一种全发酵法高产L-甲硫氨酸的方法

一种全发酵法高产l-甲硫氨酸的方法
(一)技术领域
1.本发明涉及一种提高l-甲硫氨酸产量的全发酵方法。
(二)

背景技术：

2.l-甲硫氨酸(l-methionine，l-met)的分子式为c5h
11
no2s，又名l-蛋氨酸，全称为2-氨基-4-甲巯基丁酸，是一种含硫的非极性α-氨基酸，与赖氨酸、苏氨酸、异亮氨酸等同属于天冬氨酸家族氨基酸，其化学索引号(cas)为63-68-3。根据甲硫氨酸的不同构型，可以分为d型和l型，其中仅有l型具有生物学活性。l-甲硫氨酸是生物体中唯一含有硫元素的必需氨基酸，在生物体中发挥重要的作用。l-甲硫氨酸最早于1922年由mueller从酪蛋白中分离出来，随后，barger和coyne确定了其结构式并正式命名为l-甲硫氨酸。之后人们开始对l-甲硫氨酸进行了大量的探索研究。现已知晓l-甲硫氨酸作为s-腺苷蛋氨酸(sam)的前体，充当甲基供体，参与一些重要代谢中间物合成，如硫辛酸、聚胺等。l-甲硫氨酸浓度的波动会改变sam的浓度，sam对于dna、rna等生物大分子的合成有着非常关键的作用。l-甲硫氨酸在细胞活动中也起着不可或缺的作用，包括调节许多蛋白质翻译后的修饰。因此，l-甲硫氨酸被广泛运用于饲料、食品、医药等行业。
3.目前，甲硫氨酸的生产方法主要是化学合成法，l-甲硫氨酸的化学合成方法有多种，按原料路线分主要有丙烯醛法、氨基内酯法、丙二酸酯法、酪朊水解法等。其中丙烯醛法，是最早但也是目前世界上l-甲硫氨酸生产公司最主要的生产工艺。该方法是由德国公司degussa ag在60年代早期发明，主要原理是以丙烯醛和甲硫醇为原料生成甲硫基丙醛，甲硫基丙醛再进行缩合水解生产l-甲硫氨酸。目前，罗纳-普朗克、迪高沙、孟山都等公司都有其特殊水解和酸化方法，由此在丙烯醛法的基础上，出现多种不同的技术专利，造就了l-甲硫氨酸生产工艺随着技术的发展不断进步。化学合成法反应步骤减少、生产成本降低、产物得率提高，但是在合成过程中仍不可避免的使用氢氰酸和甲硫醇等高挥发有毒底物，且存在反应条件苛刻、三废排放量大不易处理等问题，给环境造成了较为严重的污染。另外，酶法也是生产甲硫氨酸的一种重要方法，l-甲硫氨酸的酶解法主要为两种思路，一是消除外消旋混合物中的d-甲硫氨酸，二是将d-甲硫氨酸转化为l-甲硫氨酸，酶解法主要利用酶在体外反应来生产l-甲硫氨酸，但其原料价格普遍较高，生产过程控制繁琐，难适用于大规模的生产发酵。相比较这两种方法，微生物发酵法具有相对绿色的工艺模式和低廉的成本而被逐渐关注。但发酵法生产l-甲硫氨酸产量较低，仍是制约其工业化生产的最大障碍。
4.微生物发酵法相比于化学法和酶法，其反应条件温和，对环境影响较小，因此利用微生物发酵合成目标产物是一种较优的方法。自20世纪起不断有学者在探索利用生物法来生产l-甲硫氨酸，但由于l-甲硫氨酸的合成途径复杂，调控节点多，以及l-甲硫氨酸的生产会对菌体本身产生毒副作用等因素，目前还没有一株适合于大规模生产的l-甲硫氨酸高产菌株。现已公开的l-甲硫氨酸生产菌株主要有大肠杆菌(escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)和百合棒杆菌(corynebacterium lilium)等。现有的对微生物发酵法的研究主要集中于菌种构建以及代
谢研究，但大肠杆菌生产l-甲硫氨酸仍然存在重大障碍。例如，虽然已经提出了许多可行的工程细菌构建方案，但是葡萄糖生产l-甲硫氨酸的转化率仍然较低。
5.微生物在生长的不同阶段、生产目的代谢产物的不同时期，对环境条件可能会有不同的需求。而如何提高葡萄糖生产l-甲硫氨酸的转化率成为亟待解决的问题，为此，考察甲硫氨酸生产菌株针对不同发酵调控过程中代谢通量的变化可以进一步了解其合成生物过程，为提高其发酵产量及糖酸转化率奠定基础。
(三)

技术实现要素：

6.本发明目的是提供一种全发酵法高产l-甲硫氨酸的方法，该方法通过合理改变发酵培养基成分，运用不同发酵工艺及补料策略来提高l-甲硫氨酸产量、糖酸转化率并缩短发酵周期，解决了现有工艺存在的l-甲硫氨酸产量低，糖酸转化率低，发酵周期长等问题。
7.本发明采用的技术方案是：
8.本发明提供一种全发酵法高产l-甲硫氨酸产量的方法，所述方法包括以下步骤：以产l-甲硫氨酸重组大肠杆菌为生产菌株，接种至含50mg/l卡那霉素抗性的发酵培养基中，培养温度为37℃，发酵时搅拌转速300-1000r/min；通过搅拌和通风控制溶氧值在20-30％，通过流加氨水控制ph在6.75-6.85；发酵至od
600
达到0.6-0.8时加入终浓度24mg/l的iptg，在30℃、300-1000r/min条件下进行诱导培养；发酵过程中，每4h取样检测od
600
、残糖含量和l-甲硫氨酸含量；在发酵至发酵液初始葡萄糖浓度低于2g/l后，采用溶氧反馈方式流加(优选当溶氧值高于30％时以40ml/h的流速流加)补料培养基维持溶氧值(do值)在20-30％；当od
600
达到10时以10-20ml/h的恒定流速流加补料培养基维持溶氧值在20-30％；当od
600
达到30时以20-30ml/h的恒定流速流加补料培养基维持溶氧值在20-30％；当od
600
达到45时以25-40ml/h的恒定流速流加补料培养基维持溶氧值在20-30％；发酵后期，菌体逐渐死亡，溶氧值上升，当溶氧值上升至50％及以上停止流加；当溶氧值达到100％时发酵结束；
9.所述发酵培养基：葡萄糖10g/l、cacl2·
2h2o 0.08g/l、mgso4·
7h2o 5g/l、柠檬酸2.5g/l、kh2po
4 2.5g/l、k2hpo4·
3h2o 1.38g/l、fecl3·
6h2o 0.12g/l、(nh4)2so43.3g/l、na2s2o
3 3.95g/l、0.01g/l的vb
12
、0.01g/l的vb1、0.05g/l的l-赖氨酸、ssa 2ml/l、ssb 1ml/l；
10.补料培养基：葡萄糖500g/l、mgso4·
7h2o 5g/l、fecl3·
6h2o 0.06g/l、(nh4)2so433g/l、na2s2o
3 39.5g/l、甜菜碱0.5g/l、ssa 1.6ml/l、ssb 0.8ml/l、0.01g/l的vb
12
、0.01g/l的vb1、0.05g/l的l-赖氨酸，溶剂为水；
11.所述ssa组成为：znso4·
7h2o 8.5g/l、mncl2·
2h2o 7.5g/l、cucl2·
2h2o 0.75g/l、cocl2·
6h2o 1.25g/l、edta 4g/l，溶剂为水。
12.所述ssb组成为：h3bo
3 3g/l、na2moo4·
2h2o 2.5g/l，溶剂为水。
13.优选的，所述生产菌株为大肠杆菌zjbssc362(escherichia coli zjbssc362)，保存于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏日期：2020年12月4日，保藏编号：cctcc no：m 2020846，地址：中国武汉大学，邮编：430072，已在专利申请cn 112779200a中公开。
14.优选的，当od
600
达到10时以15ml/h的恒定流速流加补料培养基维持溶氧值在20-30％；当od
600
达到30时以20ml/h的恒定流速流加补料培养基维持溶氧值在20-30％；当od
600
达到45时以25ml/h的恒定流速流加补料培养基维持溶氧值在20-30％；发酵后期，菌体逐渐
死亡，溶氧值上升，当do值上升至50％及以上停止流加；当溶氧值达到100％时发酵结束。
15.优选的，所述生产菌株在接种前先进行斜面活化和种子扩大培养基，将种子液以体积浓度10-15％的接种量接种至发酵培养基；所述种子液按如下步骤制备：
16.(1)活化培养：将生产菌株接种到lb平板培养基上，37℃培养过夜，得到活化菌；所述lb平板培养基组成：蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、nacl 5g/l，琼脂粉20g/l，溶剂为水，ph＝6.8-7.0；
17.(2)一级种子培养：将步骤(1)得到的活化菌接种于lb液体培养基中，37℃、200rpm培养12h，得到一级种子液；lb液体培养基组成：蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、nacl 5g/l，溶剂为水，ph＝6.8-7.0；
18.(3)二级种子培养：将步骤(2)得到的一级种子液按体积浓度1-3％的接种量接种于lb液体培养基中，37℃、200rpm培养12-16h，得到二级种子液；所述lb液体培养基组成同步骤(2)。
19.与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：
20.l-甲硫氨酸合成途径复杂，受较多因素的影响，通过代谢工程手段改造大肠杆菌积累往往会出现生长问题，本发明通过优化发酵培养基的初始糖浓度使菌体在前期能够尽快生长且不受到抑制，l-甲硫氨酸的积累得到提升；实验菌株为赖氨酸营养缺陷型菌株，需要在发酵液中添加赖氨酸，保证发酵过程中不会由于缺乏赖氨酸而对菌株发酵有负面影响。但同时基于前期对于l-甲硫氨酸发酵的研究，在l-甲硫氨酸发酵过程适当的“赖氨酸饥饿”会将代谢流流向l-甲硫氨酸的合成，因此需要一个合适的补料方法来控制发酵过程中赖氨酸的浓度。同时为解决菌体早衰和产酸效率低，提高中后期菌体活力，基于发酵的不同阶段菌体生长和产物合成对环境的不同要求，对各种葡萄糖流加策略进行了摸索，提高后期细胞产酸能力，进一步提高l-甲硫氨酸产量。最终得到的先采用溶氧反馈流加补料培养基使菌体生长到一定的密度，再采用分阶段变速补料的策略成功解决了发酵过程底物抑制、产物反馈抑制、代谢工程菌发酵过程中乙酸浓度过高等问题，l-甲硫氨酸产量从18.2g/l提升至31.71g/l，最高糖酸转化率提高至12.2％，同时发酵时间缩短至68h，因此，具有重要的工业应用价值，同时对其它氨基酸及其相关化合物的发酵生产具有一定的指导意义。
(四)附图说明
21.图1、实施例1初始发酵进程图。
22.图2、实施例2不同初糖浓度的发酵进程图。
23.图3、实施例3溶氧反馈补料的发酵进程图。
24.图4、实施例4ph反馈补料的发酵进程图。
25.图5、实施例5恒定残糖浓度为1-5g/l补料的发酵进程图。
26.图6、实施例6恒定残糖浓度为5-10g/l补料的发酵进程图。
27.图7、实施例7以10ml/h恒速补料的发酵进程图。
28.图8、实施例8以20ml/h恒速补料的发酵进程图。
29.图9、实施例9新型补料方式(1)的发酵进程图。
30.图10、实施例10新型补料方式(2)的发酵进程图。
31.图11、实施例11新型补料方式(3)的发酵进程图。
(五)具体实施方式
32.下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
33.除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。
34.实验菌株为大肠杆菌zjbssc362(escherichia coli zjbssc362)，保存于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏日期：2020年12月4日，保藏编号：cctcc no：m 2020846，地址：中国武汉大学，邮编：430072，已在专利申请cn 112779200 a中公开。
35.lb平板培养基组成：蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、nacl 5g/l，琼脂粉20g/l，溶剂为水，ph＝6.8-7.0。
36.lb液体培养基组成：蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、nacl 5g/l，溶剂为水，ph＝6.8-7.0。
37.发酵培养基：葡萄糖10g/l、cacl2·
2h2o 0.08g/l、mgso4·
7h2o 5g/l、柠檬酸2.5g/l、kh2po
4 2.5g/l、k2hpo4·
3h2o 1.38g/l、fecl3·
6h2o 0.12g/l、(nh4)2so
4 3.3g/l、na2s2o
3 3.95g/l、0.01g/l的vb
12
、0.01g/l的vb1、0.05g/l的l-赖氨酸、ssa 2ml/l、ssb 1ml/l，溶剂为水；
38.补料培养基：葡萄糖500g/l、mgso4·
7h2o 5g/l、fecl3·
6h2o 0.06g/l、(nh4)2so433g/l、na2s2o
3 39.5g/l、甜菜碱0.5g/l、ssa 1.6ml/l、ssb 0.8ml/l、0.01g/l的vb
12
、0.01g/l的vb1、0.05g/l的l-赖氨酸，溶剂为水；
39.所述ssa组成为：znso4·
7h2o 8.5g/l、mncl2·
2h2o 7.5g/l、cucl2·
2h2o 0.75g/l、cocl2·
6h2o 1.25g/l、edta 4g/l，溶剂为水。
40.所述ssb组成为：h3bo
3 3g/l、na2moo4·
2h2o 2.5g/l，溶剂为水。
41.其中，vb
12
以10g/l的vb
12
水溶液的形式加入，用量1ml/l；vb1以5g/l的vb1水溶液的形式加入，用量2ml/l；l-赖氨酸以200g/l的l-赖氨酸水溶液的形式加入，用量0.25ml/l；iptg以120g/l的iptg水溶液的形式加入，用量0.2ml/l。
42.实施例1：发酵生产l-甲硫氨酸的方法
43.(1)活化培养：将大肠杆菌zjbssc362划线到含有50mg/l的kan抗性的lb平板培养基，37℃培养过夜，得到活化菌；
44.(2)一级种子培养：挑取步骤(1)单菌落接种于10ml含有50mg/l的kan抗性的lb液体培养基的试管中，37℃、200rpm培养12h，获得一级种子液；
45.(3)二级种子培养：取1ml步骤(2)培养的一级种子液分别接种于3瓶装有100ml含有50mg/l kan抗性的lb液体培养基的500ml摇瓶中，37℃、200rpm培养12-16h，获得二级种子液；
46.(4)发酵培养：按照体积浓度10％的接种量，取步骤(3)得到的二级种子液接种至含有50mg/l kan抗性的发酵培养基的5l发酵罐中，装液量为2l/5l，培养温度为37℃，初始搅拌转速300rpm，通过搅拌和通风控制溶氧值在20-30％，通过流加氨水控制ph在6.75-6.85，发酵至od
600
达到0.6-0.8时加入终浓度24mg/l的iptg，在30℃、300rpm条件下进行诱导培养；发酵过程中，每4h取样检测od
600
、残糖含量和l-甲硫氨酸含量；16h后发酵至初糖基本消耗完，初始葡萄糖浓度低于2g/l时，开始流加补料培养基；即从16h开始以30ml/h的恒
定流速流加补料培养基维持do值(溶氧值)为30％；当od
600
达到30时以40ml/h的恒定流速流加补料培养基维持do值为30％；当od
600
达到50时以50ml/h的恒定流速流加补料培养基维持do值为30％；发酵后期，菌体逐渐死亡，do上升，当do值上升至50％及以上停止流加；当do值达到100％时发酵结束。发酵过程中od
600
、残糖含量和l-甲硫氨酸含量的变化曲线见图1所示，从图1可以看出发酵结束l-甲硫氨酸在72h的产量最高，为18.20g/l，最高糖酸转化率为7.0％。
47.糖酸转化率＝(产生的l-甲硫氨酸总质量
÷
消耗的葡萄糖总质量)
×
100％。
48.紫外分光光度计测定生物量od
600
：通过取样口取得发酵液样品后，适当稀释后取2ml于比色管中，用紫外分光光度计在600nm处测定吸光值(od
600
)。
49.利用dns法检测残糖(即葡萄糖)含量：dns试剂：用400ml蒸馏水溶解6.3g的3,5-二硝基水杨酸，逐步加入21g氢氧化钠，再加入182g四水合酒石酸钾钠、5.0g苯酚、5.0g无水亚硫酸钠，温水浴，不断搅拌，直至溶液清澈透明，用蒸馏水定容至1000ml，保存在棕色瓶子里；与二氧化碳隔绝，静置5-7天后使用。取五支1.5ml离心管，各离心管中依次加入1g/l葡萄糖水溶液0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1ml，各加水补至1.0ml，震荡混匀后即为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0g/l的葡萄糖水溶液。另取五支1.5ml离心管各吸取500μl不同浓度的葡萄糖水溶液，再加入500μl的dns试剂。水浴加热5min，然后取600μl反应液，加入2.4ml的蒸馏水。在分光光度计540nm处检测。以540nm处测得数值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线，标准曲线方程为：y＝0.1133x+0.0004(r2＝0.9954)。相同条件下检测待测样品的吸光值，根据标准曲线获得待测样品中葡萄糖含量。
50.高效液相色谱检测l-甲硫氨酸含量：取1ml发酵液室温条件下12000rpm离心1min，上清稀释适宜倍数(发酵24h之前的发酵液不稀释；24-48h的发酵液稀释5倍；48h之后的发酵液稀释10倍)，使其l-甲硫氨酸浓度在标准曲线的0.5-3g/l范围内；然后用赛默飞uplc超高压液相色谱仪检测l-甲硫氨酸产量。流动相a：纯乙腈经0.22μm滤膜抽滤，超声脱气，现用现配。流动相b：纯水：乙腈：三乙胺＝84.8：15：0.2(体积比)，乙酸调节ph至4.9；经0.22μm滤膜抽滤，超声脱气，现用现配。样品衍生化方法：100μl样品加入300μl衍生化试剂i，500μl缓冲液ii。置于混匀仪中，60℃，400rpm避光反应1h。反应结束后经0.22μm 针筒式有机滤膜过滤，留待检测。其中衍生化试剂i：0.2700g cnbf(3,5-二硝基-4-氯-三氟甲基苯)/10ml乙腈；缓冲液ii：ph 9.0h3bo
3-na2b4o7缓冲液(0.2mol/l硼酸(h3bo3)与0.05mol/l硼砂(na2b4o7)的溶液)。配好后需要避光保存。检测条件：色谱柱：j&k c18-h column(4.6
×
250mm,5μm)；流动相采用表1中的比例进行梯度洗脱，流速：0.80ml/min；柱温：30℃；进样量：10μl；检测波长：260nm。
51.表1梯度洗脱设置
[0052][0053]
实施例2：不同初糖浓度对发酵生产l-甲硫氨酸的影响
[0054]
(1)活化培养：将大肠杆菌zjbssc362划线到含有50mg/l kan抗性的lb平板，37℃培养过夜，得到活化菌；
[0055]
(2)一级种子培养：挑取步骤(1)单菌落接种于10ml含有50mg/l kan抗性的lb液体培养基的试管中，37℃、200rpm培养12h，获得一级种子液；
[0056]
(3)二级种子培养：取1ml步骤(2)培养的一级种子液分别接种于3瓶装有100ml含有50mg/l kan抗性的lb液体培养基的500ml摇瓶中，37℃、200rpm培养12-16h，获得二级种子液；
[0057]
(4)发酵培养：按照体积浓度15％的接种量，取步骤(3)得到的二级种子液，接种至装有2l含50mg/l kan抗性的发酵培养基的5l发酵罐中，装液量为2l/5l，培养温度为37℃，初始搅拌转速300rpm，通过搅拌和通风控制溶氧值在20-30％，通过流加氨水控制ph在6.75-6.85。发酵至od
600
达到0.6-0.8时加入终浓度24mg/l的iptg，在30℃、300rpm条件下进行诱导培养；发酵过程中，每4h取样，采用实施例1方法检测od
600
、残糖含量和l-甲硫氨酸含量；发酵前期使菌体在自然do条件下生长，发酵体系do值会不断下降，直至10％以下，此时初糖基本消耗完，do会迅速飙升，当升至30％时开始使用溶氧反馈方式以40ml/h的速度流加补料培养基，使do值稳定在30％；发酵后期，菌体逐渐死亡，do值上升，当do值上升至50％及以上停止流加，当do值达到100％时发酵结束。
[0058]
同样条件下，将发酵培养基中葡萄糖浓度分别改为5g/l，15g/l，20g/l，l-甲硫氨酸的产量见图2所示。
[0059]
当培养体系中的营养成分浓度如碳源超过某一临界值时，微生物为了抵抗高渗透压，维持胞内环境会形成离子梯度，这一过程是需要耗能的，其结果会明显的抑制菌体生长，而如果初始葡萄糖浓度过低，可能会导致菌体在未达到最佳状态时就因碳源耗尽而被迫停止生长，因此选择适当浓度的初始碳源是有必要的，针对初始糖设置了四个梯度：5g/l，10g/l，15g/l，20g/l。结果图2所示，四种初糖浓度下发酵84h的l-甲硫氨酸产量分别为23.71g/l，24.26g/l，21.12g/l，20.72g/l，最优的初糖浓度为10g/l时发酵产量获得最高值，但此时发酵周期为84h，相比优化前延长了12h，且糖酸转化率仅为9.33％。
[0060]
实施例3：优化初糖浓度下溶氧反馈补料发酵生产l-甲硫氨酸
[0061]
(1)活化培养：将大肠杆菌zjbssc362划线到含有50mg/l kan抗性的lb平板，37℃培养过夜，得到活化菌；
[0062]
(2)一级种子培养：挑取单菌落接种于10ml含有50mg/l kan抗性的lb液体培养基的试管中，37℃、200rpm培养12h，获得一级种子液；
[0063]
(3)二级种子培养：取1ml步骤(2)培养的一级种子液分别接种于3瓶装有100ml含有50mg/l kan抗性的lb液体培养基的500ml摇瓶中，37℃、200rpm培养12-16h，获得二级种子液；
[0064]
(4)发酵培养：按照体积浓度15％的接种量，取步骤(3)得到的二级种子液，接种至含50mg/l kan抗性的发酵培养基的5l发酵罐中，装液量为2l/5l，培养温度为37℃，初始搅拌转速300rpm，通过搅拌和通风控制溶氧值在20-30％，通过流加氨水控制ph在6.75-6.85。发酵至od
600
达到0.6-0.8时加入终浓度24mg/l的iptg，在30℃、300rpm条件下进行诱导培养；发酵过程中，每4h取样，采用实施例1方法检测od
600
、残糖含量和l-甲硫氨酸含量；发酵前期使菌体在自然do值条件下生长，发酵体系do值会不断下降至10％以下，此时初糖基本消耗完，do值会迅速飙升，当升至30％时开始使用溶氧反馈方式以40ml/h流加补料培养基，使do值稳定在30％；发酵后期，菌体逐渐死亡，do值上升，当do值上升至50％及以上停止流加，当do值达到100％时发酵结束。
[0065]
结果见图3所示，采用溶氧反馈补料发酵，发酵84h结束后，l-甲硫氨酸产量最高为24.26g/l，最高糖酸转化率为9.33％，但发酵时间延长至84h，这对氨基酸发酵成本极为不利。
[0066]
实施例4：优化初糖浓度下ph反馈补料发酵生产l-甲硫氨酸
[0067]
(1)活化培养：将大肠杆菌zjbssc362划线到含有50mg/l kan抗性的lb平板，37℃培养过夜，得到活化菌；
[0068]
(2)一级种子培养：挑取单菌落接种于10ml含有50mg/l kan抗性的lb液体培养基的试管中，37℃、200rpm培养12h，获得一级种子液；
[0069]
(3)二级种子培养：取1ml步骤(2)培养的一级种子液分别接种于3瓶装有100ml含有50mg/l kan抗性的lb液体培养基的500ml摇瓶中，37℃、200rpm培养12-16h，获得二级种子液；
[0070]
(4)发酵培养：按照体积浓度15％的接种量，取步骤(3)得到的二级种子液，接种至含有50mg/l kan抗性发酵培养基的5l发酵罐中，装液量为2l/5l，培养温度为37℃，初始搅拌转速300rpm，通过搅拌和通风控制溶氧值在20-30％，通过流加氨水控制ph在6.75-6.85。发酵培养至od
600
达到0.6-0.8时加入终浓度24mg/l的iptg，在30℃、300rpm条件下进行诱导培养；发酵过程中，每4h取样，采用实施例1方法检测od
600
、残糖含量和l-甲硫氨酸含量；在发酵至初始葡萄糖消耗完后，ph会飙升，当ph升至6.82以上时开始使用ph反馈方式以40ml/h流加补料培养基，使ph稳定在6.8。发酵后期，菌体逐渐死亡，do值上升，当do值上升至50％及以上停止流加，当do值达到100％时发酵结束。
[0071]
结果见图4所示。采用ph反馈进行补料发酵，发酵结束l-甲硫氨酸在84h的产量最高，产量仅为20.19g/l，最高糖酸转化率为7.77％。
[0072]
实施例5：低浓度残糖控制对发酵生产l-甲硫氨酸的影响
[0073]
(1)活化培养：将大肠杆菌zjbssc362划线到含有50mg/l kan抗性的lb平板，37℃培养过夜，得到活化菌；
[0074]
(2)一级种子培养：挑取单菌落接种于10ml含有50mg/l kan抗性的lb液体培养基的试管中37℃、200rpm培养12h，获得一级种子液；
[0075]
(3)二级种子培养：取1ml步骤(2)培养的一级种子液分别接种于3瓶装有100ml含有50mg/l kan抗性的lb液体培养基的500ml摇瓶中，37℃、200rpm培养12-16h，获得二级种子液；
[0076]
(4)发酵培养：按照体积浓度15％的接种量，取步骤(3)得到的二级种子液，接种至含有50mg/l kan抗性发酵培养基的5l发酵罐中，装液量为2l/5l，培养温度为37℃，初始搅拌转速300rpm，通过搅拌和通风控制溶氧值在20-30％，通过流加氨水控制ph在6.75-6.85。发酵至od
600
达到0.6-0.8时加入终浓度24mg/l的iptg，在30℃、300rpm条件下进行诱导培养；发酵过程中，每4h取样采用实施例1方法检测od
600
、残糖含量和l-甲硫氨酸含量；在发酵至发酵液初始葡萄糖浓度低于2g/l后，开始以10ml/h的流速流加补料培养基，随后根据取样测定的残糖浓度来改变补料培养基流加速度(当残糖浓度低于1g/l时，提升补料速度；当残糖浓度高于5g/l时，降低补料速度)，使残糖浓度维持在1-5g/l。发酵后期，菌体逐渐死亡，do上升，当do值上升至50％及以上停止流加，当do达到100％时发酵结束。
[0077]
结果见图5所示。发酵结束，l-甲硫氨酸产量最高为22.26g/l，最高糖酸转化率为8.56％。但发酵过程延长至92h。
[0078]
实施例6：高浓度残糖控制对发酵生产l-甲硫氨酸的影响
[0079]
(1)活化培养：将大肠杆菌zjbssc362划线到含有50mg/l kan抗性的lb平板37℃培养过夜，得到活化菌；
[0080]
(2)一级种子培养：挑取单菌落接种于10ml含有50mg/l kan抗性的lb液体培养基的试管中37℃、200rpm培养12h，获得一级种子液；
[0081]
(3)二级种子培养：取1ml步骤(2)培养的一级种子液分别接种于3瓶装有100ml含有50mg/l kan抗性的lb液体培养基的500ml摇瓶中，37℃、200rpm培养12-16h，获得二级种子液；
[0082]
(4)发酵培养：按照体积浓度15％的接种量，取步骤(3)得到的二级种子液，接种至含有发酵培养基的5l发酵罐中，装液量为2l/5l，培养温度为37℃，初始搅拌转速300rpm，通过搅拌和通风控制溶氧值在20-30％，通过流加氨水控制ph在6.75-6.85。发酵至od
600
达到0.6-0.8时加入终浓度24mg/l的iptg，在30℃、300rpm条件下进行诱导培养；发酵过程中，每4h取样，采用实施例1方法检测od
600
、残糖含量和l-甲硫氨酸含量；在发酵至发酵液初始葡萄糖浓度低于2g/l后，开始以15ml/h的流速流加补料培养基，随后根据取样测定的残糖浓度来改变补料培养基流加速度(当残糖浓度低于5g/l时，提升补料速度；当残糖浓度高于10g/l时，降低补料速度)，使残糖浓度维持在5-10g/l。发酵后期，菌体逐渐死亡，do值上升，当do值上升至50％及以上停止流加，当do值达到100％时发酵结束。
[0083]
结果见图6所示。发酵结束l-甲硫氨酸仍然在92h的产量最高，为21.32g/l，最高糖酸转化率为8.2％。
[0084]
实施例7：恒低速流加对发酵生产l-甲硫氨酸的影响
[0085]
(1)活化培养：将大肠杆菌zjbssc362划线到含有50mg/l kan抗性的lb平板37℃培
养过夜，得到活化菌；
[0086]
(2)一级种子培养：挑取单菌落接种于10ml含有50mg/l kan抗性的lb液体培养基的试管中37℃、200rpm培养12h，获得一级种子液；
[0087]
(3)二级种子培养：取1ml步骤(2)培养的一级种子液分别接种于3瓶装有100ml含有50mg/l kan抗性的lb液体培养基的500ml摇瓶中，37℃、200rpm培养12-16h，获得二级种子液；
[0088]
(4)发酵培养：按照体积浓度15％的接种量，取步骤(3)得到的二级种子液，接种至含有50mg/l kan抗性发酵培养基的5l发酵罐中，装液量为2l/5l，培养温度为37℃，初始搅拌转速300rpm，通过搅拌和通风控制溶氧值在20-30％，通过流加氨水控制ph在6.75-6.85。发酵至od
600
达到0.6-0.8时加入终浓度24mg/l的iptg，在30℃、300rpm条件下进行诱导培养；发酵过程中，每4h取样，采用实施例1方法检测od
600
、残糖含量和l-甲硫氨酸含量；发酵至12h初糖基本消耗完，发酵液初始葡萄糖浓度低于2g/l后开始以10ml/h流加补料培养基直至结束。发酵后期，菌体逐渐死亡，do值上升，当do值上升至50％及以上停止流加，当do值达到100％时发酵结束。
[0089]
结果见图7所示。发酵结束l-甲硫氨酸在76h的产量最高，仅为15.94g/l，最高糖酸转化率为7.97％。
[0090]
实施例8：恒高速流加对发酵生产l-甲硫氨酸的影响
[0091]
(1)活化培养：将大肠杆菌zjbssc362划线到含有50mg/l kan抗性的lb平板37℃培养过夜，得到活化菌；
[0092]
(2)一级种子培养：挑取单菌落接种于10ml含有50mg/l kan抗性的lb液体培养基的试管中37℃、200rpm培养12h，获得一级种子液；
[0093]
(3)二级种子培养：取1ml步骤(2)培养的一级种子液分别接种于3瓶装有100ml含有50mg/l kan抗性的lb液体培养基的500ml摇瓶中，37℃、200rpm培养12-16h，获得二级种子液；
[0094]
(4)发酵培养：按照体积浓度15％的接种量，取步骤(3)得到的二级种子液，接种至含有50mg/l kan抗性发酵培养基的5l发酵罐中，装液量为2l/5l，培养温度为37℃，初始搅拌转速300rpm，通过搅拌和通风控制溶氧值在20-30％，通过流加氨水控制ph在6.75-6.85。发酵至od
600
达到0.6-0.8时加入终浓度24mg/l的iptg，在30℃、300rpm条件下进行诱导培养；发酵过程中，每4h取样，采用实施例1方法检测od
600
、残糖含量和l-甲硫氨酸含量；发酵至12h初糖基本消耗完，发酵液初始葡萄糖浓度低于2g/l，开始以20ml/h流加补料培养基直至结束。发酵后期，菌体逐渐死亡，do值上升，当do值上升至50％及以上停止流加，当do值达到100％时发酵结束。
[0095]
结果见图8所示。发酵结束l-甲硫氨酸在92h的产量最高，为17.35g/l，最高糖酸转化率为6.67％。
[0096]
通过上述实施例1-8发现，常规发酵优化操作可以在一定程度提高发酵产量，但同时会使发酵周期延长，对发酵工业成本造成巨大浪费；同时通过7、8两个恒速补料实施例发现，恒速补料虽然使得补料调控简单，但发酵过程未满足菌体本身的需求，造成发酵过程中葡萄糖不足或过多，对菌体生长和产物合成造成负面影响，为此本发明进一步在上述实施例结果分析的基础上提出多阶段变速补料策略，以期在提高发酵产量的同时缩短发酵时
间。
[0097]
实施例9：一种采用新型补料方式(1)发酵生产l-甲硫氨酸的方法
[0098]
(1)活化培养：将大肠杆菌zjbssc362划线到含有50mg/l kan抗性的lb平板37℃培养过夜，得到活化菌；
[0099]
(2)一级种子培养：挑取单菌落接种于10ml含有50mg/l kan抗性的lb液体培养基的试管中37℃、200rpm培养12h，获得一级种子液；
[0100]
(3)二级种子培养：取1ml步骤(2)培养的一级种子液分别接种于3瓶装有100ml含有50mg/l kan抗性的lb液体培养基的500ml摇瓶中，37℃、200rpm培养12-16h，获得二级种子液；
[0101]
(4)发酵培养：按照体积浓度15％的接种量，取步骤(3)得到的二级种子液，接种至含有50mg/l kan抗性发酵培养基的5l发酵罐中，装液量为2l/5l，培养温度为37℃，初始搅拌转速300rpm，通过搅拌和通风控制溶氧值在20-30％，通过流加氨水控制ph在6.75-6.85。发酵至od
600
达到0.6-0.8时加入终浓度24mg/l的iptg，在30℃、300rpm条件下进行诱导培养；发酵过程中，每4h取样，采用实施例1方法检测od
600
、残糖含量和l-甲硫氨酸含量；发酵至12h初糖基本消耗完，发酵液初始葡萄糖浓度低于2g/l开始流加补料培养基；即从12h开始采用溶氧反馈方式以40ml/h的速度流加补料培养基维持溶氧值在30％；当od
600
达到10时以10ml/h的恒定流速流加补料培养基维持溶氧值在30％；当od
600
达到30时以20ml/h的恒定流速流加补料培养基维持溶氧值在30％；当od
600
达到45时以30ml/h的恒定流速流加补料培养基维持溶氧值在30％。发酵后期，菌体逐渐死亡，do值上升，当do值上升至50％及以上停止流加；当do值达到100％时发酵结束。
[0102]
结果见图9所示。发酵结束l-甲硫氨酸在84h的产量最高，为29.09g/l，最高糖酸转化率为11.19％。
[0103]
实施例10：一种采用新型补料方式(2)发酵生产l-甲硫氨酸的方法
[0104]
(1)活化培养：将大肠杆菌zjbssc362划线到含有50mg/l kan抗性的lb平板37℃培养过夜，得到活化菌；
[0105]
(2)一级种子培养：挑取单菌落接种于10ml含有50mg/l kan抗性的lb液体培养基的试管中37℃、200rpm培养12h，获得一级种子液；
[0106]
(3)二级种子培养：取1ml步骤(2)培养的一级种子液分别接种于3瓶装有100ml含有50mg/l kan抗性的lb液体培养基的500ml摇瓶中，37℃、200rpm培养12-16h，获得二级种子液；
[0107]
(4)发酵培养：按照体积浓度15％的接种量，取步骤(3)得到的二级种子液，接种至含有50mg/l kan抗性发酵培养基的5l发酵罐中，装液量为2l/5l，培养温度为37℃，初始搅拌转速300rpm，通过搅拌和通风控制溶氧值在20-30％，通过流加氨水控制ph在6.75-6.85。发酵至od
600
达到0.6-0.8时加入终浓度24mg/l的iptg，在30℃、300rpm条件下进行诱导培养；发酵过程中，每4h取样，采用实施例1方法检测od
600
、残糖含量和l-甲硫氨酸含量；发酵至12h初糖基本消耗完，发酵液初始葡萄糖浓度低于2g/l时开始流加补料培养基；即从12h开始采用溶氧反馈方式以40ml/h的速度流加补料培养基维持溶氧值在30％；当od
600
达到10时以20ml/h的恒定流速流加补料培养基维持溶氧值在30％；当od
600
达到30时以30ml/h的恒定流速流加补料培养基维持溶氧值在30％；当od
600
达到45时以40ml/h的恒定流速流加补料
培养基维持溶氧值在30％。发酵后期，菌体逐渐死亡，do值上升，当do值上升至50％及以上停止流加；当do值达到100％时发酵结束。
[0108]
结果见图10所示。发酵结束l-甲硫氨酸在88h的产量最高，为30.11g/l，最高糖酸转化率为11.58％。
[0109]
实施例11：一种采用新型补料方式(3)发酵生产l-甲硫氨酸的方法
[0110]
(1)活化培养：将大肠杆菌zjbssc362划线到含有50mg/l kan抗性的lb平板37℃培养过夜，得到活化菌；
[0111]
(2)一级种子培养：挑取单菌落接种于10ml含有50mg/l kan抗性的lb液体培养基的试管中37℃、200rpm培养12h，获得一级种子液；
[0112]
(3)二级种子培养：取1ml步骤(2)培养的一级种子液分别接种于3瓶装有100ml含有50mg/l kan抗性的lb液体培养基的500ml摇瓶中，37℃、200rpm培养12-16h，获得二级种子液；
[0113]
(4)发酵培养：按照体积浓度15％的接种量，取步骤(3)得到的二级种子液，接种至含有50mg/l kan抗性发酵培养基的5l发酵罐中，装液量为2l/5l，培养温度为37℃，初始搅拌转速300rpm，通过搅拌和通风控制溶氧值在20-30％，通过流加氨水控制ph在6.75-6.85。发酵至od
600
达到0.6-0.8时加入终浓度24mg/l的iptg，在30℃、300rpm条件下进行诱导培养；发酵过程中，每4h取样，采用实施例1方法检测od
600
、残糖含量和l-甲硫氨酸含量；发酵至12h初糖基本消耗完，发酵液初始葡萄糖浓度低于2g/l开始流加补料培养基；即从12h开始采用溶氧反馈的方式以40ml/h的速度流加补料培养基维持溶氧值在30％；当od
600
达到10时以15ml/h的恒定流速流加补料培养基维持溶氧值在30％；当od
600
达到30时以20ml/h的恒定流速流加补料培养基维持溶氧值在30％；当od
600
达到45时以25ml/h的恒定流速流加补料培养基。发酵后期，菌体逐渐死亡，do值上升，当do值上升至50％及以上停止流加；当do值达到100％时发酵结束。
[0114]
结果见图11所示。由发酵结果可知，采用上述变速流加补料策略，可使发酵过程在第68h结束，比初始条件缩短了4h；此时l-甲硫氨酸产量最高，为31.71g/l，比初始条件提高了74.23％；最高糖酸转化率为12.2％，比初始条件提高了74.29％。
[0115]
由上述三种新型补料方式实施例可知，根据细胞生长情况改变发酵过程中的补料速率可以显著提升l-甲硫氨酸的发酵产量，并且控制适当的补料速率可以缩短发酵时间，满足工业化生产的需要。

技术特征：
1.一种全发酵法高产l-甲硫氨酸产量的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：以产l-甲硫氨酸重组大肠杆菌为生产菌株，接种至含50mg/l卡那霉素抗性的发酵培养基中，培养温度为37℃，发酵时搅拌转速300-1000r/min；通过搅拌和通风控制溶氧值在20-30％，通过流加氨水控制ph在6.75-6.85；发酵至od
600
达到0.6-0.8时加入终浓度24mg/l的iptg，在30℃、300-1000r/min条件下进行诱导培养；发酵过程中，每4h取样检测od
600
、残糖含量和l-甲硫氨酸含量；在发酵至发酵液初始葡萄糖浓度低于2g/l后，采用溶氧反馈方式流加补料培养基维持溶氧值在20-30％；当od
600
达到10时以10-20ml/h的恒定流速流加补料培养基维持溶氧值在20-30％；当od
600
达到30时以20-30ml/h的恒定流速流加补料培养基维持溶氧值在20-30％；当od
600
达到45时以25-40ml/h的恒定流速流加补料培养基维持溶氧值在20-30％；发酵后期，菌体逐渐死亡，溶氧值上升，当溶氧值上升至50％及以上停止流加；当溶氧值达到100％时发酵结束；所述发酵培养基：葡萄糖10g/l、cacl2·
2h2o 0.08g/l、mgso4·
7h2o 5g/l、柠檬酸2.5g/l、kh2po
4 2.5g/l、k2hpo4·
3h2o 1.38g/l、fecl3·
6h2o 0.12g/l、(nh4)2so
4 3.3g/l、na2s2o
3 3.95g/l、0.01g/l的vb
12
、0.01g/l的vb1、0.05g/l的l-赖氨酸、ssa 2ml/l、ssb 1ml/l；补料培养基：葡萄糖500g/l、mgso4·
7h2o 5g/l、fecl3·
6h2o 0.06g/l、(nh4)2so
4 33g/l、na2s2o
3 39.5g/l、甜菜碱0.5g/l、ssa 1.6ml/l、ssb 0.8ml/l、0.01g/l的vb
12
、0.01g/l的vb1、0.05g/l的l-赖氨酸，溶剂为水；所述ssa组成为：znso4·
7h2o 8.5g/l、mncl2·
2h2o 7.5g/l、cucl2·
2h2o 0.75g/l、cocl2·
6h2o 1.25g/l、edta 4g/l，溶剂为水。所述ssb组成为：h3bo
3 3g/l、na2moo4·
2h2o 2.5g/l，溶剂为水。2.如权利要求1所述全发酵法高产l-甲硫氨酸产量的方法，其特征在于，所述生产菌株为大肠杆菌(escherichia coli)cctcc no：m 2020846。3.如权利要求1所述全发酵法高产l-甲硫氨酸产量的方法，其特征在于，当od
600
达到10时以15ml/h的恒定流速流加补料培养基维持溶氧值在20-30％；当od
600
达到30时以20ml/h的恒定流速流加补料培养基维持溶氧值在20-30％；当od
600
达到45时以25ml/h的恒定流速流加补料培养基维持溶氧值在20-30％；发酵后期，菌体逐渐死亡，溶氧值上升，当do值上升至50％及以上停止流加；当溶氧值达到100％时发酵结束。4.如权利要求1所述全发酵法高产l-甲硫氨酸产量的方法，其特征在于，所述生产菌株在接种前先进行斜面活化和种子扩大培养基，将种子液以体积浓度10-15％的接种量接种至发酵培养基；所述种子液按如下步骤制备：(1)活化培养：将生产菌株接种到lb平板培养基上，37℃培养过夜，得到活化菌；所述lb平板培养基组成：蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、nacl 5g/l，琼脂粉20g/l，溶剂为水，ph＝6.8-7.0；(2)一级种子培养：将步骤(1)得到的活化菌接种于lb液体培养基中，37℃、200rpm培养12h，得到一级种子液；lb液体培养基组成：蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、nacl 5g/l，溶剂为水，ph＝6.8-7.0；(3)二级种子培养：将步骤(2)得到的一级种子液按体积浓度1-3％的接种量接种于lb液体培养基中，37℃、200rpm培养12-16h，得到二级种子液；所述lb液体培养基组成同步骤(2)。

技术总结
本发明公开了一种全发酵法高产L-甲硫氨酸的方法，以产L-甲硫氨酸重组大肠杆菌为生产菌株，在发酵至发酵液初始葡萄糖浓度低于2g/L后，采用溶氧反馈方式流加补料培养基维持溶氧值在20-30％；当OD


技术研发人员：柳志强 梅子龙 牛坤 周海岩 张博 汤晓玲 徐建妙 郑裕国
受保护的技术使用者：浙江工业大学
技术研发日：2023.03.23
技术公布日：2023/7/17