一组检测马铃薯病毒的引物、试剂盒及方法和应用

1.本发明属于植物病毒鉴定技术领域，具体涉及一组检测马铃薯病毒的引物、试剂盒及方法和应用。


背景技术：

2.马铃薯是茄科茄属的一年生草本块茎植物，其块茎可供食用，原产于南美洲，已在世界150多个国家和地区栽培种植。马铃薯是重要的粮食、蔬菜兼用作物，在动物饲料工业酿酒、提取淀粉等方面是重要的原料，其种薯及各种加工产品已在全球经济贸易中占有重要地位。马铃薯病毒病是影响马铃薯生产的主要病害之一，在世界各国马铃薯种植区均有分布，其流行较广，危害性较大，导致马铃薯的产量下降和质量变劣，大大降低了马铃薯的利用价值，严重制约了马铃薯产业的发展。蚜虫传播、接触传播和摩擦传播是马铃薯病毒病的主要传播途径。马铃薯受到一种病毒的单独侵染或几种病毒的复合侵染后已造成了相当严重的损失。zang利用酶联免疫吸附原理结合传感器介绍了检测烟草花叶病毒的新方法。张华鹏等在2011年建立了pvy、pvs和plrv三重反转录-聚合酶链式反应(rt-pcr)检测体系，研究表明，多重rt-pcr在病毒检测中得到了广泛的推广和应用。feng等运用实时定量pcr技术检测出黄瓜花叶病毒，并建立了方程进行数据分析。聂峰杰等应用rt-pcr技术对宁夏马铃薯脱毒种薯进行了病毒检测。沈林林等采用多基因联合方法对福清产区马铃薯y病毒株系组成进行鉴定。
3.马铃薯病毒病的检测技术包括植物指示法、免疫电镜法、酶联免疫吸附法(elisa)、逆转录聚合酶链式反应(rt-pcr)、核酸斑点杂交技术(nash)、聚丙稀酰胺凝胶电泳(page)及其他分子生物学技术。马铃薯病毒的检测与鉴定技术日益完善，更加的快速、便捷、准确、高效和灵敏。生产上目前使用的elisa检测技术，成本较低，操作简便，但灵敏度远低于rt-pcr技术。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一组检测马铃薯病毒的引物、试剂盒及方法和应用。利用本发明所述引物能够鉴定不同地区马铃薯的病毒病发病种类，灵敏度高，能够明确不同区域马铃薯主要病毒病原，为马铃薯病毒病科学防治提供科学依据。
5.本发明提供了一组检测马铃薯病毒的引物，所述引物包括马铃薯x病毒检测用引物对、马铃薯y病毒检测用引物对、马铃薯s病毒检测用引物对、马铃薯m病毒检测用引物对和马铃薯卷叶病毒检测用引物对中的一种或两种以上；
6.所述马铃薯x病毒检测用引物对包括核苷酸序列如seq id no.1所示的pvx正向引物和核苷酸序列如seq id no.2所示的pvx反向引物；
7.所述马铃薯y病毒检测用引物对包括核苷酸序列如seq id no.3所示的pvy正向引物和核苷酸序列如seq id no.4所示的pvy反向引物；
8.所述马铃薯s病毒检测用引物对包括核苷酸序列如seq id no.5所示的pvs正向引
物和核苷酸序列如seq id no.6所示的pvs反向引物；
9.所述马铃薯m病毒检测用引物对包括核苷酸序列如seq id no.7所示的pvm正向引物和核苷酸序列如seq id no.8所示的pvm反向引物；
10.所述马铃薯卷叶病毒检测用引物对包括核苷酸序列如seq id no.9所示的plrv正向引物和核苷酸序列如seq id no.10所示的plrv反向引物。
11.本发明还提供了一种检测马铃薯病毒的试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案所述的引物和反应液。
12.优选的是，所述反应液包括2
×
easytaq supermix。
13.本发明还提供了一种基于上述技术方案所述引物或上述技术方案所述试剂盒的检测马铃薯病毒的方法，包括以下步骤：
14.对马铃薯进行rna的提取，得到总rna；
15.将总rna进行反转录，得到cdna；
16.以cdna为模板，进行pcr反应，实现马铃薯病毒的鉴定。
17.优选的是，每20μl所述pcr反应的体系包括2
×
easytaq supermix 10μl、10mmol/l的正反向引物各0.5μl、cdna 1μl和余量的ddh2o。
18.优选的是，所述pcr反应的程序为：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃40s，35个循环；72℃7min。
19.本发明还提供了上述技术方案所述引物或上述技术方案所述试剂盒在马铃薯病毒病预防中的应用。
20.本发明提供了一组检测马铃薯病毒的引物。利用本发明所述引物能够鉴定不同地区马铃薯的病毒病发病种类，灵敏度高，能够明确不同区域马铃薯主要病毒病原，为马铃薯病毒病科学防治提供科学依据。如对新疆马铃薯主产区进行马铃薯病毒病样采样，应用rt-pcr分子鉴定技术进行病原种类的鉴定，可以全面掌握新疆马铃薯病毒病害的发生情况，采集新疆主产区马铃薯病毒样本，完成阳性样本的序列比对及分析，为有针对性综合防控新疆主产区病毒病提供重要依据。2021年，在新疆主产区乌鲁木齐县、吉木萨尔县、奇台县、巴里坤县、泽普县采集马铃薯病毒病疑似感病样本87份，并对样本进行rt-pcr检测，对于阳性样本的cp基因进行克隆及测序，完成同源性、地理来源和系统进化分析。试验结果表明，从87份样本中检测到马铃薯y病毒、马铃薯s病毒、马铃薯卷叶病毒，检出率分别为100％、37.93％、6.89％，以pvy检出率最高，未检出马铃薯x病毒、马铃薯m病毒，说明pvy是危害该区域马铃薯样本的主要病毒病原。试验对pvy阳性带病样本进行克隆与序列比对，其中5份样本cp基因序列与中国福建、山东、江苏及波兰等地分离物一致性达到100％，与其他国家的分离物的一致性达到99.04％以上。新疆主产区马铃薯主要由pvy、pvs、plrv的一种或多种病毒所侵染，其中pvy病原较严重，需加强合格脱毒种薯及科学防治技术的推广及应用。
附图说明
21.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
22.图1为本发明提供的马铃薯感染病毒后的症状图片；
23.图2为本发明提供的马铃薯病毒rt-pcr电泳结果图；
24.图3为本发明提供的pvy测序序列基础上构建的进化树结果图。
具体实施方式
25.本发明提供了一组检测马铃薯病毒的引物，所述引物包括马铃薯x病毒检测用引物对、马铃薯y病毒检测用引物对、马铃薯s病毒检测用引物对、马铃薯m病毒检测用引物对和马铃薯卷叶病毒检测用引物对中的一种或两种以上；
26.所述马铃薯x病毒检测用引物对包括核苷酸序列如seq id no.1(ttcgacttcttcaatggagtc)所示的pvx正向引物和核苷酸序列如seq id no.2(tccagtgatacgacctcg)所示的pvx反向引物；
27.所述马铃薯y病毒检测用引物对包括核苷酸序列如seq id no.3(tgaaaatggaacctcgcc)所示的pvy正向引物和核苷酸序列如seq id no.4(aatgtgccatgatttgcc)所示的pvy反向引物；
28.所述马铃薯s病毒检测用引物对包括核苷酸序列如seq id no.5(tcgtbtggaattacatgctmg)所示的pvs正向引物和核苷酸序列如seq id no.6(atcaaatgtgtcaaawgcgg)所示的pvs反向引物；
29.所述马铃薯m病毒检测用引物对包括核苷酸序列如seq id no.7(acatctgaggacatgatgcgc)所示的pvm正向引物和核苷酸序列如seq id no.8(tgagctcgggaccattcatac)所示的pvm反向引物；
30.所述马铃薯卷叶病毒检测用引物对包括核苷酸序列如seq id no.9(aagaaggcaatcccttcg)所示的plrv正向引物和核苷酸序列如seq id no.10(atgtctcgcttgagcctc)所示的plrv反向引物。
31.在本发明中，所述引物均为针对cp基因设计得到的。利用本发明引物进行检测，准确率高，即利用本发明引物检测后，结合实地采样病样特征判断，结果一致。
32.本发明还提供了一种检测马铃薯病毒的试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案所述的引物和反应液。在本发明中，所述反应液优选包括2
×
easytaq super mix。
33.本发明还提供了一种基于上述技术方案所述引物或上述技术方案所述试剂盒的检测马铃薯病毒的方法，包括以下步骤：
34.对马铃薯进行rna的提取，得到总rna；
35.将总rna进行反转录，得到cdna；
36.以cdna为模板，进行pcr反应，实现马铃薯病毒的鉴定。
37.本发明所述方法优于elisa，可以检测出病毒含量较小的样本，灵敏度更高。
38.本发明对马铃薯进行rna的提取，得到总rna。在本发明中，优选对马铃薯叶片进行rna的提取。本发明对rna的提取方法没有特殊限定，采用本领域技术人员公知的常规rna提取方法即可。
39.得到总rna后，本发明将总rna进行反转录，得到cdna。本发明对所述反转录的方法没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的反转录方法即可。
40.得到cdna后，本发以cdna为模板，进行pcr反应，实现马铃薯病毒的鉴定。在本发明
中，每20μl所述pcr反应的体系优选包括2
×
easytaq supermix 10μl、10mmol/l的正反向引物各0.5μl、cdna 1μl和余量的ddh2o。在本发明中，所述pcr反应的程序优选为：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃40s，35个循环；72℃7min。
41.本发明还提供了上述技术方案所述引物或上述技术方案所述试剂盒在马铃薯病毒病预防中的应用。具体生产上可以提前检测种薯，依据种薯病毒情况，不合格淘汰的方法保证种薯质量。也可以根据病毒感染情况，应用脱毒种薯，轮作倒茬、加强田间管理，进行化学防治(病毒必克可湿性粉剂)来实现马铃薯病毒病的预防。
42.为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一组检测马铃薯病毒的引物、试剂盒及方法和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
43.实施例1
44.试验材料
45.于2021年在新疆主产县乌鲁木齐县、吉木萨尔县、奇台县、巴里坤县、泽普县，共87份样本(表1)，对其编号后放置于-80℃冰箱保存备用。
46.表1病毒病采样点(2021年)
[0047][0048]
总rna提取及rt-pcr检测
[0049]
按照提取试剂盒将马铃薯叶片rna提取后，将总rna反转合成为cdna，以cdna为模板进行病毒的rt-pcr检测，引物信息如表2。pcr反应体系均为：2
×
easytaq supermix 10μl、正反向引物各0.5μl(10mmol/l)、cdna 1μl、ddh2o补足至20μl。反应程序：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃40s，35个循环；72℃7min，4℃保存。反应完毕后，取7μlpcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。在120v恒压条件下电泳25min后，在凝胶成像系统上查看结果并保存。
[0050]
表2检测5种病毒引物序列
[0051]
[0052][0053]
测序及分析
[0054]
将扩增出的特异性条带进行测序，得到的cp基因序列在ncbi网站中进行分析比对，根据比对结果，再选取ncbi上发布的分离物的cp基因完整序列。利用mega6.0软件的clustal w法进行多序列比对分析以及邻接法(neighbor joining，nj)构建系统进化树，系统进化树中各分支置信度(bootsrap)进行1000次重复分析。
[0055]
结果与分析
[0056]
马铃薯感染病毒的症状
[0057]
在乌鲁木齐县、奇台县、吉木萨尔县、巴里坤县、泽普县等主产县进行采样，马铃薯植株症状表现有矮化、花叶、卷叶等症状，病株叶片褪绿黄化，叶片边缘有轻微内卷，叶片变脆增厚。图1为马铃薯感染病毒后的症状图片。
[0058]
病毒检出率
[0059]
对87份样本进行提取总rna后，获得cdna，以cdna为模板，用引物-f和引物-r进行pcr扩增。从87份样本检测出pvy、pvs、rlpv，其检出率分别为100％、37.93％、6.89％，未检出pvx、pvm病毒，其中4个样本为pvy、pvs、plrv三种病毒复合侵染，29个样本为pvy、pvs两种病毒复合侵染，1个样本为pvy、plrv两种病毒复合侵染。详见表3。
[0060]
采用pvy特异性引物进行rt-pcr扩增后，采集样本均出现pvy特异性扩增条带，鉴定为均带pvy病毒。采用pvs特异性引物检测出33份带毒样本；采用prlv特异性引物检测出6份带毒样本，分别为qt-9、qt-12、qt-13、qt-17、qt-20、qt-21，阴性样本未扩增到相应的片段。详见图2(马铃薯病毒rt-pcr电泳结果图)。
[0061]
表3马铃薯病毒rt-pcr检出统计表
[0062][0063]
pvy基因序列比对及进化树
[0064]
结果表明，从87份阳性样本中获得cp基因(87份都带pvy病毒，全部样品参与比对)与ncbi上来自中国23份，法国2份，美国4份，埃及1份，哈萨克斯坦2份，斯洛伐克2份，南非1份，叙利亚1份，斯洛文尼亚1份，俄罗斯1份，波兰4份，德国1份，共计43份pvy cp基因序列进行同源性分析。其中zp-8、qt-21、jms-43、qt-50、blk-75号样本cp基因序列与中国福建(kj634023.1)、中国山东(ef592525)、波兰(jf927762.1)、中国江苏(mn734254)序列一致性达到100％，与其他国家的分离物的一致性达到99.04％以上(详见表4)。
[0065]
表4用于序列比对及进化分析的pvy基因序列
[0066]
[0067][0068]
利用采集到的43个pvy分离物(参与比对的只有87份中带阳性样本，pva中带毒43份)构建进化树，以马铃薯a病毒(pva)分离物nc004039作为外参，进化树结果表明39个pvy分离物聚在两个大的分支上，其中比较大的一个分支，zp-3、blk-74、zp-8、qt-12聚在一个分支上；qt-16，qt-33聚类在另一个分支上，qt-27、zp-6、jms-40、jms-41离上述两个分支亲缘关系较远，根据进化树显示jms-40和jms-41的亲缘关系最近，外类群nc004039离上述的43个分离物的关系最远。图3为在pvy测序序列基础上构建的进化树结果图。
[0069]
结论
[0070]
本发明通过分子病毒检测技术进一步明确了马铃薯病毒病的主要病原种类，为新疆马铃薯病毒病防治提供科学依据。对87份样本进行反转录聚合酶链式反应检测，结果共检测出pvy、pvs、rlpv，其中4个样本为pvy、pvs、plrv三种病毒复合侵染，29个样本为pvy、
pvs两种病毒复合侵染。
[0071]
选出阳性样本作为pcr扩增产物，进行克隆、测序和序列分析，将测序结果通过序列比对，利用mega6软件的clustal w法进行多序列比对分析以及邻接法构建系统进化树，系统进化树中各分支置信度进行重复分析。研究发现pvy的cp核酸序列与中国福建(kj634023.1)、中国山东(ef592525)、波兰(jf927762.1)、中国江苏(mn734254)序列一致性达到100％，高于中国其它山西、宁夏、河南、吉林等地，病毒可能来自国内某个pvy发生区。
[0072]
目前，马铃薯病毒病没有有效的防治药剂，获得无毒的种薯和植株，要加强病毒的检测和鉴定，把握好依靠准确高效的检测技术和手段来保证种薯质量。通过对特定地区马铃薯病毒病的调查和病毒病原分析，对马铃薯产业发展具有较大的研究意义。
[0073]
实施例2
[0074]
对本发明引物进行灵敏度试验验证、结果表明各组灵敏度都在10-7
，本发明引物扩增得到的各条带亮度高，且无杂带；特异性强。
[0075]
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

技术特征：
1.一组检测马铃薯病毒的引物，其特征在于，所述引物包括马铃薯x病毒检测用引物对、马铃薯y病毒检测用引物对、马铃薯s病毒检测用引物对、马铃薯m病毒检测用引物对和马铃薯卷叶病毒检测用引物对中的一种或两种以上；所述马铃薯x病毒检测用引物对包括核苷酸序列如seq id no.1所示的pvx正向引物和核苷酸序列如seq id no.2所示的pvx反向引物；所述马铃薯y病毒检测用引物对包括核苷酸序列如seq id no.3所示的pvy正向引物和核苷酸序列如seq id no.4所示的pvy反向引物；所述马铃薯s病毒检测用引物对包括核苷酸序列如seq id no.5所示的pvs正向引物和核苷酸序列如seq id no.6所示的pvs反向引物；所述马铃薯m病毒检测用引物对包括核苷酸序列如seq id no.7所示的pvm正向引物和核苷酸序列如seq id no.8所示的pvm反向引物；所述马铃薯卷叶病毒检测用引物对包括核苷酸序列如seq id no.9所示的plrv正向引物和核苷酸序列如seq id no.10所示的plrv反向引物。2.一种检测马铃薯病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物和反应液。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述反应液包括2
×
easy taq supermix。4.一种基于权利要求1所述引物或权利要求2或3所述试剂盒的检测马铃薯病毒的方法，包括以下步骤：对马铃薯进行rna的提取，得到总rna；将总rna进行反转录，得到cdna；以cdna为模板，进行pcr反应，实现马铃薯病毒的鉴定。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，每20μl所述pcr反应的体系包括2
×
easytaq supermix 10μl、10mmol/l的正反向引物各0.5μl、cdna 1μl和余量的ddh2o。6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述pcr反应的程序为：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃40s，35个循环；72℃7min。7.权利要求1所述引物或权利要求2或3所述试剂盒在马铃薯病毒病预防中的应用。

技术总结
本发明属于植物病毒鉴定技术领域，涉及一组检测马铃薯病毒的引物、试剂盒及方法和应用。本发明提供了一组检测马铃薯病毒的引物，所述引物包括马铃薯X病毒检测用引物对、马铃薯Y病毒检测用引物对、马铃薯S病毒检测用引物对、马铃薯M病毒检测用引物对和马铃薯卷叶病毒检测用引物对中的一种或两种以上。利用本发明所述引物能够鉴定不同地区马铃薯的病毒病发病种类，明确不同区域马铃薯主要病毒病原，为马铃薯病毒病科学防治提供科学依据。为马铃薯病毒病科学防治提供科学依据。为马铃薯病毒病科学防治提供科学依据。


技术研发人员：杨茹薇 刘易 李江涛 古丽米拉
受保护的技术使用者：新疆农业科学院综合试验场
技术研发日：2023.03.07
技术公布日：2023/7/12