernblot、elisa、流式细胞术检测、免疫学检测、化学法检测。9.抑制权利要求1或2所述标志物组合表达的药物在制备治疗肢端型黑色素瘤的药物组合物中的应用，其特征在于，抑制所述标志物组合表达的药物包括：s1，联合抑制apoe和cd163基因的转录、或表达、或功能的试剂或化合物；s2，联合抑制apoe和cd163基因与其它潜在指标的转录、或表达、或功能的试剂或化合物。10.一种治疗或预防肢端型黑色素瘤的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含：药学有效量的针对apoe和cd163的抑制剂或结合其蛋白产物的抗体/免疫学活性片段，还包含药剂学上能接受的载体。

技术总结
本发明公开了一种肢端型黑色素瘤诊疗标志物组合及其应用，所述肢端型黑色素瘤诊疗标志物组合为APOE和CD163。所述肿瘤诊疗标志物组合可用于制备评估肢端型黑色素瘤恶性程度、预测患者预后和靶向治疗的制品。本发明采用高通量测序和生物信息学方法筛选出候选基因组合APOE和CD163，并通过免疫组化实验证实了所述诊疗标志物组合与肢端型黑色素瘤的恶性程度和预后有很好的相关性。本发明所述的瘤诊疗标志物组合对于肢端型黑色素瘤的诊疗具有重大的应用推广价值。大的应用推广价值。大的应用推广价值。


技术研发人员：薛瑞栋 李航 张宁 刘恒康 高嘉雯
受保护的技术使用者：北京大学第一医院
技术研发日：2022.12.28
技术公布日：2023/7/12