一种具有抗原捕获能力的仿生无机纳米颗粒及其制备方法与流程

1.本发明涉及结直肠癌药物领域，尤其涉及一种具有抗原捕获能力的仿生无机纳米颗粒及其制备方法。


背景技术：

[0002][0003]
结直肠癌的治疗手段主要包括化疗、放疗、手术治疗、免疫治疗、靶向治疗等，然而受到肿瘤耐药性、手术部位受限、毒副作用较大等限制，治疗效果难以令人满意，探索一种高效、靶向、低副作用且无创的治疗手段迫在眉睫。手术治疗联合放疗是结直肠癌常用治疗方法。手术治疗可以切除直肠癌的转移灶，放疗通常用于结直肠癌辅助治疗，通过放疗可以降低肿瘤分期，提高肛门保留率，降低局部复发率。但结直肠癌手术联合放疗仍然面临术后肿瘤易复发转移和术后生存率低两大问题，因此临床上迫切需要一种更好的治疗药物。


技术实现要素：

[0004]
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种具有抗原捕获能力的仿生无机纳米颗粒及其制备方法。
[0005]
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
[0006]
本发明第一方面是提供一种具有抗原捕获能力的仿生无机纳米颗粒，包括细菌外膜囊泡，所述细菌外膜囊泡内包被有普鲁士蓝-二氧化锰无机纳米颗粒，所述细菌外膜囊泡的囊泡壁内嵌有光敏剂ce6，所述细菌外膜囊泡的囊泡壁外侧表面修饰有马来酰亚胺。
[0007]
本发明第二方面是提供上述的仿生无机纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：
[0008]
步骤一，从大肠杆菌中获取细菌外膜囊泡，记为omv；
[0009]
步骤二，将步骤一得到的omv分散到pbs缓冲液中，采用n-乙基马来酰亚胺处理，以消耗omv上游离的硫醇；
[0010]
步骤三，将马来酰亚胺-四聚乙二醇-丙烯酸琥珀酰亚胺酯溶液与步骤二处理过的omv混合，孵育，经洗涤离心后得到马来酰亚胺修饰的细菌外膜囊泡，记为omv-mal；
[0011]
步骤四，将二氢卟吩ce6与步骤三得到的omv-mal在pbs缓冲液中搅拌，完成ce6在omv上的加载，记为omv-mal/ce6，将获得的所述omv-mal/ce6再次悬浮在pbs缓冲液中，保存待用；
[0012]
步骤五，将聚乙烯吡咯烷酮溶于盐酸溶液中，依次加入铁氰化钾和高锰酸钾，得到的反应物混合物离心收集即为普鲁士蓝-二氧化锰，记为pbmn，将纯化后的pbmn纳米颗粒重新分散在水中，保存待用；
[0013]
步骤六，将pbmn悬液与omv-mal/ce6悬浮液漩涡，超声探头将omv包覆在pbmn上，即得pbmn@omv-mal/ce6。
[0014]
进一步地，所述步骤一具体为：将大肠杆菌接种到lb培养基中，置于35-37℃摇床培养，通过超声破碎法获取细菌外膜囊泡，记为omv。
[0015]
进一步地，所述步骤二中，5-35℃下采用n-乙基马来酰亚胺处理的时间为2-6小时。
[0016]
进一步地，所述步骤三中，孵育温度为5-35℃，孵育时间为2-6小时；所述马来酰亚胺-四聚乙二醇-丙烯酸琥珀酰亚胺酯溶液的浓度为0.6-5mg/ml。
[0017]
进一步地，所述步骤四中，搅拌时所处的温度为5-35℃，搅拌时间为2-8小时；omv-mal/ce6悬浮液的保存温度为0-4℃。
[0018]
进一步地，所述步骤四中，二氢卟吩ce6与omv-mal的质量比为1:(1-10)。
[0019]
进一步地，所述步骤五中，盐酸溶液由浓度为36w/v％的浓盐酸溶于去离子水中得到，所述浓盐酸与去离子水的体积比为1:(480-600)。
[0020]
进一步地，所述步骤五中，反应温度为80-90℃，反应时间为24-36小时。
[0021]
进一步地，所述步骤六中，pbmn与omv-mal/ce6的质量比为1:(2-10)。
[0022]
本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
[0023]
本发明制备的具有抗原捕获能力的仿生无机纳米颗粒，内嵌光敏剂ce6的细菌外膜囊泡(omv)并包被无机纳米颗粒普鲁士蓝-二氧化锰(pb-mno2，pbmn)，此外通过化学键在omv表面修饰马来酰亚胺(mal)；该纳米材料经瘤内注射后，mno2催化h2o2产生o2解决肿瘤部位乏氧问题，pb和ce6分别发挥ptt/pdt协同杀伤肿瘤细胞，诱导细胞免疫原性死亡，释放肿瘤抗原，mal通过形成硫醚键捕获释放的抗原，此外，omv含细菌外膜来源的危险信号，刺激树突状细胞后成熟后，激发强烈的肿瘤免疫反应，以上机制可协同高效地杀伤肿瘤并预防其转移与复发，实现结直肠癌的高效治疗。
附图说明
[0024]
图1为本发明仿生无机纳米颗粒pbmn@omv-mal/ce6的制备流程图；
[0025]
图2为本发明仿生无机纳米颗粒pbmn@omv-mal/ce6透射电镜图；
[0026]
图3为本发明仿生无机纳米颗粒pbmn@omv-mal/ce6与pbmn的粒径图；
[0027]
图4为本发明仿生无机纳米颗粒pbmn@omv-mal/ce6与omv、pbmn、pbmn@omv的zeta电位图；
[0028]
图5为本发明仿生无机纳米颗粒pbmn@omv-mal/ce6与omv、pbmn的sds-page图；
[0029]
图6为本发明仿生无机纳米颗粒pbmn@omv-mal/ce6的光热效果图；
[0030]
图7为本发明仿生无机纳米颗粒pbmn@omv-mal/ce6产生ros的效果图；
[0031]
图8为本发明仿生无机纳米颗粒pbmn@omv-mal/ce6对结直肠癌细胞的杀伤效果统计图。
具体实施方式
[0032]
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限定。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
[0033]
参考图1，本发明提供了一种具有抗原捕获能力的仿生无机纳米颗粒，包括细菌外膜囊泡，细菌外膜囊泡内包被有普鲁士蓝-二氧化锰无机纳米颗粒，细菌外膜囊泡的囊泡壁内嵌有光敏剂ce6，细菌外膜囊泡的囊泡壁外侧表面修饰有马来酰亚胺。
[0034]
继续参考图1，本发明还提供了上述仿生无机纳米颗粒的制备方法，包括如下步
骤：
[0035]
步骤一，从大肠杆菌中获取细菌外膜囊泡，记为omv；
[0036]
步骤二，将步骤一得到的omv分散到pbs缓冲液中，采用n-乙基马来酰亚胺处理，以消耗omv上游离的硫醇；
[0037]
步骤三，将马来酰亚胺-四聚乙二醇-丙烯酸琥珀酰亚胺酯溶液与步骤二处理过的omv混合，孵育，经洗涤离心后得到马来酰亚胺修饰的细菌外膜囊泡，记为omv-mal；
[0038]
步骤四，将二氢卟吩ce6与步骤三得到的omv-mal在pbs缓冲液中搅拌，完成ce6在omv上的加载，记为omv-mal/ce6，将获得的所述omv-mal/ce6再次悬浮在pbs缓冲液中，保存待用；
[0039]
步骤五，将聚乙烯吡咯烷酮溶于盐酸溶液中，依次加入铁氰化钾和高锰酸钾，得到的反应物混合物离心收集即为普鲁士蓝-二氧化锰，记为pbmn，将纯化后的pbmn纳米颗粒重新分散在水中，保存待用；
[0040]
步骤六，将pbmn悬液与omv-mal/ce6悬浮液漩涡，超声探头将omv包覆在pbmn上，即得pbmn@omv-mal/ce6。
[0041]
作为一优选例，步骤一具体为：将大肠杆菌接种到lb培养基中，置于35-37℃摇床培养，通过超声破碎法获取细菌外膜囊泡，记为omv。
[0042]
作为一优选例，步骤二中，5-35℃下采用n-乙基马来酰亚胺处理的时间为2-6小时，更优选为2小时。
[0043]
作为一优选例，步骤三中，孵育温度为5-35℃，孵育时间为2-6小时，更优选为2小时；所述马来酰亚胺-四聚乙二醇-丙烯酸琥珀酰亚胺酯溶液的浓度为0.6-5mg/ml，更优选为0.6mg/ml。
[0044]
作为一优选例，步骤四中，搅拌时所处的温度为5-35℃，搅拌时间为2-8小时，更优选为2小时；omv-mal/ce6悬浮液的保存温度为0-4℃，更优选为4℃。
[0045]
作为一优选例，步骤四中，二氢卟吩ce6与omv-mal的质量比为1:(1-10)，更优选为1:1。
[0046]
作为一优选例，步骤五中，盐酸溶液由浓度为36w/v％的浓盐酸溶于去离子水中得到，所述浓盐酸与去离子水的体积比为1:(480-600)。
[0047]
作为一优选例，步骤五中，反应温度为80-90℃，更优选为86℃油浴，反应时间为24-36小时，更优选为24小时。
[0048]
作为一优选例，步骤六中，pbmn与omv-mal/ce6的质量比为1:(2-10)，更优选为1:2。
[0049]
实施例1
[0050]
本实施例提供一种具有抗原捕获能力的仿生无机纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：
[0051]
步骤一，将大肠杆菌接种到250ml的lb培养基中，置于37℃摇床；当培养基的od600达到1.2时，5000rpm离心3min收集细菌；洗涤后，将细菌重新分散于12mlomv提取液(10mmtris-hcl、10mmedta、150mmnacl、ph7.4)中，然后在超声细胞破碎机中粉碎(超声开5秒，关10秒，总时间为90分钟，0℃)，注意冰浴防止温度过高；超声后，14000g，4℃离心20min，收集上清液为omv；然后将omv冻干，-80℃保存，用于后续实验。
[0052]
步骤二，室温下用n-乙基马来酰亚胺(浓度为0.5mg/ml)处理omv2小时，以消耗omv上游离的硫醇(目的是：如果omv的硫醇(即巯基)过多，可能会消耗mal-peg4-nhs上的mal，这样会致使其发生失活，从而丧失吸附肿瘤抗原的能力)；
[0053]
步骤三，将100μlmal-peg4-nhs溶液(浓度为0.6mg/ml)与600μl处理过的omv(含600μg蛋白)混合，室温孵育2h(反应原理：nhs，即n-羟基琥珀酰亚胺，可与nh2伯氨基发生反应，生成酰胺键)；150000
×
g，4℃，3h超速离心除去多余的mal-peg4-nhs。
[0054]
步骤四，将100μg/mlce6与100μg/mlomv-mal在2mlpbs缓冲液中室温搅拌2h，完成ce6在omv上的加载；用pbs离心洗涤(14000g，20min)，除去游离的ce6；将获得的omv-mal/ce6再次悬浮在2mlpbs中，4℃保存待用。
[0055]
步骤五，室温将3gpvp溶于50ml含有104μl浓hcl(36％，w/v)的去离子水中，依次加入132mgk3[fe(cn)6]和52mgkmno4；kmno4完全溶解后，将得到的棕黑色溶液立刻转移到预热至86℃的油浴中，反应持续24h，将得到的反应混合物离心(16000rpm，30min)收集即为pbmn纳米颗粒；将pbmn纳米颗粒用水清洗5次以去除pvp；将纯化后的pbmn纳米颗粒重新分散在水中，室温保存待用。
[0056]
步骤六，将1ml的pbmn悬液(1mg/ml)与1ml的omv-mal/ce6悬浮液(2mg/ml)漩涡；超声探头(50w，3min)将omv包覆在复合无机纳米颗粒上，pbmn@omv-mal/ce6于6000
×
g，15min，4℃下离心，pbs重悬，得到最终材料。
[0057]
其透射电镜(tem)见图2，其粒径图见图3，结果显示pbmn水合粒径大致为120nm，pbmn@omv-mal/ce6水合粒径大致为200nm。其zeta电位见图4，结果显示pbmn@omv-mal/ce6的电势为负电，绝对值最大。sds-page图见图5，结果显示pbmn@omv-mal/ce6的特征蛋白与omv的特征蛋白一致，以上结果均可说明pbmn@omv-mal/ce6已成功的合成。
[0058]
其光热效果见图6，显示本发明仿生无机纳米颗粒pbmn@omv-mal/ce6可以在5分钟内温度从28.1℃升温至52.7℃，表明其具有良好的光热性能。
[0059]
其产生ros的效果见图7，显示本发明仿生无机纳米颗粒pbmn@omv-mal/ce6在660nm激光照射后，与dcfh-da探针孵育后，在荧光显微镜下观察到了大量的绿色荧光，这表明该材料ros产生能力较强，可用于pdt。
[0060]
其不同浓度对结直肠癌细胞的杀伤效果见图8，材料在0，5ug/ml，10ug/ml，25ug/ml，50ug/ml浓度时分别测定对结直肠癌细胞的细胞杀伤力，一组ptt，一组pdt，一组pdt+ptt。结果显示，pdt联合ptt比单独ptt或pdt对细胞杀伤力更强，并且材料随着浓度的增大对细胞的杀伤能力越大。
[0061]
上所述仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书内容及图示所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围内。

技术特征：
1.一种具有抗原捕获能力的仿生无机纳米颗粒，其特征在于，包括细菌外膜囊泡，所述细菌外膜囊泡内包被有普鲁士蓝-二氧化锰无机纳米颗粒，所述细菌外膜囊泡的囊泡壁内嵌有光敏剂ce6，所述细菌外膜囊泡的囊泡壁外侧表面修饰有马来酰亚胺。2.权利要求1所述的仿生无机纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一，从大肠杆菌中获取细菌外膜囊泡，记为omv；步骤二，将步骤一得到的omv分散到pbs缓冲液中，采用n-乙基马来酰亚胺处理，以消耗omv上游离的硫醇；步骤三，将马来酰亚胺-四聚乙二醇-丙烯酸琥珀酰亚胺酯溶液与步骤二处理过的omv混合，孵育，经洗涤离心后得到马来酰亚胺修饰的细菌外膜囊泡，记为omv-mal；步骤四，将二氢卟吩ce6与步骤三得到的omv-mal在pbs缓冲液中搅拌，完成ce6在omv上的加载，记为omv-mal/ce6，将获得的所述omv-mal/ce6再次悬浮在pbs缓冲液中，保存待用；步骤五，将聚乙烯吡咯烷酮溶于盐酸溶液中，依次加入铁氰化钾和高锰酸钾，得到的反应物混合物离心收集即为普鲁士蓝-二氧化锰，记为pbmn，将纯化后的pbmn纳米颗粒重新分散在水中，保存待用；步骤六，将pbmn悬液与omv-mal/ce6悬浮液漩涡，超声探头将omv包覆在pbmn上，即得pbmn@omv-mal/ce6。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤一具体为：将大肠杆菌接种到lb培养基中，置于35-37℃摇床培养，通过超声破碎法获取细菌外膜囊泡，记为omv。4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤二中，5-35℃下采用n-乙基马来酰亚胺处理的时间为2-6小时。5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤三中，孵育温度为5-35℃，孵育时间为2-6小时；所述马来酰亚胺-四聚乙二醇-丙烯酸琥珀酰亚胺酯溶液的浓度为0.6-5mg/ml。6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤四中，搅拌时所处的温度为5-35℃，搅拌时间为2-8小时；omv-mal/ce6悬浮液的保存温度为0-4℃。7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤四中，二氢卟吩ce6与omv-mal的质量比为1:(1-10)。8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤五中，盐酸溶液由浓度为36w/v％的浓盐酸溶于去离子水中得到，所述浓盐酸与去离子水的体积比为1:(480-600)。9.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤五中，反应温度为80-90℃，反应时间为24-36小时。10.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤六中，pbmn与omv-mal/ce6的质量比为1:(2-10)。

技术总结
本发明公开一种具有抗原捕获能力的仿生无机纳米颗粒及其制备方法，该仿生无机纳米颗粒包括细菌外膜囊泡，细菌外膜囊泡内包被有普鲁士蓝-二氧化锰无机纳米颗粒，细菌外膜囊泡的囊泡壁内嵌有光敏剂Ce6，细菌外膜囊泡的囊泡壁外侧表面修饰有马来酰亚胺。该纳米材料经瘤内注射后，MnO2催化H2O2产生O2解决肿瘤部位乏氧问题，PB和Ce6分别发挥PTT/PDT协同杀伤肿瘤细胞，诱导细胞免疫原性死亡，释放肿瘤抗原，Mal通过形成硫醚键捕获释放的抗原，此外，OMV含细菌外膜来源的危险信号，刺激树突状细胞后成熟后，激发强烈的肿瘤免疫反应，以上机制可协同高效地杀伤肿瘤并预防其转移与复发，实现结直肠癌的高效治疗。结直肠癌的高效治疗。结直肠癌的高效治疗。


技术研发人员：秦环龙 张媛媛 张扬 高洁
受保护的技术使用者：上海市第十人民医院
技术研发日：2023.03.29
技术公布日：2023/7/12