高卢蜜环菌多态性微卫星分子标记及其引物与应用

1.本发明属于分子生物学技术领域，具体的说，涉及一种高卢蜜环菌多态性微卫星分子标记及其引物与应用。


背景技术：

2.蜜环菌是天麻栽培过程中必不可少的共生菌，直接影响天麻的产量、品质和经济效益。当前我国蜜环菌菌种市场十分混乱，存在菌株扩繁后随意冠名、市场品种混乱、市售菌种品质参差不齐等现象，天麻产区的各级职能部门对蜜环菌的品种优劣鉴定日益重视，但是天麻栽培中能使用的蜜环菌菌种鉴别特征十分有限，依据形态特征进行菌种识别极其困难。
3.高卢蜜环菌armillaria gallica，生物学种属于cbsb，是目前天麻生产中使用最广泛的共生蜜环菌物种，针对该种开发一套快速有效的分子指纹品种鉴别系统，将有助于解决市售大部分蜜环菌菌种鉴别问题。
4.ssr(simple sequence repeats)标记是近年来发展起来的一种以特异引物pcr为基础的分子标记技术，也称为微卫星dna(microsatellite dna)，是一类由几个核苷酸（一般为1~6个）为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列。研究发现，微卫星中重复单位的数目存在高度变异，这些变异表现为微卫星数目的整倍性变异或重复单位序列中的序列有可能不完全相同，因而造成多个位点的多态性，将这些变异揭示出来，就能发现不同的ssr在不同的种甚至同种不同个体间的多态性。
5.目前，ssr分子标记以其多态性高、稳定性好、共显性、易于扩增以及标记丰富且分布于全基因组等特点，被广泛应用于遗传图谱的构建、目标基因的标定、指纹图谱的绘制、品种鉴定、谱系分析、群体间遗传距离分析、进化和遗传多样性等研究中。随着测序技术的发展，基因组、转录组以及基因组重测序成本越来越低，越来越多物种完成了基因组、转录组或者群体重测序，基于参考基因组、转录组或群体重测序基因组数据进行ssr标记开发极大缩短了ssr标记的开发时间和成本，同时极大提高了ssr标记开发成功率，使得基于群体基因组数据进行ssr分子标记开发成为未来ssr分子标记开发的主流方法。
6.本发明根据软件candissr (xia et al.，2016)预测出的高卢蜜环菌多态性微卫星位点，挑选出其中60个评分较为理想的微卫星位点，并根据收集的15个蜜环菌生物学种菌株的its/tef1-a/β-tubulin/lsu/rpb1/rpb2联合矩阵采用最大似然法构建的蜜环菌属分子系统发育树（如附图2所示），挑选出来源不同的81个高卢蜜环菌样本对这些位点的多态性进行初步验证。本发明为高卢蜜环菌的品种鉴定、谱系分析、群体间遗传距离分析、进化和遗传多样性等提供分子技术的支持，同时为其他蜜环菌物种微卫星的开发提供借鉴。


技术实现要素：

7.为了克服背景技术中存在的问题，本发明提供了高卢蜜环菌多态性微卫星分子标记及其引物与应用。
8.为实现上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的：高卢蜜环菌多态性微卫星分子标记，所述的多态性微卫星分子标记为cbsb-ssr120、cbsb-ssr198、cbsb-ssr208、cbsb-ssr273、cbsb-ssr353、cbsb-ssr364、cbsb-ssr431、cbsb-ssr468、cbsb-ssr495、cbsb-ssr620、cbsb-ssr648和cbsb-ssr723，其核苷酸序列如seq id no. 1～12所示。
9.进一步的，所述的微卫星分子标记cbsb-ssr120的重复序列为at；所述的微卫星分子标记cbsb-ssr198的重复序列为caa；所述的微卫星分子标记cbsb-ssr208的重复序列为cac；所述的微卫星分子标记cbsb-ssr273的重复序列为cga；所述的微卫星分子标记cbsb-ssr353的重复序列为ctg；所述的微卫星分子标记cbsb-ssr364的重复序列为cttc；所述的微卫星分子标记cbsb-ssr431的重复序列为gag；所述的微卫星分子标记cbsb-ssr468的重复序列为gca；所述的微卫星分子标记cbsb-ssr495的重复序列为ggca；所述的微卫星分子标记cbsb-ssr620的重复序列为tca；所述的微卫星分子标记cbsb-ssr648的重复序列为tcg；所述的微卫星分子标记cbsb-ssr723的重复序列为tgg。
10.本发明还提供一种高卢蜜环菌多态性微卫星分子标记的引物， cbsb-ssr120的引物正和反向序列如seq id no.13和14所示；cbsb-ssr198的引物正和反向序列如seq id no.15和16所示；cbsb-ssr208的引物正和反向序列如seq id no.17和18所示；cbsb-ssr273的引物正和反向序列如seq id no.19和20所示；cbsb-ssr353的引物正和反向序列如seq id no.21和22所示；cbsb-ssr364的引物正和反向序列如seq id no.23和24所示；cbsb-ssr431的引物正和反向序列如seq id no.25和26所示；cbsb-ssr468的引物正和反向序列如seq id no.27和28所示；cbsb-ssr495的引物正和反向序列如seq id no.29和30所示；cbsb-ssr620的引物正和反向序列如seq id no.31和32所示；cbsb-ssr648的引物正和反向序列如seq id no.33和34所示；cbsb-ssr723的引物正和反向序列如seq id no.35和36所示。
11.进一步的，微卫星分子标记cbsb-ssr620的引物对的荧光标记为tamra，微卫星分子标记cbsb-ssr208和cbsb-ssr723的引物对的荧光标记hex，所述的微卫星分子标记cbsb-ssr120、cbsb-ssr198、cbsb-ssr364、cbsb-ssr648的引物对的荧光标记为fam，所述的微卫星分子标记cbsb-ssr173、cbsb-ssr353、cbsb-ssr431、cbsb-ssr468和cbsb-ssr495的引物对的荧光标记为rox。
12.本发明还提供高卢蜜环菌多态性微卫星分子标记在高卢蜜环菌菌种检测鉴别中的应用。
13.本发明还提供高卢蜜环菌多态性微卫星分子标记的引物在高卢蜜环菌菌种检测鉴别中的应用。
14.本发明的有益效果：本发明运用生物信息学方法检测群体高卢蜜环菌基因组中的ssr序列，选取部分ssr序列进行引物开发，运用来自全国不同科研单位、公司、野生环境、市场的高卢蜜环菌菌株进行ssr位点的筛选，最终筛选出12对多态性较高的ssr分子标记。本发明提供了一种对高卢蜜环菌不同菌株进行准确鉴定的ssr标记方法，开发出高卢蜜环菌ssr分子标记，为高卢蜜环菌的遗传图谱的构建、目标基因的标定、指纹图谱的绘制、品种鉴定、谱系分析、群体间遗传距离分析、进化和遗传多样性及品种选育等提供有力工具。
附图说明
15.图1是本发明中19个用于基因组ssr位点及引物开发的高卢蜜环菌群体样本基因组组装质量的busco评价结果图；图2是本发明中基于来源不同的15个蜜环菌生物学种菌株的its/tef1-a/β-tubulin/lsu/rpb1/rpb2联合矩阵采用最大似然法构建的蜜环菌属分子系统发育树；图3是本发明中12个ssr位点在81个高卢蜜环菌菌株中扩增出的等位基因和等位基因频率分布图；图4是本发明中基于12个ssr位点对81个高卢蜜环菌菌株构建的upgma树。
具体实施方式
16.为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面将对本发明的优选实施例进行详细的说明，以方便技术人员理解。
17.实施例一、高卢蜜环菌基因组提取及检测：总dna提取采用tsingke植物dna提取试剂盒（通用型），具体步骤如下：（1）将spin colu2置于collection tube中，加入250μl buffer bl，12000 rpm/min离心1 min活化硅胶膜；（2）取样本干燥组织（不大于20 mg），加入液氮充分研磨。研磨后置于1.5 ml离心管中，加入400μl buffer gp1，涡旋振荡1 min，65℃水浴10~30 min，期间可取出颠倒混匀以充分裂解；（3）加入150μl buffer gp2，涡旋振荡1min，冰浴5min；（4）12000rpm/min离心5min，将上清转移至新的离心管中；（5）加入上清等体积的无水乙醇，立即充分振荡混匀，液体全部转入spin colu2中，12，000rpm/min离心30s，弃废液；（6）向spin colu2中加入500μlbuffer pw（使用前已加入无水乙醇），12000 rpm/min离心30s，弃废液；（7）向spin colu2中加入500μlwash buffer（使用前已加入无水乙醇），12000 rpm/min离心30s，弃废液；（8）重复操作步骤（7）；（9）将spin colu2放回collection tube 中，12，000 rpm/min 离心2min，开盖晾干1min；
（10）取出spin colu2，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中央处加50~100 μl te buffer（65℃预热te buffer），20 ~ 25℃放置2min，12，000 rpm/min离心2min。
18.（11）用核酸浓度检测仪检测dna浓度，将浓度调节至l00ng/
µ
1，置于-20
°
c冰箱保存。
19.二、高卢蜜环菌基因组ssr位点及引物开发：先对从全国科研院所、公司、野生环境、市场收集的所有菌株进行its、tef1-α、β-tubulin、lsu、rpb1和rpb2测序，并构建its/tef1-a/β-tubulin/lsu/rpb1/rpb2多基因联合系统发育树（如附图2所示），挑选出属于高卢蜜环菌的菌株。从挑选出的高卢蜜环菌中选1个菌株(cbsb 96032)进行基于三代hifi测序技术的全基因组测序，同时挑选另外18个菌株（bj-m1、cbsb03002、cbsb19036、cbsb96003、cbsb96011、cbsb96031、hs-a9、j234、hs-a25、ld-m8、lzl-1、lzl-4、lzl-17、lzl-19、mf-m5、ss-01、wsb-m1、y3）培养后进行基于二代测序技术的全基因组重测序，以cbsb 96032为参考序列，通过candissr软件对其群体基因组中ssr位点进行检测并在其上游及下游200 bp范围内进行引物开发，引物开发条件设定为软件默认值。设计出的引物先根据缺失率进行升序排列，保留缺失率为0的引物，在根据标准差降序排列，选标准差排名前60对引物在高卢蜜环菌菌株上检测。
20.图1 为19个用于基因组ssr位点及引物开发的高卢蜜环菌群体样本基因组组装质量的busco评价结果。
21.三、ssr位点的pcr扩增：设计出的引物先根据缺失率进行升序排列，保留缺失率为0的引物，在根据标准差降序排列，选标准差排名前60对引物，对81个不同来源的高卢蜜环菌菌株进行初步筛选，检测扩增条带的有无。pcr反应体系为：100ng/
µ
1的dna模板1
ꢀµ
1，10μl 2
×ꢀ
tsingke master mix (blue)，0.15μl 10μm primer f（加接头），1.2μl 10μm primer r，1.2μl 10μm tag（荧光），1μl template（gdna），6.45μl ddh2o。pcr反应条件为：94
°
c: 5 min，(94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s) x 35 cycles，72 ℃ 8min。
22.图3是本发明中12个ssr位点在81个高卢蜜环菌菌株中扩增出的等位基因和等位基因频率分布图。
23.图4是本发明中基于12个ssr位点对81个高卢蜜环菌菌株构建的upgma树。
24.四、ssr位点的pcr产物检测：（1）将扩增好的pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳（2μl样品+6μl溴酚蓝），300v电压下12分钟，获取鉴定胶图，通过胶图确定模板浓度，加水稀释到毛细管电泳所需浓度。
25.（2）将hidi与gs500的内标按130：1混合，配成mix。
26.（3）用国产96孔反应板分装mix，每个孔中加入10μlmix。
27.（4）对应着在96孔板中加入0.5μl样品模板，离心到4000rpm即停。
28.（5）用金属浴加热器将混合板95℃加热预变性5分钟，拿出后立即放入-20℃。
29.（6）冷却后拿出，4000rpm离心，解冻、混匀。
30.（7）上3730测序仪进行毛线管电泳。
31.（8）获取下机结果并分析，筛选出多态性较好的位点。
32.五、位点分析和筛选：（1）用软件gene mapper 4.1进行数据准确位点的分析，分析数据按照引物对应关
系的核心碱基重复数（例如(ag)6）片段大小263（应加了tag的16个碱基，所以大小实际为279）来确定位点准确大小。
33.（2）根据分析出来的位点信息（峰图.pdf和数据.excel）来判断检测引物是否具有位点多态性，选取特异性高，多态性好的位点作为后续研究的重点。
34.（3）将每个个体的特异性条带以条带大小（bp）的方式统计，根据gene mapper 4.1分析的峰图，信号值在400以上，无其他杂峰干扰，并且同一个位点所跑出来的峰形都是相似的，若峰形不相似，即使峰值高于400bp并且无其他杂峰干扰也不采纳数据，以此来筛选数据是否可用。最终建立原始数据矩阵。
35.检测出ssr位点为：cbsb-ssr120、cbsb-ssr198、cbsb-ssr208、cbsb-ssr273、cbsb-ssr353、cbsb-ssr364、cbsb-ssr431、cbsb-ssr468、cbsb-ssr495、cbsb-ssr620、cbsb-ssr648和cbsb-ssr723，其核苷酸序列如seq id no. 1～12所示，所述的微卫星分子标记cbsb-ssr120的重复序列为at；所述的微卫星分子标记cbsb-ssr198的重复序列为caa；所述的微卫星分子标记cbsb-ssr208的重复序列为cac；所述的微卫星分子标记cbsb-ssr273的重复序列为cga；所述的微卫星分子标记cbsb-ssr353的重复序列为ctg；所述的微卫星分子标记cbsb-ssr364的重复序列为cttc；所述的微卫星分子标记cbsb-ssr431的重复序列为gag；所述的微卫星分子标记cbsb-ssr468的重复序列为gca；所述的微卫星分子标记cbsb-ssr495的重复序列为ggca；所述的微卫星分子标记cbsb-ssr620的重复序列为tca；所述的微卫星分子标记cbsb-ssr648的重复序列为tcg；所述的微卫星分子标记cbsb-ssr723的重复序列为tgg。
36.多态性微卫星分子标记的引物及荧光标记：cbsb-ssr120的引物正和反向序列如seq id no.13和14所示；荧光标记为fam；cbsb-ssr198的引物正和反向序列如seq id no.15和16所示；荧光标记为fam；cbsb-ssr208的引物正和反向序列如seq id no.17和18所示；荧光标记为hex；cbsb-ssr273的引物正和反向序列如seq id no.19和20所示；荧光标记为rox；cbsb-ssr353的引物正和反向序列如seq id no.21和22所示；荧光标记为rox；cbsb-ssr364的引物正和反向序列如seq id no.23和24所示；荧光标记为fam；cbsb-ssr431的引物正和反向序列如seq id no.25和26所示；荧光标记为rox；cbsb-ssr468的引物正和反向序列如seq id no.27和28所示；荧光标记为rox；cbsb-ssr495的引物正和反向序列如seq id no.29和30所示；荧光标记为rox；cbsb-ssr620的引物正和反向序列如seq id no.31和32所示；荧光标记为tamra；cbsb-ssr648的引物正和反向序列如seq id no.33和34所示；荧光标记为fam；cbsb-ssr723的引物正和反向序列如seq id no.35和36所示；荧光标记为hex。
37.六、ssr位点遗传多样性信息计算：将获得的ssr数据分别在genalex version 6.501和powermarker v3.25软件中计算ssr位点和群体的各项遗传多样性指标，结果如表1所示，12个ssr位点在81个高卢蜜环菌
样品中的观测等位基因（na）为4～10个，平均5.833个，香浓多样性指数i平均值为1.297，观测杂合度ho平均值为0.542，期望杂合度he平均值为0.455，多态性信息含量pic平均值为0.675，12个ssr位点在高卢蜜环菌样本中具有较高的多态性，能将所有81个高卢蜜环菌进行区分和归类，如附图4所示，upgma树基部和顶部的菌株主要来源于菌种市场，很多菌株聚为一个分支，表明这些菌株遗传背景是一致的，其出产源头可能相同，位于upgma树中部的菌株则主要来自野生环境，分别形成不同的分支相互区别开来。综上，本发明开发的12个ssr位点既能将遗传背景不一致的菌株进行区分，同时能准确鉴定菌种市场中遗传背景一致的菌株。本发明的微卫星分子标记引物可用于高卢蜜环菌的遗传图谱的构建、目标基因的标定、指纹图谱的绘制、品种鉴定、谱系分析、群体间遗传距离分析、进化和遗传多样性及品种选育等。
[0038] 表1 12个微卫星位点的遗传多样性信息locusnaihohepiccbsb-ssr12041.1410.4070.6680.597cbsb-ssr19850.9690.5190.5360.471cbsb-ssr20871.1580.8020.6260.562cbsb-ssr27361.5080.7280.7630.722cbsb-ssr353101.6900.8640.7910.758cbsb-ssr36461.3010.7040.6770.619cbsb-ssr43141.2250.3700.6730.616cbsb-ssr46851.2920.3330.6570.617cbsb-ssr49571.4820.4070.7060.668cbsb-ssr62041.3360.5190.7250.675cbsb-ssr64850.9040.1140.5130.438cbsb-ssr72371.5560.7410.7680.729mean5.8331.2970.5420.6750.623最后说明的是，以上优选实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

技术特征：
1.高卢蜜环菌多态性微卫星分子标记，其特征在于：所述的微卫星分子标记为cbsb-ssr120、cbsb-ssr198、cbsb-ssr208、cbsb-ssr273、cbsb-ssr353、cbsb-ssr364、cbsb-ssr431、cbsb-ssr468、cbsb-ssr495、cbsb-ssr620、cbsb-ssr648和cbsb-ssr723，其核苷酸序列如seq id no. 1～12所示。2.根据权利要求1所述的高卢蜜环菌多态性微卫星分子标记，其特征在于：所述的微卫星分子标记cbsb-ssr120的重复序列为at；所述的微卫星分子标记cbsb-ssr198的重复序列为caa；所述的微卫星分子标记cbsb-ssr208的重复序列为cac；所述的微卫星分子标记cbsb-ssr273的重复序列为cga；所述的微卫星分子标记cbsb-ssr353的重复序列为ctg；所述的微卫星分子标记cbsb-ssr364的重复序列为cttc；所述的微卫星分子标记cbsb-ssr431的重复序列为gag；所述的微卫星分子标记cbsb-ssr468的重复序列为gca；所述的微卫星分子标记cbsb-ssr495的重复序列为ggca；所述的微卫星分子标记cbsb-ssr620的重复序列为tca；所述的微卫星分子标记cbsb-ssr648的重复序列为tcg；所述的微卫星分子标记cbsb-ssr723的重复序列为tgg。3.根据权利要求1或2任一项所述的高卢蜜环菌多态性微卫星分子标记的引物，其特征在于：cbsb-ssr120的引物正和反向序列如seq id no.13和14所示；cbsb-ssr198的引物正和反向序列如seq id no.15和16所示；cbsb-ssr208的引物正和反向序列如seq id no.17和18所示；cbsb-ssr273的引物正和反向序列如seq id no.19和20所示；cbsb-ssr353的引物正和反向序列如seq id no.21和22所示；cbsb-ssr364的引物正和反向序列如seq id no.23和24所示；cbsb-ssr431的引物正和反向序列如seq id no.25和26所示；cbsb-ssr468的引物正和反向序列如seq id no.27和28所示；cbsb-ssr459的引物正和反向序列如seq id no.29和30所示；cbsb-ssr620的引物正和反向序列如seq id no.31和32所示；cbsb-ssr648的引物正和反向序列如seq id no.33和34所示；cbsb-ssr723的引物正和反向序列如seq id no.35和36所示。4.根据权利要求3所述的高卢蜜环菌多态性微卫星分子标记的引物，其特征在于：微卫星分子标记cbsb-ssr620的引物对的荧光标记为tamra，微卫星分子标记cbsb-ssr208和cbsb-ssr723的引物对的荧光标记hex，所述的微卫星分子标记cbsb-ssr120、cbsb-ssr198、cbsb-ssr364、cbsb-ssr648的引物对的荧光标记为fam，所述的微卫星分子标记cbsb-ssr173、cbsb-ssr353、cbsb-ssr431、cbsb-ssr468和cbsb-ssr495的引物对的荧光标记为rox。5.根据权利要求1或2任一项所述的高卢蜜环菌多态性微卫星分子标记在高卢蜜环菌菌种检测鉴别中的应用。6.根据权利要求3所述的高卢蜜环菌多态性微卫星分子标记的引物在高卢蜜环菌菌种
检测鉴别中的应用。

技术总结
本发明涉及一种高卢蜜环菌多态性微卫星分子标记及其引物与应用，属于分子技术领域，本发明公开了高卢蜜环菌多态性微卫星分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～12所示，本发明还公开了高卢蜜环菌多态性微卫星分子标记的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.13～36所示。本发明的微卫星分子标记引物可用于高卢蜜环菌的遗传图谱的构建、目标基因的标定、指纹图谱的绘制、品种鉴定、谱系分析、群体间遗传距离分析、进化和遗传多样性及品种选育等。进化和遗传多样性及品种选育等。进化和遗传多样性及品种选育等。


技术研发人员：刘建伟 于富强 杨祝良 田孟华 徐鑫
受保护的技术使用者：中国科学院昆明植物研究所
技术研发日：2023.03.24
技术公布日：2023/7/17