抗虫耐草甘膦转基因玉米事件KJ1172及其检测方法与流程

抗虫耐草甘膦转基因玉米事件kj1172及其检测方法
技术领域
1.本发明属于分子生物学和植物育种技术领域，主要涉及转基因植物及其检查方法，具体是涉及一种对昆虫具有抗性且耐受草甘膦除草剂施用的转基因玉米事件kjdlm528t201172(商业名kj1172)和用于检测生物样品中是否包含特定转基因玉米事件kj1172核酸序列的方法。


背景技术：

2.玉米(zea mays l.)在世界上很多地区都是主要的粮食作物，也是重要的饲料作物，在发展畜牧业和水产养殖业中具有战略性意义，在医药、化工方面也有广泛用途。生物技术已应用于改善玉米农艺性状和品质。
3.近10年来，玉米虫害发生持续呈加重趋势，特别是鳞翅目害虫，如玉米螟、棉铃虫、草地贪夜蛾、黏虫等。通过转基因方法使鳞翅目昆虫的抗性基因在玉米植物中表达，可使玉米获得对鳞翅目昆虫抗性。20世纪90年代，孟山都公司开发了抗虫转基因玉米mon810，自商业化至今的20多年间，mon810品系在防治玉米螟方面效果好。先正达开发的mir162，在抗草地贪夜蛾方面效果良好。
4.玉米另一个重要的农艺性状是除草剂(尤其是草甘膦除草剂)耐受性。在玉米生产中，田间除草工作都会消耗大量劳动力，造成种植成本增加，如除草不及时还会造成玉米减产，给玉米生产带来经济损失。通过转基因方法使草甘膦耐受型基因(如epsps)在玉米植物中表达，可以使玉米获得对草甘膦除草剂的耐受性。
5.目前，玉米生物育种的趋势是培育抗虫和耐除草剂复合性状。国内获得安全证书的转基因玉米有dbn9936和瑞丰12-5，具有抗鳞翅目害虫和耐草甘膦除草剂抗性，是一个抗虫基因和一个抗除草剂基因复合性状的材料。单独一个抗虫基因的使用，抗虫谱窄，长期使用，还有靶标害虫产生抗性的风险。
6.已知外源基因在植物体内的表达受到它们的染色体位置的影响，可能是由于染色质结构(如异染色质)或转录调节元件(如增强子)接近整合位点。为此，通常需要筛选大量的事件才有可能鉴定出可以商业化的事件(即导入的目标基因得到最优表达的事件)。筛选出的商业化事件，具有优异的鳞翅目害虫(玉米螟、棉铃虫、黏虫、草地贪夜蛾、小地老虎等)和除草剂抗性，且不影响其他农艺性状，可以通过常规育种方法将转基因回交到其他遗传背景中。通过这种杂交方式产生的后代保持了原始转化体的转基因表达特征和性状表现。应用这种策略模式可以确保在许多品种中具有可靠的基因表达。
7.检测特定事件的方法对于后期杂交转育，鉴定后代是否包含目的基因将是有益的。此外，还将有助于遵守相关法规，产品保护。通过任何熟知的多核苷酸检测方法来检测转基因的存在都是可能的，例如聚合酶链式反应(pcr)或利用多核苷酸探针的dna杂交。一般常利用跨越了插入的转基因和侧翼dna的接合部位的一对引物通过pcr来鉴定转基因特定事件，具体包括位于侧翼序列的第一引物和插入序列的第二引物。


技术实现要素：

8.本发明的目的是提供一种转基因玉米事件kjdlm528t201172(商业名kj1172，以下均采用商品名描述)以及用于检测玉米事件kj1172的核酸序列及检测方法，可以准确快速的鉴定生物样品中是否包含特定的转基因玉米事件kj1172的dna分子。
9.为实现上述目的，本发明提供了一种核酸序列，包括如下(1)-(3)中的一项：
10.(1)序列seq id no:1、3、5中的任一序列或其互补序列，和seq id no:2、4、6中的任一序列或其互补序；
11.(2)序列seq id no:7或其互补序列；
12.(3)序列seq id no:8或其互补序列。
13.所述核酸序列来源于转基因玉米事件kj1172的植物、种子或细胞，所述玉米事件的种子(拉丁学名：zea mays l.)的代表性样本已以保藏编号cctcc no:p202304保藏于中国典型培养物保藏中心(简称cctcc，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，武汉大学保藏中心，邮编430072)，保藏时间2023年3月13日。
14.所述seq id no:1或其互补序列为转基因玉米事件kj1172中在插入序列的5’末端位于插入接合部位附近的一个长度为22个核苷酸的序列，所述seq id no:1或其互补序列跨越了玉米插入位点的侧翼基因组dna序列和插入序列的5’末端的dna序列；所述seq id no:2或其互补序列为转基因玉米事件kj1172中在插入序列的3’末端位于插入接合部位附近的一个长度为22个核苷酸的序列，所述seq id no:2或其互补序列跨越了插入序列的3’末端的dna序列和玉米插入位点的侧翼基因组dna序列，包含所述seq id no:1和2或其互补序列即可鉴定为转基因玉米事件kj1172的存在。
15.本发明中，所述核酸序列可以为所述seq id no:3或其互补序列中转基因插入序列的任何部分的至少11个或更多个连续多核苷酸(第一核酸序列)，或者为所述seq id no:3或其互补序列中5’侧翼玉米基因组dna区域的任何部分的至少11个或更多个连续多核苷酸(第二核酸序列)。所述核酸序列进一步可以为同源于或互补于包含完整的所述seq id no:1的所述seq id no:3的一部分。当第一核酸序列和第二核酸序列一起使用时，这些核酸序列在产生扩增产物的dna扩增方法中包括dna引物对。使用dna引物对在dna扩增方法中产生的扩增产物是包括seq id no:1的扩增产物时，可以诊断转基因玉米事件kj1172或其后代的存在。本领域技术人员熟知的，第一和第二核酸序列不必仅仅由dna组成，也可包括rna、dna和rna的混合物，或者dna、rna或其它不作为一种或多种聚合酶模板的核苷酸或其类似物的组合。此外，本发明中所述探针或引物应该是至少大约11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个连续核苷酸的长度，其可以选自seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6中所述的核苷酸。当选自seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6所示的核苷酸时，所述探针和引物可以为长度是至少大约21个到大约50个或更多的连续核苷酸。所述seq id no:3或其互补序列为转基因玉米事件kj1172中在插入序列的5’末端位于插入接合部位附近的一个长度为1200个核苷酸的序列，所述seq id no:3或其互补序列由900个核苷酸的5’玉米侧翼基因组dna序列(seq id no:3的核苷酸1-900)，14个核苷酸的t-dna序列(seq id no:3的核苷酸901-914)，286个核苷酸的水稻tuba终止子dna序列(seq id no:3的核苷酸915-1200)包含所述seq id no:3或其互补序列即可鉴定为转基因玉米事件kj1172的存在。
16.所述核酸序列可以为所述seq id no:4或其互补序列中转基因插入序列的任何部分的至少11个或更多个连续多核苷酸(第三核酸序列)，或者为所述seq id no:4或其互补序列中3’侧翼玉米基因组dna区域的任何部分的至少11个或更多个连续多核苷酸(第四核酸序列)。所述核酸序列进一步可以为同源于或互补于包含完整的所述seq id no:2的所述seq id no:4的一部分。当第三核酸序列和第四核酸序列一起使用时，这些核酸序列在产生扩增产物的dna扩增方法中包括dna引物组。使用dna引物对在dna扩增方法中产生的扩增产物是包括seq id no:2的扩增产物时，可以诊断转基因玉米事件kj1172或其后代的存在。所述seq id no:4或其互补序列为转基因玉米事件kj1172中在插入序列的3’末端位于插入接合部位附近的一个长度为1197个核苷酸的序列，所述seq id no:4或其互补序列由23个核苷酸的t-dna序列(seq id no:3的核苷酸1-23),256个核苷酸的胭脂碱合成酶基因的终止子nos序列(seq id no:3的核苷酸24-279),17个核苷酸的rb序列(seq id no:3的核苷酸280-296)、1个核苷酸的t-dna序列(seq id no:3的核苷酸297)和900个核苷酸的3’末玉米整合位点侧翼基因组dna序列(seq id no:4的核苷酸298-1197)组成，包含所述seq id no:4或其互补序列即可鉴定为转基因玉米事件kj1172的存在。
17.所述seq id no:5或其互补序列为位于seq id no:3内部序列，含5’端的t-dna的300bp，所述seq id no:6或其互补序列为位于seq id no:4内部序列，含3’端的t-dna的297bp。
18.所述seq id no:7或其互补序列为表征转基因玉米事件kj1172的长度为18592个核苷酸的序列，其为整个转基因表达盒，两端各延伸了50bp。所述seq id no:8或其互补序列为表征转基因玉米事件kj1172的长度为20475个核苷酸的序列，包含seq id no:1-7，包括5’玉米基因组侧翼序列，整个转基因表达盒和3’玉米基因组侧翼序列，其具体包含的基因组和遗传元件如表1所示。包含所述seq id no:8或其互补序列即可鉴定为转基因玉米事件kj1172的存在。
19.表1所述seq id no:8包含的基因组和遗传元件
[0020][0021]
所述核酸序列或其互补序列可用于dna扩增法中以产生扩增子，所述扩增子的检测诊断生物样品中转基因玉米事件kj1172或其后代的存在；所述核酸序列或其互补序列可用于核苷酸检测法中，以检测生物样品中转基因玉米事件kj1172或其后代的存在。
[0022]
为实现上述目的，本发明还提供了一种检测样品中转基因玉米事件kj1172的dna存在的方法，包括：使待检测样品与至少两种引物在核酸扩增反应中接触；
[0023]
进行核酸扩增反应；
[0024]
检测扩增产物的存在；
[0025]
所述扩增产物包括选自序列seq id no:1-8及其互补序列的核酸序列，即表示所述检测样品包含转基因玉米事件kj1172的dna存在。
[0026]
所述第一引物选自seq id no:1或其互补序列、seq id no:12；所述第二引物选自seq id no:2或其互补序列、seq id no:10；
[0027]
更具体的，所述第一引物选自seq id no:1或其互补序列、seq id no:12，所述第二引物选自seq id no:11；或者所述第一引物选自seq id no:2或其互补序列、seq id no:10，所述第二引物选自seq id no:9。
[0028]
为实现上述目的，本发明还提供了一种检测样品中转基因玉米事件kj1172的dna存在的方法，包括：
[0029]
使待测样品与探针接触，所述探针包含seq id no:8的部分序列及其互补序列，所述探针在严格杂交条件下选自seq id no:1-8或其互补序列的核酸序列的dna分子杂交，并在严格条件下不与不含选自seq id no:1-8或其互补序列的核酸序列的dna分子杂交；
[0030]
使所述待检测样品和所述探针在严格杂交条件下杂交；
[0031]
检测所述待检测样品和所述探针的杂交情况。
[0032]
所述严格条件可为在6
×
ssc(柠檬酸钠)、0.5％sds(十二烷基硫酸钠)溶液中，在65℃下杂交，然后用2
×
ssc、0.1％sds和1
×
ssc、0.1％sds各洗膜1次。
[0033]
在一些实施方式中，所述探针包括seq id no:3或其互补序列中至少11个连续的核苷酸、或者seq id no:4或其互补序列中至少11个连续的核苷酸；
[0034]
进一步地，所述探针包括seq id no:1或其互补序列中第1-11位或第12-22位连续核苷酸、seq id no:2或其互补序列中第1-11位或第12-22位连续核苷酸，seq id no:5或其互补序列、seq id no:6或其互补序列。
[0035]
可选择地，至少一个所述探针用至少一种荧光基团标记。
[0036]
为实现上述目的，本发明还提供了一种检测样品中转基因玉米事件kj1172的dna存在的方法，包括：
[0037]
使待检测样品与标记物核酸分子接触，所述标记物核酸分子包含seq id no:8的部分序列及其互补序列，所述标记物核酸分子在严格杂交条件下选自seq id no:1-8或其互补序列的核酸序列的dna分子杂交，并在严格条件下不与不含选自seq id no:1-8或其互补序列的核酸序列的dna分子杂交。
[0038]
使所述待检测样品和所述标记物核酸分子在严格杂交条件下杂交；
[0039]
检测所述待检测样品和所述标记物核酸分子的杂交情况，进而通过标记物辅助育种分析以确定昆虫抗性和/或除草剂耐受性与标记物核酸分子在遗传学上是连锁的。
[0040]
在一种实施方式中，所述标记物核酸分子包括seq id no:3或其互补序列中至少11个连续的核苷酸、或者seq id no:4或其互补序列中至少11个连续的核苷酸；
[0041]
进一步地，所述标记物核酸分子包含选自seq id no:1或其互补序列、seq id no:2或其互补序列、seq id no:5或其互补序列和seq id no:6或其互补序列的序列。
[0042]
为实现上述目的，本发明还提供了一种dna检测试剂盒，包括至少一个dna分子，所述dna分子包括seq id no:3的同源序列或其互补序列中至少11个连续的核苷酸、或者seq id no:4的同源序列或其互补序列中至少11个连续的核苷酸，其可以作为对于转基因玉米事件kj1172或其后代具有特异性的dna引物或探针。
[0043]
进一步地，所述dna分子包括seq id no:1或其互补序列中第1-11位或第12-22位连续核苷酸、或者seq id no:2或其互补序列中第1-11位或第12-22位连续核苷酸。
[0044]
更进一步地，所述dna分子包括seq id no:1的同源序列或其互补序列、seq id no:2的同源序列或其互补序列、seq id no:5的同源序列或其互补序列、或者seq id no:6的同源序列或其互补序列。
[0045]
为实现上述目的，本发明还提供了一种植物细胞，包含编码昆虫抗性vip3aa19蛋白、cry2ab2蛋白、cry1a.105蛋白的核酸序列、编码草甘膦除草剂耐受性cp4-epsps蛋白的核酸序列和特定区域的核酸序列，所述特定区域的核酸序列包括seq id no:1、seq id no:2、seq id no:5或seq id no:6所示的序列。
[0046]
为实现上述目的，本发明还提供了一种保护玉米植物免于昆虫侵袭的方法，包括在靶昆虫的膳食中提供至少一种包含转基因玉米植物细胞，所述转基因玉米植物细胞在其基因组中都包含选自seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6所示序列中至少一种核酸序列，摄食所述转基因玉米植物细胞的靶昆虫被
抑制进一步摄食所述玉米植物。具体的，所述转基因玉米植物细胞来源于转基因玉米事件kj1172。
[0047]
为实现上述目的，本发明还提供了一种保护玉米植物免受由除草剂引起的损伤的方法，包括将含有有效剂量草甘膦除草剂施加到种植至少一种转基因玉米植物的大田中，所述转基因玉米植物在其基因组中包含选自seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7和seq id no:8所示序列中至少一种核酸序列，所述转基因玉米植物具有对草甘膦除草剂的耐受性。具体的，所述所述转基因玉米植物为包含转基因玉米事件kj1172的转基因玉米植物。
[0048]
为实现上述目的，本发明还提供了一种控制种植玉米植物的大田中杂草的方法，包括将含有有效剂量草甘膦除草剂施加到种植至少一种转基因玉米植物的大田中，所述转基因玉米植物在其基因组中包含选自seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7和seq id no:8所示序列中至少一种核酸序列，所述转基因玉米植物具有对草甘膦除草剂的耐受性，具体的，所述所述转基因玉米植物为包含转基因玉米事件kj1172的转基因玉米植物。
[0049]
为实现上述目的，本发明还提供了一种培养对昆虫具有抗性的玉米植物的方法，包括：种植至少一粒玉米种子，所述玉米种子的基因组中包括编码昆虫抗性vip3aa19蛋白、cry2ab2蛋白、cry1a.105蛋白的核酸序列和特定区域的核酸序列；具体的，所述玉米种子可以是转基因玉米事件kj1172的玉米种子。
[0050]
使所述玉米种子长成玉米植株；
[0051]
用靶昆虫侵袭所述玉米植株，收获与其他不具有特定区域的核酸序列的植株或不具有所述转基因玉米事件kj1172的植株相比具有减弱的植物损伤的植株；
[0052]
所述特定区域的核酸序列选自seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7和seq id no:8所示序列中至少一种核酸序列。
[0053]
为实现上述目的，本发明还提供了一种培养对草甘膦除草剂具有耐受性的玉米植物的方法，包括：种植至少一粒玉米种子，所述玉米种子的基因组中包括编码草甘膦除草剂耐受性cp4-epsps蛋白的核酸序列和特定区域的核酸序列；
[0054]
使所述玉米种子长成玉米植株；
[0055]
用有效剂量草甘膦除草剂喷洒所述玉米植株，收获与其他不具有特定区域的核酸序列的植株相比具有减弱的植物损伤的植株；
[0056]
所述特定区域的核酸序列选自seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7和seq id no:8所示序列中至少一种核酸序列。具体的，所述玉米种子为转基因玉米事件kj1172的玉米种子。
[0057]
为实现上述目的，本发明还提供了一种培养对昆虫具有抗性的且耐受草甘膦除草剂的玉米植物的方法，包括：种植至少一粒玉米种子，所述玉米种子的基因组中包括编码昆虫抗性vip3aa19蛋白、cry2ab2蛋白、cry1a.105蛋白的核酸序列、编码草甘膦除草剂耐受性cp4-epsps蛋白的核酸序列和特定区域的核酸序列；
[0058]
使所述玉米种子长成玉米植株；
[0059]
用有效剂量草甘膦除草剂喷洒所述玉米植株，收获与其他不具有特定区域的核酸
序列的植株相比具有减弱的植物损伤的植株，所述具有减弱的植物损伤的植株对昆虫的摄食损伤也有抗性；
[0060]
所述特定区域的核酸序列选自seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7和seq id no:8所示序列中至少一种核酸序列。具体的，所述玉米种子为转基因玉米事件kj1172的玉米种子。
[0061]
为实现上述目的，本发明还提供了一种产生对昆虫具有抗性的玉米植株的方法，包括向所述玉米植株的基因组中引入编码昆虫抗性vip3aa19蛋白、cry2ab2蛋白、cry1a.105蛋白的核酸序列和特定区域的核酸序列，所述特定区域的核酸序列选自seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7和seq id no:8所示序列中至少一种核酸序列。
[0062]
具体地，所述产生对昆虫具有抗性的玉米植株的方法包括：
[0063]
将对昆虫具有抗性的转基因玉米事件kj1172第一亲本玉米植株与缺少昆虫抗性的第二亲本玉米植株有性杂交，从而产生大量子代植株；
[0064]
用靶昆虫侵袭所述子代植株；
[0065]
选择与其他不具有特定区域的核酸序列的植株相比具有减弱的植物损伤的所述子代植株；
[0066]
所述转基因玉米事件kj1172在其基因组中包含选自seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7和seq id no:8所示序列中至少一种核酸序列。
[0067]
为实现上述目的，本发明还提供了一种产生对草甘膦除草剂具有耐受性的玉米植株的方法，包括向所述玉米植株的基因组中引入编码草甘膦耐受性cp4-epsps蛋白的核酸序列和特定区域的核酸序列，所述特定区域的核酸序列选自seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7和seq id no:8所示序列中至少一种核酸序列。
[0068]
具体地，所述产生对草甘膦除草剂具有耐受性的玉米植株的方法包括：将对草甘膦除草剂具有耐受性的转基因玉米事件kj1172第一亲本玉米植株与缺少草甘膦耐受性的第二亲本玉米植株有性杂交，从而产生大量子代植株；
[0069]
用草甘膦除草剂处理所述子代植株；
[0070]
选择耐受草甘膦的所述子代植株；
[0071]
所述转基因玉米事件kj1172在其基因组中包含选自seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7和seq id no:8所示序列中至少一种核酸序列。
[0072]
为实现上述目的，本发明还提供了一种产生对昆虫具有抗性且耐受草甘膦除草剂施用的玉米植株的方法，包括：将草甘膦耐受和昆虫抗性的转基因玉米事件kj1172第一亲本玉米植株与缺少草甘膦耐受性和/或昆虫抗性的第二亲本玉米植株有性杂交，从而产生大量子代植株；
[0073]
用靶昆虫侵袭所述玉米植株，用草甘膦处理所述子代植株；
[0074]
选择耐受草甘膦且昆虫的摄食损伤也减弱的植株；
[0075]
所述转基因玉米事件kj1172在其基因组中包含选自seq id no:1、seq id no:2、
seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7和seq id no:8所示序列中至少一种核酸序列。
[0076]
为实现上述目的，本发明还提供了一种产生自转基因玉米事件kj1172加工品，加工品为玉米粉、玉米面、玉米油、玉米穗丝、玉米淀粉、玉米面筋、玉米饼、化妆品或填充剂。
[0077]
在本发明用于检测玉米植物的核酸序列及其检测方法中，以下定义和方法可以更好地定义本发明和指导本领域的普通技术人员实施本发明，除非另作说明，根据本领域普通技术人员的常规的用法来理解术语。
[0078]
引起外源dna的随机整合的转化程序会导致含有不同侧翼区的转化体，所述不同侧翼区是每个转化体所特异性含有的。当重组dna通过传统杂交被引入植物时，其侧翼区通常不会改变。转化体也会含有异源插入物dna和基因组dna的段之间或两段基因组dna之间或两段异源dna之间的独特的接合。
[0079]
本发明提供了称为kj1172的转基因玉米事件及其后代，所述转基因玉米事件kj1172即为玉米植物kj1172，其包括转基因玉米事件kj1172的植物和种子及其植物细胞或其可再生部分，所述转基因玉米事件kj1172的植物部分，包括但不限于细胞、花粉、胚珠、花、芽、根、茎、穗丝、花序、耳穗、叶和来自玉米植物kj1172的产物，例如玉米粉、玉米面、玉米油、玉米浆、玉米穗丝、玉米淀粉和留在玉米作物田间的生物量。
[0080]
本发明转基因玉米事件件kj1172包含dna构建体，当其在植物细胞内表达时，所述转基因玉米事件件kj1172获得对昆虫的抗性和对草甘膦除草剂的耐受性。
[0081]
在本发明的一些实施方式中，所述dna构建体包含四个串联的表达盒，第一个表达盒包含用于在植物中表达的适合的启动子和终止子，所述启动子可操作地连接来自农杆菌cp4菌株(agrobacterium sp.strain cp4)的cp4-epspsp 基因，cp4-epsps蛋白与草甘膦的亲和性小，在植物中表达cp4-epsps蛋白，可以在使用草甘膦时，在植物体内重建莽草酸合成途径，使转基因植物继续合成芳香族氨基酸，抵抗草甘膦除草剂；第二个表达盒包含用于在植物中表达的适合的启动子和终止子，所述启动子可操作性的连接到来自于苏云金杆菌(bacillus thuringiensis，bt)菌的昆虫抗性vip3aa19蛋白的核酸序列，所述的vip3aa19具有鳞翅目昆虫抗性，对黏虫小地老虎、草地贪夜蛾、棉铃虫具有高效毒杀作用；第三个表达盒包含用于在植物中表达的适合的启动子和终止子，所述启动子可操作地连接来自于苏云金杆菌(bacillus thuringiensis，bt)菌的cry1ab.105蛋白的核酸序列，所述cry1a.105蛋白由cry1ab、cry1ac和cry1f蛋白序列的组成部分构成，对黏虫、小地老虎、玉米螟具有较高的杀虫活性。第四个表达盒包含用于在植物中表达的适合的启动子和终止子，所述启动子可操作地连接，可操作性的连接到来自于苏云金杆菌(bacillus thuringiensis，bt)菌的昆虫抗性的cry2ab2蛋白的核酸序列，所述的cry2a2蛋白具有鳞翅目昆虫抗性，可以高效杀死棉铃虫、玉米螟、草地贪夜蛾等鳞翅目害虫的幼虫。
[0082]
在本发明转玉米事件kj1172同时表达的三个不同的抗虫蛋白中，cry1a.105蛋白和cry2ab2蛋白属于苏云金芽孢杆菌在产孢过程中形成的杀虫晶体蛋白(icps-insecticidal crystal proteins)，vip3aa19蛋白属于苏云金杆菌在营养期分泌到胞外的非晶体蛋白(vips-vegetative insecticidal proteins)。icps和vips具有相似的毒性活性和专一性，但分子结构和毒性机理各不相同。cry1a.105蛋白和cry2ab2蛋白尽管都属于杀虫晶体蛋白，但两个蛋白的结构很不一样，它们的氨基酸也仅有14％的相似性，它们各自
对不同鳞翅目昆虫肠道上的结合受体蛋白有不一样的亲和力，对不同鳞翅目害虫的毒害效率也就不一样。vip蛋白的抗虫机理和cry蛋白的相似，有膜竞争实验结果展示vip蛋白在昆虫肠道的中肠上皮膜上有着完全不同的结合受体。三个蛋白在靶标害虫中肠上皮细胞膜上的受体结合位点不同，由于抗性机制不同，而不存在交互抗性，可有效延缓害虫抗性发展，延长产品的生命周期。三个蛋白共同表达，使转玉米事件kj1172能够有效抵抗玉米主要鳞翅目害虫的危害，提高玉米种植者的收益。
[0083]
进一步地，所述启动子可以为从植物分离的适合启动子，所述适合启动子包括但不限于，水稻tuba启动子、玉米泛素蛋白(zmubiint)启动子、花椰菜花叶病毒(camv)35s启动子和玄参花叶病毒(fmv)35s启动子。所述终止子可以为从植物分离的适合终止子，所述终止子包括但不限于，水稻tuba终止子tuba ter、豌豆rbcs2 e9基因终止子e9、来源于花椰菜花叶病毒(camv)35s终止子、野生大麦的hsp17终止子和土壤农杆菌(agrobacterium tumefaciens)胭脂碱合成酶(nos)基因的终止子nos。
[0084]
此外，所述表达盒还可以包括其他的遗传元件，所述遗传元件包括但不限于，增强子和信号肽/转运肽核酸编码序列。所述增强子可以增强基因的表达水平，所述增强子包括但不限于，zmhsp70(玉米热激蛋白70的第一内含子，增强cry2ab2蛋白的稳定表达)、cab(小麦叶绿素a/b结合蛋白5’utr序列，增强cry1a.105稳定表达)和ract1(水稻肌动蛋白1第一内含子序列，增强cry1a.105稳定表达)。所述信号肽/转运肽包括但不限于，ctp2(编码叶绿体转运肽，将cp4-epsps蛋白定位到叶绿体中加工成成熟蛋白)和ssu-ctp(编码叶绿体转运肽，将cry2ab2蛋白定位到叶绿体中加工成成熟蛋白)。
[0085]
所述dna构建体采用转化方法被引入到植物中，所述转化方法包括但不限于，农杆菌(agrobacterium)介导转化法、基因枪转化法和花粉管通道转化法。
[0086]
dna构建体是dna分子互相连接起来的组合，该组合提供了一个或多个表达盒。dna构建体优选地是能够在细菌细胞内自我复制，而且含有不同的限制性内切酶位点的质粒，所含的限制性内切酶位点用于导入提供功能性基因元件，即启动子、内含子、前导序列、编码序列、3’终止子区域和其他序列的dna分子。dna构建体中所含有的表达盒包括提供信使rna的转录所必需的基因元件，所述表达盒可以设计为在原核细胞或真核细胞中表达。本发明的表达盒被设计为最优选地在植物细胞内表达。
[0087]
培养对鳞翅目昆虫具有抗性且对草甘膦除草剂具有耐受性的转基因玉米事件kj1172，通过以下步骤：首先使第一亲本玉米植物与第二亲本玉米植物有性杂交，从而产生了多样的第一代子代植株，所述第一亲本玉米植物由培育自转基因玉米事件kj1172及其后代的玉米植物组成，该转基因玉米事件kj1172及其后代是通过利用本发明的对鳞翅目昆虫具有抗性且对草甘膦除草剂具有耐受性的表达盒进行转化而得到的，第二亲本玉米植物缺乏对鳞翅目昆虫的抗性和/或对草甘膦除草剂具有耐受性；然后选择对鳞翅目昆虫的侵袭具有抗性和/或对草甘膦除草剂具有耐受性的子代植株，可以培育出对鳞翅目昆虫具有抗性且对草甘膦除草剂具有耐受性的玉米植物。这些步骤可以进一步包括使鳞翅目昆虫抗性和/或草甘膦耐受性的子代植株与第二亲本玉米植物或第三亲本玉米植物进行回交，然后通过用鳞翅目昆虫侵袭、草甘膦除草剂施加或通过与性状相关的分子标记物(如包含转基因玉米事件kj1172中插入序列的5’端和3’端鉴定出的接合位点的dna分子)的鉴定来选择子代，从而产生对鳞翅目昆虫具有抗性且对草甘膦除草剂具有耐受性的玉米植物。
[0088]
还应理解的是，两种不同的转基因植物也可以杂交以产生含有两个独立的、分离式添加的外源基因的后代。适当后代的自交可以得到对两个添加的外源基因来说都是纯合子的后代植株。如前所述的对亲本植株的回交和与非转基因植物的异型杂交也是可以预期的，无性繁殖也是同样的。
[0089]
术语“探针”是一段分离的核酸分子，其上面结合有常规的可检测标记或报告分子，例如，放射性同位素、配体、化学发光剂或酶类。这种探针与目标核酸的一条链是互补的，在本发明中，探针与来自转基因玉米事件kj1172基因组的一条dna链互补，不论该基因组dna是来自转基因玉米事件kj1172或种子还是来源于转基因玉米事件kj1172的植物或种子或提取物。本发明的探针不仅包括脱氧核糖核酸或核糖核酸，还包括特异性地与目标dna序列结合并可用于检测该目标dna序列的存在的聚酰胺及其他探针材料。
[0090]
基于本发明的侧翼基因组dna和插入序列的引物和探针可以通过常规方法确定，例如，通过从来源于转基因玉米事件kj1172的植物材料中分离相应的dna分子，并确定该dna分子的核酸序列。所述dna分子包含转基因插入序列和玉米基因组侧翼区域，所述dna分子的片段可以用作引物或探针。
[0091]
本发明的核酸探针和引物在严格条件下与目标dna序列杂交。任何常规的核酸杂交或扩增方法都可以用于鉴定样品中来源于转基因玉米事件kj1172的dna的存在。核酸分子或其片段在一定情况下能够与其他核酸分子进行特异性杂交。如本发明使用的，如果两个核酸分子能形成反平行的双链核酸结构，就可以说这两个核酸分子彼此间能够进行特异性杂交。如果两个核酸分子显示出完全的互补性，则称其中一个核酸分子是另一个核酸分子的“互补物”。如本发明使用的，当一个核酸分子的每一个核苷酸都与另一个核酸分子的对应核苷酸互补时，则称这两个核酸分子显示出“完全互补性”。如果两个核酸分子能够以足够的稳定性相互杂交从而使它们在至少常规的“低度严格”条件下退火且彼此结合，则称这两个核酸分子为“最低程度互补”。类似地，如果两个核酸分子能够以足够的稳定性相互杂交从而使它们在常规的“高度严格”条件下退火且彼此结合，则称这两个核酸分子具有“互补性”。从完全互补性中偏离是可以允许的，只要这种偏离不完全阻止两个分子形成双链结构。为了使一个核酸分子能够作为引物或探针，仅需保证其在序列上具有充分的互补性，以使得在所采用的特定溶剂和盐浓度下能形成稳定的双链结构。
[0092]
如本发明使用的，基本同源的序列是一段核酸分子，该核酸分子在高度严格条件下能够和相匹配的另一段核酸分子的互补链发生特异性杂交。促进dna杂交的适合的严格条件，例如，大约在45℃条件下用6.0
×
氯化钠/柠檬酸钠(ssc)处理，然后在50℃条件下用2.0
×
ssc洗涤，这些条件对本领域技术人员是公知的。例如，在洗涤步骤中的盐浓度可以选自低度严格条件的约2.0
×
ssc、50℃到高度严格条件的约0.2
×
ssc、50℃。此外，洗涤步骤中的温度条件可以从低度严格条件的室温约22℃，升高到高度严格条件的约65℃。温度条件和盐浓度可以都发生改变，也可以其中一个保持不变而另一个变量发生改变。优选地，本发明的一个核酸分子可以在中度严格条件下，例如在约2.0
×
ssc和约65℃下与seq id no:1-8中一个或多个核酸分子或其互补序列，或者上述序列的任一片段发生特异性杂交。更优选地，发明的一个核酸分子在高度严格条件下与seq id no:1-8中一个或多个核酸分子或其互补序列，或者上述序列的任一片段发生特异性杂交。本发明中，优选的标记物核酸分子具有seq id no:1、seq id no:2、seq id no:5或seq id no:6或其互补序列，或者上述序列
的任一片段。
[0093]
seq id no:1、seq id no:2、seq id no:5和seq id no:6可以用作植物育种方法中的标记物以鉴定遗传杂交的后代。探针与目标dna分子的杂交可以通过任何一种为本领域技术人员所熟知的方法进行检测，这些方法包括但不限于，荧光标记、放射性标记、抗体类标记和化学发光标记。
[0094]
关于使用特定的扩增引物对目标核酸序列进行的扩增(例如，通过pcr)，“严格条件”指的是在dna热扩增反应中仅允许引物对目标核酸序列发生杂交的条件，具有与目标核酸序列相应的野生型序列(或其互补序列)的引物，能够与所述目标核酸序列结合，并且优选产生唯一的扩增产物，扩增产物即扩增子。
[0095]
术语“特异性结合(目标序列)”是指在严格杂交条件下探针或引物仅与包含目标序列的样品中的目标序列发生杂交。
[0096]
如本发明使用的，“经过扩增的dna”或“扩增子”是指作为核酸模板一部分的目标核酸序列的核酸扩增产物。例如，为了确定玉米植物是否由含有本发明转基因玉米事件kj1172通过有性杂交方式产生，或采集自田地的玉米样品是否包含转基因玉米事件kj1172，或玉米提取物，例如粗粉、粉或油是否包含转基因玉米事件kj1172，从玉米植物组织样品或提取物提取的dna可以通过使用引物对的核酸扩增方法以产生对于转基因玉米事件kj1172的dna的存在是诊断性的扩增子。所述引物对包括一个来源于植物基因组中与插入的外源dna插入位点相邻的侧翼序列的第一引物，和来源于插入的外源dna的第二引物。扩增子具有一定长度和序列，所述序列对所述转基因玉米事件kj1172也是诊断性的。扩增子的长度范围可以是引物对的结合长度加上一个核苷酸碱基对，优选加上约五十个核苷酸碱基对，更优选加上约两百五十个核苷酸碱基对，最优选加上约四百五十个核苷酸碱基对或更多。
[0097]
可选的，引物对可以来源于插入dna两侧的侧翼基因组序列，以产生包括整个插入核苷酸序列的扩增子。来源于植物基因组序列的引物对中的一个可以位于距插入dna序列一定距离处，该距离的范围可以为一个核苷酸碱基对到约两万个核苷酸碱基对。术语“扩增子”的使用特别排除了在dna热扩增反应中形成的引物二聚体。
[0098]
插入的外源dna序列和来自转基因玉米事件kj1172的侧翼dna序列可以通过利用所提供的引物序列对转基因玉米事件kj1172的基因组进行扩增，扩增后对pcr扩增子或克隆的dna进行标准的dna测序。
[0099]
基于dna扩增方法的dna检测试剂盒含有dna引物分子，它们在适当的反应条件下特异性杂交到目标dna上并扩增诊断性扩增子。试剂盒可提供基于琼脂糖凝胶的检测方法或者现有技术已知的检测诊断性扩增子的许多方法。含有与seq id no:3或seq id no:4的玉米基因组区的任何部分同源或互补的、以及与seq id no:8的转基因插入区的任何部分同源或互补的dna引物的试剂盒是本发明所提供的。这些方法所产生的扩增子可以通过多种技术进行检测。其中一个方法是genetic bit analysis，该方法设计了一个跨越插入dna序列和相邻的侧翼基因组dna序列的dna寡核苷酸链。将该寡核苷酸链固定在一个微孔板的微孔内，在对目标区域进行pcr扩增后(在插入序列内和相邻的侧翼基因组序列中各使用一个引物)，单链pcr产物可与固定的寡核苷酸链进行杂交，并且作为单碱基延伸反应的模板，该延伸反应使用了dna聚合酶和为下一个预期的碱基特定标记的ddntps。可以通过荧光或
elisa类方法得到结果。信号代表了插入/侧翼序列的存在，其说明扩增、杂交和单碱基延伸反应是成功的。
[0100]
另一种方法是pyrosequencing(焦磷酸测序)技术。该方法设计了一个跨越插入dna序列和相邻的基因组dna结合部位的寡核苷酸链。将该寡核苷酸链和目标区域的单链pcr产物(在插入序列内和相邻的侧翼基因组序列中各使用一个引物)进行杂交，然后和dna聚合酶、atp、硫酰基酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、腺苷-5
’‑
磷硫酸盐和萤光素一起进行温育。分别加入dntps，测量产生的光信号。光信号代表了插入/侧翼序列的存在，其说明扩增、杂交、和单碱基或多碱基延伸反应是成功的。
[0101]
chen等(基因组研究(genome res.)9:492-498，1999)描述的荧光偏振现象也是可以用于检测本发明扩增子的一种方法。使用这种方法需要设计一个跨越插入dna序列和相邻的基因组dna结合部位的寡核苷酸链。将该寡核苷酸链和目标区域的单链pcr产物(在插入序列内和相邻的侧翼基因组序列中各使用一个引物)进行杂交，然后和dna聚合酶以及一种荧光标记的ddntp一起进行温育。单碱基延伸会导致插入ddntp。这种插入可以利用荧光仪测量其偏振的改变。偏振的改变代表了插入/侧翼序列的存在，其说明扩增、杂交和单碱基延伸反应是成功的。
[0102]
taqman被描述为一种检测和定量分析dna序列存在的方法，该方法在制造商所提供的使用说明中有详细介绍。现简要举例说明如下，设计一个跨越插入dna序列和相邻的基因组侧翼结合部位的fret寡核苷酸探针。该fret探针和pcr引物(在插入序列内和相邻的侧翼基因组序列中各使用一个引物)在热稳定聚合酶和dntps存在下进行循环反应。fret探针的杂交导致fret探针上荧光部分和淬灭部分的分裂以及荧光部分的释放。荧光信号的产生代表了插入/侧翼序列的存在，其说明扩增和杂交是成功的。
[0103]
基于杂交原理，用于检测来源于转基因玉米事件kj1172的植物材料的适合技术还可以包括southern印迹杂交、northern印迹杂交和原位杂交。特别地，所述适合技术包括温育探针和样品，洗涤以移除未结合的探针和检测探针是否已经杂交。所述的检测方法取决于探针所附标记的类型，例如，通过x光片曝光和显影可以检测放射性标记的探针，或通过底物转化实现颜色变化可以检测酶标记的探针。
[0104]
tyangi等(自然生物技术(nat.biotech.)14:303-308，1996)介绍了分子标记在序列检测中的应用。简要说明如下，设计一个跨越插入dna序列和相邻的基因组侧翼结合部位的fret寡核苷酸探针。该fret探针的独特结构导致其含有二级结构，该二级结构能够在近距离内保持荧光部分和淬灭部分。该fret探针和pcr引物(在插入序列内和相邻的侧翼基因组序列中各使用一个引物)在热稳定聚合酶和dntps存在下进行循环反应。经过成功的pcr扩增，fret探针和目标序列的杂交导致探针二级结构的丧失，从而使荧光部分和淬灭部分在空间上发生分离，产生荧光信号。荧光信号的产生代表了插入/侧翼序列的存在，其说明扩增和杂交是成功的。
[0105]
其他描述的方法，例如微流体(microfluidics)提供了分离和扩增dna样品的方法和设备。光染料用于检测和测定特定的dna分子。包含用于检测dna分子的电子传感器或结合特定dna分子的纳珠并因而可被检测的纳试管(nanotube)设备对于检测本发明的dna分子是有用的。
[0106]
可以使用本发明所述的引物对和dna检测领域描述的或已知的方法来开发dna检
测试剂盒。所述试剂盒有利于鉴定样品中是否存在转基因玉米事件kj1172的dna，还可以用于培育含有转基因玉米事件kj1172的dna的玉米植物。所述试剂盒可以含有dna引物或探针，其同源于或互补于seq id no:1、2、3、4、5、6、7或8的至少一部分，或含有其它dna引物或探针，其同源于或互补于转基因遗传元件中所含的dna，这些dna序列可以用于dna扩增反应，或作为dna杂交方法中的探针。
[0107]
在dna扩增方法中，作为引物的dna分子可以是来源于转基因玉米事件kj1172中转基因插入序列的任何部分，也可以是来源于转基因玉米事件kj1172中侧翼玉米基因组的dna区域的任何部分。
[0108]
转基因玉米事件kj1172可以与其他转基因玉米品种组合，例如除草剂(如草铵膦、麦草畏等)耐受性的玉米，或携带其他抗虫基因的转基因玉米品种。所有这些不同转基因事件的各种组合，与本发明的转基因玉米事件kj1172一起育种，可以提供抗多种虫害并抗多种除草剂的改良杂种转基因玉米品种。这些品种相比于非转基因品种和单性状的转基因品种可以表现出产量提升等更优异的特征。
[0109]
本发明提供了一种用于检测玉米植物的核酸序列及检测方法，转基因玉米事件kj1172的是对鳞翅目害虫的摄食损伤有抗性的，并且耐受含草甘膦的农业除草剂的植物毒性作用。
[0110]
该双重性状的玉米植株表达苏云金芽孢杆菌的vip3aa19、cry1a.105和cry2ab2蛋白，其提供了对鳞翅目害虫(如草地贪夜蛾、亚洲玉米螟、草地贪夜蛾、棉铃虫或黏虫)摄食损伤的抗性；且其表达土壤杆菌属菌株cp4的草甘膦抗性的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(epsps)蛋白，其赋予植物对草甘膦的耐受性。双重性状玉米能够有效抵抗玉米包括玉米螟、棉铃虫、草地贪夜蛾、黏虫等主要鳞翅目害虫的为害，能够耐受高浓度草甘膦除草剂，使玉米种植者在种植过程中使用更少的杀虫剂，减少生产投入。并且能够使用高效、广谱、廉价的草甘膦进行便捷的杂草管理，降低劳动力成本。在降低农民劳动投入和经济成本的基础上，vip3aa19、cry1a.105和cry2ab2蛋白多抗虫基因协同抗虫，除了降低农药的使用量，还为延缓靶标害虫抗性发展提供了综合治理策略，减少抗性治理所需要的庇护所面积，从而产生农业、经济和环境方面的综合效益。
[0111]
此外，编码昆虫抗性和草甘膦耐受性性状的基因连锁在同一dna区段上，并且存在于转基因玉米事件kj1172基因组的单一基因座上，这一点提供了增强的育种效率并使得能够用分子标记来追踪繁殖群体及其子代中的转基因插入片段。同时本发明检测方法中提供的dna引物或探针可以产生诊断为转基因玉米事件kj1172或其后代的扩增产物，能够快速、准确、稳定的鉴定出来源于转基因玉米事件kj1172的植物材料的存在。
附图说明
[0112]
图1为本发明用于检测玉米植物kj1172的核酸序列及其检测方法的转基因插入序列与玉米基因组结合部位的结构示意图；
[0113]
图2为本发明用于检测玉米植物kj1172的核酸序列及其检测方法的重组表达载体的结构示意图；
[0114]
图3为本发明的包含转基因玉米事件kj1172的转基因玉米对鳞翅目害虫离体抗性效果；
[0115]
图4为本发明的包含转基因玉米事件kj1172的转基因玉米在田间吐丝期人工接虫棉铃虫效果图；
[0116]
图5为本发明的包含转基因玉米事件kj1172的转基因玉米在田间大喇叭口期人工接虫东方黏虫效果图；
[0117]
图6为本发明的包含转基因玉米事件kj1172的转基因玉米在田间大喇叭口期人工接虫草地贪夜蛾效果图；
[0118]
图7为本发明的包含转基因玉米事件kj1172的转基因玉米在田间吐丝期人工接虫玉米螟效果图；
[0119]
图8为本发明的包含转基因玉米事件kj1172的转基因玉米在田间心叶期人工接虫玉米螟效果图；
[0120]
图9为本发明的包含转基因玉米事件kj1172的转基因玉米在喷施4倍剂量草甘膦除草剂的田间推荐喷施浓度的田间效果图；
[0121]
图10为转化体kj1172的3’端插入位点序列验证结果，其中m：分子量marker，1：对照pk0528质粒，2：受体对照玉米b104基因组dna为模板的扩增产物，3：空白对照，以水为模板扩增产物，4：以转化体kj1172基因组dna为模板的扩增产物；
[0122]
图11为转化体kj1172的5’端插入位点序列验证结果，其中m：分子量marker，1：对照pk0528质粒，2：受体对照玉米b104基因组dna为模板的扩增产物，3：空白对照，以水为模板扩增产物，4：以转化体kj1172基因组dna为模板的扩增产物；
[0123]
图12为kj1172的cp4-epsps基因探针southern杂交图谱，其中，图a中，1：marker，2：空白，3:pk0528质粒smai酶切，4：b104 hindⅲ酶切，5：kj1172的t2代hindⅲ酶切，6：kj1172 t3代的hindⅲ酶切；图b中，1：marker，2：空白，3:pk0528质粒smai酶切4：b104 kpnⅰ酶切，5：kj1172的t2代kpnⅰ酶切，6：kj1172的t3代kpnⅰ酶切；
[0124]
图13为kj1172的vip3aa19基因探针southern杂交图谱，图a中，1：marker，2：空白，3:pk0528质粒smai酶切，4：b104 hindⅲ酶切，5：kj1172的t2代hindⅲ酶切，6：kj1172 t3代的hindⅲ酶切；图b中，1：marker，2：空白，3:pk0528质粒smai酶切，4：b104 kpnⅰ酶切，5：kj1172 t2代kpnⅰ酶切，6：kj1172的t3代kpnⅰ酶切；
[0125]
图14为kj1172的cry1a.105基因探针southern杂交图谱，其中，图a中，1：marker，2：空白，3:pk0528质粒smai酶切，4：b104 hindⅲ酶切，5：kj1172的t2代hindⅲ酶切，6：kj1172 t3代hindⅲ酶切；图b中，1：marker，2：空白，3:pk0528质粒smai酶切，4：b104 kpnⅰ酶切，5：kj1172 t2代kpnⅰ酶切，6：kj1172的t3代kpnⅰ酶切；
[0126]
图15为kj1172的cry2ab2基因探针southern杂交图谱，图a中，1：marker，2：空白，3:pk0528质粒smai酶切，4：b104 hindⅲ酶切，5：kj1172的t2代hindⅲ酶切，6：kj1172 t3代hindⅲ酶切；图b中，1：marker，2：空白，3:pk0528质粒smai酶切，4：b104 kpnⅰ酶切，5：kj1172 t2代kpnⅰ酶切，6：kj1172的t3代kpnⅰ酶切；
[0127]
图16为southern杂交所使用的地高辛标记marker迁移率差异对比；
[0128]
图17为转基因植株的草甘膦抗性情况的抗性分级标准示例，其中0-4分别代表0级-4级。
具体实施方式
[0129]
下面结合实施例对本发明进行进一步说明和描述，但所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明和实施例中，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他发明和实施例，都属于本发明保护的范围。
[0130]
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0131]
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0132]
实施例1、克隆与转化
[0133]
1.1载体克隆
[0134]
使用标准的基因克隆技术构建重组表达载体pk0528(如图2所示)。所述载体pk0528包含4个串联的转基因表达盒，第一个表达盒由水稻tuba启动子，可操作地连接到叶绿体转运肽ctp2，将cp4-epsps蛋白定位到叶绿体中加工成成熟蛋白，可操作地连接到土壤杆菌属cp4菌株的草甘膦耐受性的5-烯醇-丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(cp4-epsps)上，并可操作地连接到水稻tuba终止子。第二个表达盒由玉米泛素启动子(zmubiint)，可操作地连接到苏云金芽孢杆菌的昆虫抗性的vip3aa19蛋白上，并可操作性的连接到豌豆rbcs2 e9基因终止子e9和花椰菜花叶病毒(camv)的35s终止子上。第三个表达盒由花椰菜花叶病毒35s启动子(e35s)，可操作地连接到增强cry1a.105稳定表达的小麦叶绿素a/b结合蛋白5’utr序列cab上，和水稻肌动蛋白1第一内含子序列ract1，可操作地连接到苏云金芽孢杆菌的昆虫抗性的cry1a.105蛋白上，并可操作地连接到野生大麦的hsp17终止子。第四个表达盒由玄参花叶病毒35s启动子(fmv)，可操作地连接到将cry2ab2蛋白定位到叶绿体中加工成成熟蛋白的叶绿体转运肽ssu-ctp上，可操作地连接到苏云金芽孢杆菌的昆虫抗性的cry2ab2蛋白上，并可操作地胭脂碱合酶的转录终止子(nos)上而组成。t-dna转移所需来自农杆菌c58的t-dna右边界序列(rb)的一部分插入序列，以及位于转基因插入序列3’末端的转基因玉米事件kj1172侧翼基因组区域(seq id no:8)。
[0135]
1.2植物转化
[0136]
采用常规的农杆菌侵染法进行转化，将无菌培养的玉米(玉米自交系b104)幼胚与农杆菌共培养，以将构建的重组表达载体pk0528中的t-dna转入到玉米染色体组中，以产生转基因玉米事件kj1172，具体操作如下：
[0137]
1)准备pk0528农杆菌菌液
[0138]
将-80℃冰箱中保存的菌液涂在添加抗生素利福平和卡那霉素的yeb培养基上，28℃黑暗培养48h。
[0139]
使用前，用接种环收集平板上生长的农杆菌，用inf-as培养基悬浮，稀释菌液，od600为0.5。
[0140]
2)准备幼胚
[0141]
取授粉后约12天的玉米果穗。脱去包叶，75％酒精表面处理30sec，1％次氯酸钠处理40min，无菌水洗三次。室温剥取幼胚，放入装有2ml inf培养基的离心管中。用新的inf洗液洗涤两次，最后在管内留少部分inf恰好能浸没幼胚。
[0142]
3)幼胚预处理
[0143]
将上述装有幼胚的离心管放入45℃水浴锅，处理5min。
[0144]
水浴完成后，迅速取出离心管冰浴2min。
[0145]
4)农杆菌侵染幼胚
[0146]
将上述离心管中剩余的inf吸掉，加入1ml配好的农杆菌菌液，上下颠倒离心管20次，静置5分钟。
[0147]
5)共培养
[0148]
侵染完成后，幼胚和侵染液转移到共培养基，将培养基上多余的农杆菌悬浮液残液用移液器吸净，调整幼胚摆放方向，使其胚轴面接触培养基，即盾片朝上。封口膜将培养皿密封，28℃暗培养3天。
[0149]
6)恢复培养
[0150]
共培养3天后，幼胚转接到恢复培养基上28℃黑暗培养14天。
[0151]
7)筛选培养
[0152]
将恢复培养14天的幼胚转入筛选培养基，28℃黑暗培养14天。14天后，用同样的培养基继代一次。
[0153]
8)分化培养
[0154]
将筛选两轮后，生长旺盛的愈伤转到分化培养基，28℃光照培养14天。
[0155]
9)再生苗生根
[0156]
经分化培养后，将分化出的约2cm的幼苗转入盛有生根培养基的生根罐，28℃光照培养14天。
[0157]
10)幼苗移栽
[0158]
经14天生根培养，将长有发达根系的幼苗移栽温室小盆，罩罩子保湿，3天后去除罩子。经2周缓苗和pcr检测后，将阳性植株移栽大盆，26℃16h光照培养，直至开花结种。
[0159]
1.3转基因事件的鉴定和筛选
[0160]
通过taqmantm分析(参见实施例2)检测再生的转基因玉米植株是否存在cp4-epsps、vip3aa19、cry1a.105、cry2ab2基因，并表征昆虫抗性和草甘膦除草剂耐受性品系的拷贝数。根据目的基因的拷贝数、良好的昆虫抗性、草甘膦除草剂耐受性和农艺性状表现(参见第5实施例和第6实施例)，通过筛选，选定了事件kj1172是优异的，其具有单拷贝转基因、良好的昆虫抗性、草甘膦除草剂耐受性和农艺性状表现。
[0161]
实施例2、用taqman进行转基因玉米事件kj1172检测
[0162]
取转基因玉米事件kj1172的叶片20mg，提取其基因组dna。通过taqman探针荧光定量pcr方法检测cp4-epsps、vip3aa19、cry1a.105、cry2ab2的拷贝数,所用引物及探针序列如下表2-5中所示。同时以野生型玉米植株作为对照，按照上述方法进行检测分析。
[0163]
表2检测cp4-epsps用引物探针序列
[0164]
引物名称引物序列(5
’‑3’
)序列表中编号引物1ggcagccttcgtatcggagseqidno:13引物2ctcgtgtcggaaaaccctgtseqidno:14探针1caggtccatgaactccgggaagctcseqidno:15
[0165]
表3检测vip3aa19用引物探针序列
[0166][0167][0168]
表4检测cry2ab2用引物探针序列
[0169]
引物名称引物序列(5
’‑3’
)序列表中编号引物5ccagaacttcaactgctccacseqidno:19引物6aagggtggtctcgaaggacseqidno:20探针3caccgtcaccaactggcaaaccseqidno:21
[0170]
表5检测cry1a.105用引物探针序列
[0171]
引物名称引物序列(5
’‑3’
)序列表中编号引物7caccgatgaacggaatgctaacseqidno:22引物8gaccactaccacgaccgcaaseqidno:23探针4cgtgtcgctgatcttgcctccttctgtseqidno:24
[0172]
反应体系10ul如下：
[0173][0174]
每毫升50
×
引物探针混合物包含1mm浓度的每种引物各15μl、100μm浓度的探针50ul、无菌水920ul，并且在4℃、在棕色避光试管中贮藏。
[0175]
扩增程序如下：
[0176][0177]
利用软件quantstudio design&analysis software(appliedbiosystems)分析数据，获得单拷贝的转基因玉米事件。
[0178]
实施例3、转化体kj1172插入位点分析及转化体特异性pcr检测
[0179]
1.试验目的
[0180]
通过tail-pcr技术扩增转化体插入序列的插入位点的侧翼序列，根据侧翼序列信息建立kj1172的转化体特异性pcr检测体系，并对转化体t2代、t3代进行检测，确定插入序列整合位点的遗传稳定性。
[0181]
2.试验材料
[0182]
目的基因插入位点的分析试验材料以转化体kj1172的基因组dna为模板，进行tail-pcr分析和插入位点的特异性pcr验证，建立转化体特异性pcr检测方法。
[0183]
转化体特异性pcr体系的建立及插入序列在基因组中整合位点稳定性的检测材料
为随机选取的喷洒草甘膦后生长良好的转化体玉米，随机选取kj1172的t2、t3代的植株各4株进行检测，以pk0528质粒作为载体对照，受体b104作为阴性对照，以水为模板作为空白对照，以转化体kj1172作为姐妹转化体对照。
[0184]
3.试验方法
[0185]
1)基因组的提取：
[0186]
采用ctab法提取植物叶片dna
[0187]
2)插入序列3’端侧翼序列分析方法：
[0188]
根据文献设计特异引物(参考文献：liu y g,high-efficiency thermal asymmetric interlaced pcr for amplification of unknown flanking sequences.biotechniques,2007)设计特异引物pk0528-f1、pk0528-f2和pk0528-f3，设计tail-pcr简并引物lad1、lad2、lad3、lad4和ac1，具体序列如下表6所示。
[0189]
表6引物名称及序列
[0190]
引物名称引物序列(5
’‑3’
)序列表中编号pk0528-f1caaccagacacgcaccttcatctccseqidno:25pk0528-f2acgatggactccagtccggccgtacctgcgcgtcagctccattggseqidno:26pk0528-f3ctggacatcaacgtgaccctgaactctseqidno:9lad1acgatggactccagagcggccgcvnvnnnggaaseqidno:27lad2acgatggactccagagcggccgcbnbnnnggttseqidno:28lad3acgatggactccagagcggccgcvvnvnnnccaaseqidno:29lad4acgatggactccagagcggccgcbdnbnnncggtseqidno:30ac1acgatggactccagagseqidno:31
[0191]
分三轮tail-pcr：进行以转化体基因组dna为模板，以pk0528-f1引物分别与lad1、lad2、lad3、lad4进行第一轮tail-pcr反应；以第一轮扩增产物为模板，pk0528-f2和ac1为引物进行第二轮tail-pcr反应；以第二轮扩增产物为模板，pk0528-f3和ac1为引物进行第三轮tail-pcr反应。经过三轮扩增后，将tail pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，并对目标带进行回收，以pk0528-f3为测序引物进行测序，获得插入序列的插入位点侧翼序列，并通过特异性pcr检测引物确认该插入位点的准确性。
[0192]
a.第一轮tail-pcr
[0193]
扩增体系:
[0194][0195][0196]
扩增程序:
[0197][0198]
b.第二轮tail-pcr
[0199]
扩增体系:
[0200][0201]
扩增程序:
[0202][0203][0204]
c.第三轮tail-pcr
[0205]
扩增体系:
[0206][0207]
扩增程序:
[0208][0209]
3)插入序列3’端侧翼序列验证
[0210]
根据tail pcr获得的3’端侧翼序列信息在基因组和插入序列上分别设计引物172chr8-1r(seq id no:10)和pk0528-f3(tail pcr第三轮特异引物seq id no:9)，以kj1172基因组dna为模板进行扩增，并对扩增产物进行测序和分析，验证tail pcr结果的准确性，确定插入序列的插入位点的具体信息及其侧翼序列的真实情况。
[0211]
t-dna 3’端插入位置特异pcr检测扩增体系:
[0212][0213]
t-dna 3’端插入位置特异pcr检测反应程序:
[0214][0215]
4)插入序列5’端侧翼序列分析方法：
[0216]
在插入序列3’端已经找到的插入位点chr2：9451739的位置的上游(相对于插入序列的上游)和插入序列5’末端序列分别设计引物172chr8-1f(seq id no:12)和pk0528-5'r(seq id no:11)，以kj1172基因组dna为模板进行扩增，扩增产物进行测序和比对分析，确定插入序列的5’端边界位置及其侧翼序列。
[0217]
t-dna插入位置特异pcr检测扩增体系:
[0218][0219]
t-dna插入位置特异pcr检测扩增程序：
[0220][0221]
5)转化体特异性pcr方法的建立
[0222]
根据获得的转化体kj1172具体插入序列及其旁侧序列，设计特异性pcr检测所用的5’端和3’端特异性的检测引物，用以定性鉴定转化体kj1172。5’端特异性检测引物：172chr8-1f(seq id no:12)和pk0528-5'r(seq id no:11)，3’端特异性检测引物：172chr8-1r(seq id no:10)和pk0528-f3(tail pcr第三轮特异引物seq id no:9)。
[0223]5’
端pcr反应体系:
[0224]
[0225]3’
端pcr反应体系:
[0226][0227]
特异性pcr反应条件：
[0228][0229]
4.实验结果
[0230]
1)插入序列3’和5’端插入位点
[0231]
使用引物pk0528-f3送测序，根据测序结果与参考序列b104 isu_usda 0.1assembly的进行比对，得到t-dna区3’端插入位置。根据参考序列设计并使用下列引物对t-dna的3’端及5’端进行pcr，送测序。分别得到t-dna3’端及5’端的侧翼序列。在seq id no:8的核苷酸1-982位显示的为玉米基因组序列在转基因玉米事件kj1172插入序列的右边界侧翼，在seq id no:8的核苷酸19475-20475位显示的为玉米基因组序列在转基因玉米事件kj1172插入序列的左边界侧翼。5’接合序列在seq id no:3中列出，3’接合序列在seq id no:4中列出。
[0232]
根据所获得的棉花侧翼序列进行对比分析，转化事件kj1172中外源dna插入序列的整合位点位于受体玉米的第8号染色体上。5’端侧翼序列参考基因组位置chr8:88621726-88622707；3’端侧翼序列，参考基因组位置chr8:88622726-88623726。
[0233]
2)转化体特异性pcr检测结果及其稳定性
[0234]
随机选取喷洒草甘膦后生长良好的转化体玉米、kj1172的t2代的植株各3株为检测样本，以pk0528质粒作为载体对照，受体b104作为阴性对照，以水为模板作为空白对照，分别利用5’端特异性检测引物172chr8-1f(seq id no:12)和pk0528-5'r(seq id no:11)及3’端特异性检测引物pk0528-f3(tail pcr第三轮特异引物seq id no:9)和172chr8-1r(seq id no:10)进行pcr检测。如图10-11结果显示：在t2代随机抽取的各3个植株中能检测到大小一致的828bp和1052bp目标片段，与预期一致，其他所有对照中均没有扩增出条带，说明转化体的5’端特异性pcr检测和3’端特异性pcr检测体系均具有特异性检测转化体kj1172的作用，检测结果同时显示，kj1172的外源基因在8号染色体chr8:88621726-88623726之间的整合是能够稳定遗传的。
[0235]
实施例4、通过southern印迹杂交进行转基因玉米事件kj1172检测
[0236]
以载体质粒pk0528作为阳性对照，非转基因玉米受体b104作为阴性对照，以转化体kj1172不同世代植物作为样本，进行southern杂交，获得具有转化体特异性的分子杂交
图谱。利用southern杂交分析转基因玉米kj1172外源插入序列的拷贝数，以及该事件不同世代之间的稳定性。
[0237]
1.用于southern印迹杂交的dna提取
[0238]
取2g待测样品叶片，加入石英砂、液氮，充分研磨后，将粉末倒入50ml离心管中；
[0239]
待离心管中液氮挥发完全后，加入10ml dna提取buffer，室温下剧烈振荡10-15min；
[0240]
加入5ml苯酚，轻摇5～10min；再加入5ml氯仿，继续轻摇10～15min；
[0241]
垂直转头8000rpm，水平转头3800rpm，室温离心10min；
[0242]
吸取上清，加入等体积异丙醇，轻柔晃动离心管，使异丙醇与上清液充分混匀，可见白色絮状dna；
[0243]
将dna沉淀挑入一新的1.5ml离心管中，加入1ml 70％的乙醇，洗涤沉淀；
[0244]
沉淀干燥后加入800ul无菌水(含终浓度50μg/ml的rnasea)溶解，37℃消化rna 0.5～1hr；每管取1ul跑电泳，观察rnase是否已经被除净；
[0245]
每管加入蛋白酶k(20mg/ml)10ul，加入10x蛋白酶k buffer稀释至1x，充分混匀。37℃反应1小时；
[0246]
等体积苯酚/氯仿、氯仿各抽提一次；轻摇10～15min，12000rpm，离心15min；
[0247]
上清加入1/10倍体积3m naac，充分混匀，再加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀后，于-20℃放置30min以上，12，500rpm，4℃离心15min，弃上清；
[0248]
70％乙醇洗涤dna沉淀，干燥后溶于适量te或水300μl中；
[0249]
取少许dna，琼脂糖凝胶上检查其质量并进行dna量的标定，其余dna样品保存在-20℃备用。
[0250]
2.探针设计
[0251]
根据pk0528载体中的目的基因序列信息设计目的基因检测的探针引物如表7所示。
[0252]
表7制备探针所用引物的信息
[0253][0254]
3.限制酶消化
[0255]
取10g待测植株及野生型对照植株的dna样品用120μl体系进行酶切，所用的酶包括(hindiii和kpni)加入300μl内切酶，酶切过夜，第二天补加75μl内切酶，继续酶切3h。
[0256]
4.凝胶电泳
[0257]
a.制备0.7％琼脂糖凝胶，需加eb；制大板胶，用大孔梳子；
[0258]
b.酶切完后，将酶切产物加入500μl超纯水，加入600μl异丙醇，-20℃沉淀2h，12000rmp离心10min；
[0259]
c.弃上清，加入75％乙醇洗涤，6000rpm，3min。放置于超净台吹干；
[0260]
d.加入50μl超纯水溶解，加入6μl 10*lording buffer，56℃水浴3min；
[0261]
e.上样，静置2min，20v电泳过夜。阳性对照的上样量为10ng。
[0262]
5.杂交
[0263]
a.转膜：将胶照相，切掉多余的胶，在右上角切一个角；用去离子水冲洗，放入变性缓冲液中，震荡45min，用去离子水短暂浸泡，再放入中和缓冲液中，震荡30min，倒掉，换新的中和缓冲液，震荡15min；裁滤纸，18
×
38cm两张，胶块大小两张，尼龙膜胶块大小一张。尼龙膜用去离子水润湿5-10min；找一个白瓷盘，上面放一块玻璃板(先用洗涤剂洗净晾干，再用酒精擦干净)，在白瓷盘中倒入20
×
ssc，将两张滤纸盖到玻璃板上，用20
×
ssc润湿且赶走气泡。在滤纸上一次放胶块(倒置)、尼龙膜跟胶块同一位置剪一个角、两张滤纸，每次放都需赶净气泡。用保鲜袋封住四周，然后放上吸水纸，吸水纸上放一块玻璃板，玻璃板用重物压住。转膜1天。
[0264]
b.dna固定：转膜结束后，将尼龙膜与胶块接触的一面用铅笔写个正字。将膜用10
×
ssc冲洗一下，紫外交联仪交联2min。然后用去离子水冲洗，室温晾干。
[0265]
c.预杂交:预热适量dig easy hyb(10ml/100cm2膜)。同时将膜放入杂交管中，胶联dna的一面朝上，加入10ml(膜的面积小于100cm2)dig easy hyb，25℃预杂交30min，同时旋转杂交管。
[0266]
d.杂交：将dig标记的探针用dig easy hyb稀释至25ng/ml，(3.5ml/100cm2膜)沸水煮5min，迅速放入冰浴；将稀释后的探针加入到预热后的dig easy hyb中，混匀但同时要避免产生气泡；倒掉预杂交液，加入混匀后的探针，42℃杂交过夜，同时旋转杂交管。
[0267]
e.洗膜：将杂交液倒掉或回收，加20ml 2
×
ssc含0.1％ sds，25℃在杂交炉中旋转洗涤5min
×
2；弃废液，加20ml 0.5
×
ssc含0.1％ sds，65℃在杂交炉中旋转洗涤15min
×
2；当杂交并洗膜后，弃废液，加入20ml washing buffer，37℃在杂交炉中旋转洗涤5min；弃废液，加100ml blocking solution 37℃在杂交炉中旋转孵育30min；弃废液，加20ml antibody solution 37℃在杂交炉中旋转孵育30min；弃废液，加100ml washing buffer 37℃在杂交炉中旋转孵育15min
×
2；弃废液，加10ml detection buffer 37℃在杂交炉中旋转孵育5min；将杂交袋剪开，将有dna的一面朝上放到杂交袋上，加1ml cspd ready-to-use到膜上，马上用杂交袋第二页盖上，不要有气泡，室温孵育5min；挤出多余液体，如有气泡要挤出，然后用封边机封边；将膜放于37℃反应10min以加强发光反应。
[0268]
f.成像：将膜放天能发光成像系统中，调整曝光时间1-15min，以获得最佳southern杂交照片。
[0269]
6.结果与讨论
[0270]
(1)kj1172事件cp4-epsps基因的特异性探针杂交结果分析
[0271]
如图12所示，阳性对照smaⅰ酶切后pk0528质粒杂交条带大小为19.3kb，符合预期；如图12-a所示，hindⅲ酶切后，kj1172的t2、t3代材料杂交条带均为17kb左右一条杂交条带，大于15kb符合预期，阴性对照b104没有任何杂交条带；如图12-b所示，当采用kpnⅰ酶切时，kj1172的t2、t3代材料杂交条带均为6kb左右一条杂交条带，大于5.6kb符合预期，阴性
对照b104没有任何杂交条带；两种酶切都表明pk0528的t-dna区域已经整合到事件kj1172基因组当中，且是单拷贝。t2、t3代材料杂交条带大小、数量完全一致，表明事件kj1172的插入序列在不同世代中能够稳定遗传。
[0272]
表8kj1172的cp4-epsps基因的特异性探针杂交结果
[0273][0274][0275]
(2)kj1172事件vip3aa19基因的特异性探针杂交结果分析
[0276]
如图13所示，阳性对照smaⅰ酶切后pk0528质粒杂交条带大小为19.3kb，符合预期；如图13中a所示，hindⅲ酶切后，kj1172 t2、t3代材料杂交条带均为17kb左右一条杂交条带，大于15kb符合预期，阴性对照b104没有任何杂交条带；如图13中b所示，当采用kpnⅰ酶切时，kj1172t2、t3代材料杂交条带均为23kb左右一条杂交条带，大于13.7kb符合预期，阴性对照b104没有任何杂交条带；两种酶切都表明pk0528的t-dna区域已经整合到事件kj1172基因组当中，且是单拷贝。t2、t3代材料杂交条带大小、数量完全一致，表明事件kj1172的插入序列在不同世代中能够稳定遗传。
[0277]
表9kj1172的vip3aa19基因的特异性探针杂交结果分析
[0278][0279]
(3)kj1172事件cry1a.105基因的特异性探针杂交结果分析
[0280]
如图14所示，阳性对照smaⅰ酶切后pk0528质粒杂交条带大小为19.3kb，符合预期；如图14-a所示，hindⅲ酶切后，kj1172t2、t3代材料杂交条带均为17kb左右一条杂交条带，大于15kb符合预期，阴性对照b104没有任何杂交条带；如图14-b所示，当采用kpnⅰ酶切时，kj1172t2、t3代材料杂交条带均为23kb左右一条杂交条带，大于13.7kb符合预期，阴性对照b104没有任何杂交条带；两种酶切都表明pk0528的t-dna区域已经整合到事件kj1172基因组当中，且是单拷贝。t2、t3代材料杂交条带大小、数量完全一致，表明事件kj1172的插入
序列在不同世代中能够稳定遗传。
[0281]
表10kj1172的cry1a.105基因的特异性探针杂交结果分析
[0282][0283]
(4)kj1172事件cry2ab2的特异性探针杂交结果分析
[0284]
如图15所示，阳性对照smaⅰ酶切后pk0528质粒杂交条带大小为19.3kb，符合预期；如图15-a所示，hindⅲ酶切后，kj1172的t2、t3代材料杂交条带均为4.6kb左右一条杂交条带，大于4.3kb符合预期，阴性对照b104没有任何杂交条带；如图15-b所示，当采用kpnⅰ酶切时，kj1172t2、t3代材料杂交条带均为23kb左右一条杂交条带，大于13.7kb符合预期，阴性对照b104没有任何杂交条带；两种酶切都表明pk0528的t-dna区域已经整合到事件kj1172基因组当中，且是单拷贝。t2、t3代材料杂交条带大小、数量完全一致，表明事件kj1172的插入序列在不同世代中能够稳定遗传。
[0285]
表11kj1172的cry2ab2基因的特异性探针杂交结果分析
[0286][0287]
由于使用的marker预先用地高辛标记过，在电泳过程中，其迁移速率比未经标记的样本dna略慢，导致其指示的条带大小比实际偏小，具体偏差程度见图17(其中左侧为地高辛标记marker，右侧为购于thermo的1kb marker，琼脂糖凝胶浓度为1.5％)。
[0288]
实施例5、昆虫抗性检测
[0289]
1.玉米植物kj1172的生物测定
[0290]
将转基因玉米事件kj1172和野生型b104玉米植株，在玉米4-5叶期，取与培养皿大小相同的叶片放置于培养皿中接虫。接虫后用透气胶带密封，防止幼虫逃逸和保持皿内湿度。放入26.5-27℃，湿度：70％，l:d＝16:8培养箱中饲养。接虫3d后调查死亡率，并计算校正死亡率。统计死亡率，通过校正死亡率对抗性水平进行鉴定，校正死亡率(％)＝(1-存活数/接虫数-野生型对照死亡率)/(1-野生型对照死亡率)
×
100％，
[0291]
如图3和表12所示，结果显示：4种靶标昆虫在取食转基因玉米事件kj1172的叶片3天后，校正死亡率均高于90％，而在亚洲玉米螟和东方黏虫取食3天后，受体对照的死亡率
1.1～3.0抗r3.1～5.0中抗mr 5.1～7.0感s≥7.1高感hs
[0302]
表15转基因玉米事件kj1172吐丝期接种棉铃虫的抗性结果
[0303]
受试样本雌穗平均被害级别抗性kj11721.25高抗hr对照b1047.27高感hs
[0304]
(2)东方黏虫
[0305]
转化体kj1172、受体对照b104各种植三次重复，相互间隔距离(1米以上)，行距60cm，株距25cm，按照夏玉米常规播种时间、播种方式和播种量进行播种。在玉米大喇叭口期(展11-13叶期)人工接虫，每个处理人工接虫不少于20株。每株接初孵幼虫20-30头，接于玉米心叶上，接虫3d后，第二次接虫，接虫数量与第一次相同。在人工接虫14天后，调查玉米叶片受黏虫的为害程度和幼虫存活数，计算各处理玉米叶片的为害级别平均值，按照农业部953号公告-10.1-2007标准对接虫后的结果进行调查和统计，然后按标准判别玉米对东方黏虫的抗性水平。
[0306]
通过展6-8叶期抗虫性鉴定试验结果的分析，可以看出，在人工接东方黏虫两周后，受体对照b104叶片全部被咬，叶片上有2-5只黏虫存活；而转化体kj1172仅个别叶片上有1～4个孔径≤1mm的虫孔。转基因玉米的平均食叶级别为1.2，抗性类型为“高抗”；受体对照b104的平均食叶级别为8.33，抗性类型为“高感”，转基因玉米事件kj1172大喇叭口期对东方黏虫的抗性结果如表18所示，田间效果如图5所示。
[0307]
表16玉米叶片受东方黏虫危害程度的分级标准
[0308][0309]
表17玉米对黏虫的抗性评价标准
[0310]
食叶级别平均标准抗性类型1.0～2.0高抗hr2.1～4.0抗r4.1～6.0中抗mr6.1～8.0感s8.1～9.0高感hs
[0311]
表18转基因玉米事件kj1172对东方黏虫的抗性结果
[0312][0313][0314]
(3)草地贪夜蛾
[0315]
转化体kj1172、受体对照b104各种植三次重复，相互间隔距离(1米以上)，行距60cm，株距25cm，按照夏玉米常规播种时间、播种方式和播种量进行播种。在田间大喇叭口期人工接草地贪夜蛾，每个处理人工接虫不少于20株。每株接初孵幼虫20-30头，接于玉米心叶上，接虫3d后，第二次接虫，接虫数量与第一次相同。在人工接虫14～21天后进行，逐株调查被咬情况、每个株存活幼虫数。根据被咬情况、每个株存活幼虫数，计算各处理叶片的为害级别平均值，按照农业部953号公告-10.1-2007标准中描述的黏虫为害分级标准和抗性评价标准对接虫后的结果进行调查和统计，评价抗虫性。
[0316]
通过大喇叭口期抗虫性鉴定试验结果的分析，可以看出，在人工接草地贪夜蛾两周后，受体对照b104的叶片全部被咬，少数叶片被取吃，部分叶片上有大片缺刻(≤10mm)，叶片上有2-5头幼虫存活；而转化体kj1172仅个别叶片上有1～6个孔径≤1mm的虫孔。转基因玉米的平均食叶级别为1.25，抗性类型为“高抗”；受体对照b104的平均食叶级别为8.21，抗性类型为“高感”，转基因玉米事件kj1172大喇叭口期对草地贪夜蛾的抗性结果如表19所示，田间效果如图6所示。
[0317]
表19转化体kj1172的草地贪叶蛾抗性水平
[0318]
受试样本雌穗平均被害级别抗性kj11721.25高抗对照b1048.21高感
[0319]
(4)玉米螟
[0320]
转化体kj1172、受体对照b104各种植三次重复，相互间隔距离(1米以上)，行距60cm，株距25cm，按照夏玉米常规播种时间、播种方式和播种量进行播种。分别在玉米心叶期(小喇叭口期、玉米植株发育至展6-8叶期/8-10叶期)和吐丝期人工接虫，各接虫2次，每个处理人工接虫不少于20株。将产生在蜡纸上的玉米螟卵块依卵粒密集程度剪成每块含约30粒-40粒卵的小片。当卵发育至黑头卵阶段，在每株玉米心叶中(吐丝期接虫部位为玉米花丝丛外)接载有即将孵化黑头卵的蜡质片2块，约40-60粒卵。
[0321]
心叶期在接虫14-21天后，逐株调查玉米被害情况，记录亚洲玉米螟的食叶级别，每个处理随机选取15-20株/行。按照农业部953号公告-10.1-2007和ny/t1728.5-2006中玉米叶片受东方黏虫危害程度的分级标准评价心叶期抗虫性。结果表明，转基因玉米kj1172
的平均食叶级别为1.26，抗性类型为“高抗”；受体对照b104的平均食叶级别为7.71，抗性类型为“感”。
[0322]
吐丝期接虫后，调查雌穗被害程度及植株被害情况、蛀孔数量、蛀孔隧道长度(cm)以及存活幼虫龄期和存活数量，每个处理随机选取15-20株/行。根据这些指标评价雌穗的被害级别，按照农业部953号公告-10.1-2007和ny/t1728.5-2006规范对接虫后的结果进行调查和统计，评价抗虫性。结果表明，受体b104的雌穗全部被害，穗尖被害平均达到3-5cm，都有3-5龄期幼虫存活，而转化体kj1172雌穗和穗尖都没有被危害。转基因玉米的平均食叶级别为1.4，抗性类型为“高抗”；受体对照b104的平均食叶级别为7.57，抗性类型为“高感”，转基因玉米事件kj1172心叶期和吐丝期对玉米螟的抗性结果如表22所示，田间效果如图7和图8所示。
[0323]
表20玉米穗期受亚洲玉米螟危害程度的分级标准
[0324]
食叶级别症状描述1雌穗没受害≤2花丝被害《50％3大部份花丝被害≥50％；有幼虫存活，龄期≤2龄4穗尖被害≤1cm；有幼虫存活，龄期≤3龄5穗尖被害≤2cm；有幼虫存活，龄期≤4；隧道长度≤2cm6穗尖被害≤3cm；有幼虫存活，龄期》4；隧道长度≤4cm7穗尖被害≤4cm；隧道长度≤6cm8穗尖被害≤5cm；隧道长度≤8cm9穗尖被害》5cm；隧道长度》8cm
[0325]
表21玉米雌穗对亚洲玉米螟的抗性评价标准
[0326]
心叶期食叶级别平均标准抗性类型1.0～2.0高抗hr2.1～3.0抗r3.1～5.0中抗mr5.1～7.0感s≥7.1高感hs
[0327]
表22转化体kj1172的亚洲玉米螟抗性水平
[0328][0329][0330]
实施例6、事件的除草剂耐受性检测
[0331]
1.试验材料和方法
[0332]
(1)植物材料：转基因玉米事件kj1172和非转基因玉米受体对照b104。
[0333]
(2)除草剂：孟山都公司生产41％农达(商家推荐使用剂量：150～250ml/亩，以200ml/亩为1
×
，400ml为2
×
，以下类推)
[0334]
(3)转化体和对照各种植3个重复，相互间隔距离1米以上，行距60cm，株距25cm，按照夏玉米常规播种时间、播种方式和播种量进行播种。设置农药标签推荐剂量4倍中量及清水对照，兑水量450l/公顷，进行苗后茎叶处理，在玉米3-5叶期喷施草甘膦，使用压力恒定，可以记步记时，并带有扇形喷头的喷雾器进行除草剂或清水的茎叶喷雾，各除草剂剂量与对照的用水量一致。其他按照当地常规方法管理。
[0335]
(4)调查和记录
[0336]
分别在药后1周、2周、4周调查和记录成苗率、植株高度(选取最高的5株)、药害症状(选取药害最轻的15株)。并按照下表23和图168对药害症状进行分级统计(参考标准gb/t 19780.42)，玉米收获后，取每小区中间2行选取10穗进行室内考种，测定玉米产量相关的农艺性状。
[0337]
注：由于标准中受害级别公式计算有误，如全部植株均无任何受害症状时，药害症状分级为1级，以总植株数为100株计算，则因此，本技术在调查时将所有药害等级下降一级，由1-5级改为0-4级)
[0338]
表23药害症状分级统计标准
[0339]
药害级别症状描述0级玉米正常生长，无任何受害症状；1级玉米轻微药害，药害少于10％；2级玉米中等药害，以后能恢复，影响产量；3级玉米药害较重，难以恢复，造成减产；4级玉米药害严重，不能恢复，造成明显减产或绝产；
[0340]
2.结果与分析
[0341]
(1)成苗率
[0342]
整个试验阶段，转化体kj1172和受体对照b104在喷清水条件下的成苗率均为100％。在喷4
×
草甘膦的条件下，转基因玉米在药后1周、2周、4周调查的成苗率为100％，与清水对照没有差异；受体对照全部死亡，成苗率为0，显著低于清水对照。
[0343]
表24草甘膦处理不同时间的成苗率(％)
[0344][0345]
注：数据表示为平均数
±
标准差。
[0346]
(2)受害率
[0347]
喷施4倍草甘膦1周、2周和4周后，按照表22分别调查和记录不同处理下的药害级别，按公式计算除草剂受害率。式中：x-受害率，单位为百分率(％)；n-统计受害株数；s-级别数；t-总株数；m-最高级别。
[0348]
表25对转化体kj1172喷施4倍草甘膦后受害率
[0349][0350]
注：数据表示为平均数
±
标准差。
[0351]
如图9所示，喷施清水后，转基因玉米和非转基因玉米材料均无受害株；转化体kj1172在喷施4倍量浓度处理下，在1周、2周和4周，能够基本保持良好的生长状态，其中个别叶片失绿、畸形、株高变矮、有的植株生长减缓有中等药害症状产生，计算受害率均在22.04-33.29％之间，都属于轻微药害，4周后受害率降低，植株大部分恢复正常，还有一部分叶片稍有黄斑。非转基因玉米在喷施1倍量草甘膦处理3天后即失绿，随时间推移所有植株逐渐萎蔫、干枯、死亡，药害率为100％。

技术特征：
1.一种核酸序列，其特征在于，所述核酸序列包括如下(1)-(3)中的一项：(1)序列seq id no:1、3、5中的任一序列或其互补序列，和seq id no:2、4、6中的任一序列或其互补序；(2)序列seq id no:7或其互补序列；(3)序列seq id no:8或其互补序列。2.根据权利要求1所述的核酸序列，其特征在于，所述核酸序列来源于转基因玉米事件kj1172的植物、种子或细胞，所述事件的种子的代表性样本已以保藏编号cctcc no:p202304保藏于中国典型培养物保藏中心。3.根据权利要求1所述的核酸序列，其特征在于，所述核酸序列是诊断玉米事件kj1172存在的扩增子。4.一种检测转基因玉米事件kj1172存在用的dna引物对，其特征在于，所述引物包含第一引物和第二引物，其特征在于，所述第一引物和所述第二引物各自包含seq id no:8的部分序列或其互补序列，且当与含有玉米事件kj1172的dna一起用于扩增反应时，产生检测样品中玉米事件kj1172的扩增子；具体的，所述第一引物选自seq id no:1或其互补序列、seq id no:12；所述第二引物选自seq id no:2或其互补序列、seq id no:10；更具体的，所述第一引物选自seq id no:1或其互补序列、seq id no:12，所述第二引物选自seq id no:11；或者所述第一引物选自seq id no:2或其互补序列、seq id no:10，所述第二引物选自seq id no:9。5.一种dna探针，其特征在于，包含seq id no:8的部分序列或其互补序列，所述dna探针在严格杂交条件下与包含选自seq id no:1-8或其互补序列的核酸序列的dna分子杂交并在严格杂交条件下不与不含选自seq id no:1-8或其互补序列的核酸序列的dna分子杂交；具体的，所述dna探针选自seq id no:3或其互补序列、seq id no:4或其互补序列；更具体的，所述dna探针选自seq id no:1或其互补序列、seq id no:2或其互补序列、seq id no:5或其互补序列和seq id no:6或其互补序列的序列。6.一种标记物核酸分子，其特征在于，包含seq id no:8的部分序列或其互补序列，所述标记物核酸分子在严格杂交条件下与包含选自seq id no:1-8或其互补序列的核酸序列的dna分子杂交并在严格杂交条件下不与不含选自seq id no:1-8或其互补序列的核酸序列的dna分子杂交；具体的，所述标记物核酸分子选自seq id no:3或其互补序列、seq id no:4或其互补序列；更具体的，所述标记物核酸分子选自seq id no:1或其互补序列、seq id no:2或其互补序列、seq id no:5或其互补序列和seq id no:6或其互补序列的序列。7.一种检测样品中含有玉米事件kj1172存在的方法，其特征在于，包括：(1)待测样品与权利要求4所述的引物对、权利要求5所述的dna探针、和/或权利要求6所述的标记物核酸分子在核酸扩增反应中接触；(2)进行核酸反应；(3)检测扩增产物的存在；
所述扩增产物包括选自序列seq id no:1-8及其互补序列的核酸序列，即表示所述检测样品包含转基因玉米事件kj1172的dna存在。8.一种dna检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求4所述的dna引物对、权利要求5所述的dna探针、和/或权利要求6所述的标记物核酸分子。9.一种保护玉米植物免于昆虫侵袭的方法，其特征在于，包括在靶昆虫的膳食中提供至少一种包含转基因玉米事件kj1172的转基因玉米植物细胞；摄食所述转基因玉米植物细胞的靶昆虫被抑制进一步摄食所述玉米植物，所述靶昆虫为鳞翅目昆虫。10.一种保护玉米植物免受除草剂引起的损伤的方法，其特征在于，种植至少一种包含转基因玉米事件kj1172的转基因玉米植物，所述除草剂为草甘膦除草剂。11.一种控制玉米植物的大田中杂草的方法，其特征在于，包括将有效剂量的草甘膦除草剂施加到种植至少一种包含转基因玉米事件kj1172的转基因玉米植物的大田中。12.一种培养对昆虫有抗性、和/或对草甘膦除草剂具有耐受性的玉米植物的方法，其特征在于，包括：将转基因玉米事件kj1172作为第一亲本玉米植株与缺少昆虫抗性和/或缺少对草甘膦除草剂具有耐受性的第二亲本玉米植株有性杂交，从而产生大量子代植株；用靶昆虫侵袭所述子代植株，和/或用有效剂量的草甘膦除草剂喷洒所述玉米植株，收获与其他不具有所述转基因玉米事件kj1172的植株相比具有减弱的植物损伤的植株，所述靶昆虫为鳞翅目昆虫。13.一种产生自转基因玉米事件kj1172的加工品，其特征在于，所述加工品为玉米粉、玉米面、玉米油、玉米穗丝、玉米淀粉、玉米面筋、玉米饼、化妆品或填充剂。

技术总结
本申请公开了一种用于检测玉米事件KJDLM528T201172(商业名KJ1172)的核酸序列，其包含序列SEQ ID NO:1、3、5中的任一序列和SEQ ID NO:2、4、6中的任一序列；或者包含序列SEQ ID NO:7或8。所述核酸序列来源于包含玉米事件KJ1172的植物、种子或细胞。本发明的转基因玉米事件KJ1172能够有效抵抗鳞翅目害虫的危害，并可耐受高浓度草甘膦除草剂，在玉米种植过程可减少杀虫剂的使用，减少生产投入，且有利于控制田间杂草，提高耕作效率和产量。提高耕作效率和产量。提高耕作效率和产量。


技术研发人员：任海翠 张蕾 王长成 李莹莹 田爱菊 王金羽 杨建峰 王冬梅 祁幼林 李相敢
受保护的技术使用者：科稷达隆（北京）生物技术有限公司
技术研发日：2023.03.29
技术公布日：2023/7/12