诱导鼻黏膜基底层上皮干细胞分化成自主翻转的类器官的方法与流程

1.本发明涉及一种诱导鼻黏膜基底层上皮干细胞分化成自主翻转的类器官的方法，属于细胞诱导分化技术领域。


背景技术：

2.类器官代表着一种能够概括整个生物体生理过程的创新技术，具有更接近生理细胞组成和行为、更稳定的基因组、更适合于生物转染和高通量筛选等优势。与动物模型相比，类器官模型的操作更简单，还能用于研究疾病发生和发展等机理。因而在器官发育、精准医疗、再生医学、药物筛选、基因编辑、疾病建模等领域都有广泛的应用前景。
3.鼻黏膜慢性炎症性疾病是耳鼻咽喉科的常见、多发疾病，包括过敏性鼻炎(allergic rhinitis，ar)及慢性鼻窦炎(chronic rhinosinusitis，crs)等。ar与crs不仅两者间的发病密切相关，还均与下呼吸道疾病如哮喘(asthma)和慢阻肺(chronic obstructive pulmonary disease，copd)的发生具有紧密联系，严重损害患者的生活质量，并导致高额的医疗支出，给社会造成了极大的医疗负担。目前，鼻黏膜慢性炎症性疾病的发病机制十分复杂，仍不完全清楚，其常规治疗方法仍存在疗效有待改进、缺乏根治性手段等诸多问题，亟待持续深入的基础性研究，在阐明发病机制的基础上向临床转化，探索更有效的针对性治疗策略。
4.体外培养人鼻黏膜上皮细胞并进行诱导分化对于呼吸道生物学、疾病发病机制的基础研究以及新型诊疗技术的开发都起到了十分重要的作用。气液界面培养法(ali)即3d诱导分化是目前最常用的一种呼吸道上皮的培养技术，为研究气道上皮细胞形态学和功能学提供了良好的体外研究平台。但对于具体的干细胞，在何种培养条件下能诱导分化得到有功能的类器官，仍需进行艰苦的摸索。


技术实现要素：

5.针对上述现有技术，本发明提供了一种诱导鼻黏膜基底层上皮干细胞分化成自主翻转的类器官的方法。
6.本发明是通过以下技术方案实现的：
7.一种诱导鼻黏膜基底层上皮干细胞分化成自主翻转的类器官的方法，包括以下步骤：
8.(1)matrigel铺板：取40％的solution，加入培养孔板中，置于细胞培养箱中孵育；
9.(2)细胞准备：将hnepcs细胞进行消化处理；
10.(3)细胞种板：用5％solution将上述细胞重悬，放入预先孵育的40％solution中，放入细胞培养箱进行培养；
11.(4)3天换一次液，在培养的第6天向培养基中添加dapt，持续培养21天；得到自主翻转的类器官。
12.进一步地，具体步骤如下：
13.(1)matrigel铺板：取40％的solution，加入24孔板中，0.5ml/孔，铺2孔，置于37℃细胞培养箱中孵育30min；
14.(2)细胞准备：将状态良好的hnepcs细胞进行消化处理，取9.0
×
104个细胞放入离心管中，1000rpm离心5min，弃上清；
15.(3)细胞种板：用0.5ml的5％solution将上述细胞重悬，放入预先孵育的40％solution中，放入37℃细胞培养箱进行培养；
16.(4)3天换一次液，在培养的第6天向培养基中添加终浓度为20μm的dapt，持续培养21天；得到自主翻转的类器官。
17.本发明设计3种不同浓度的solution进行铺板，分别为40％、60％及100％的solution，在其他诱导分化条件相同的情况下观察在这三种不同浓度的solution中鼻黏膜基底层上皮干细胞所形成的类器官的形态等的变化，摸索在3d诱导分化时所用solution的最适浓度。结果发现浓度为40％时最适合有功能的类器官的形成。本发明通过实验研究，得到了可靠的诱导鼻黏膜基底层上皮干细胞分化成自主翻转的类器官的方法，为研究气道上皮细胞形态学和功能学提供了良好的基础，对呼吸道生物学、疾病发病机制的基础研究以及新型诊疗技术的开发具有重要意义。
附图说明
18.图1：hnepcs-028-p3在40％solution条件时诱导分化结果图。
19.图2：hnepcs-028-p3在60％solution条件时诱导分化结果图。
20.图3：hnepcs-028-p3在100％solution条件时诱导分化结果图。
具体实施方式
21.下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域技术人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
22.下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法、检测方法，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法、检测方法。
23.实施例1诱导分化
24.1.1matrigel铺板：取40％、60％及100％solution分别加入24孔板中，0.5ml/孔，各铺2孔，置于37℃细胞培养箱，孵育30min；
25.1.2细胞准备：将状态良好的hnepcs细胞进行消化处理，取9.0
×
104个细胞放入离心管中，1000rpm，5min离心，弃上清；
26.1.3细胞种板：用预热的0.5ml 5％solution将上诉细胞进行重悬，分别
放入预先孵育的40％、60％及100％solution中，放入37℃细胞培养箱进行培养；
27.1.4 3天换一次液，在培养的第6天向培养基中添加dapt(20μm)，持续培养21天；
28.1.5每天进行观察并拍照记录类器官分化状态。
29.结果如图1、图2、图3所示。由图可见，solution浓度为40％时，最适合有功能的类器官的形成。
30.给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。


技术特征：
1.一种诱导鼻黏膜基底层上皮干细胞分化成自主翻转的类器官的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)matrigel铺板：取40％的solution，加入培养孔板中，置于细胞培养箱中孵育；(2)细胞准备：将hnepcs细胞进行消化处理；(3)细胞种板：用5％solution将上述细胞重悬，放入预先孵育的40％solution中，放入细胞培养箱进行培养；(4)3天换一次液，在培养的第6天向培养基中添加dapt，持续培养21天；得到自主翻转的类器官。2.根据权利要求1所述的诱导鼻黏膜基底层上皮干细胞分化成自主翻转的类器官的方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)matrigel铺板：取40％的solution，加入24孔板中，0.5ml/孔，铺2孔，置于37℃细胞培养箱中孵育30min；(2)细胞准备：将状态良好的hnepcs细胞进行消化处理，取9.0
×
104个细胞放入离心管中，1000rpm离心5min，弃上清；(3)细胞种板：用0.5ml的5％solution将上述细胞重悬，放入预先孵育的40％solution中，放入37℃细胞培养箱进行培养；(4)3天换一次液，在培养的第6天向培养基中添加终浓度为20μm的dapt，持续培养21天；得到自主翻转的类器官。

技术总结
本发明公开了一种诱导鼻黏膜基底层上皮干细胞分化成自主翻转的类器官的方法，包括以下步骤：(1)Matrigel铺板：取40％的solution，加入培养孔板中，置于细胞培养箱中孵育；(2)细胞准备：将HNEpCs细胞进行消化处理；(3)细胞种板：用5％solution将上述细胞重悬，放入预先孵育的40％solution中，放入细胞培养箱进行培养；(4)3天换一次液，在培养的第6天向培养基中添加DAPT，持续培养21天；得到自主翻转的类器官。本发明为研究气道上皮细胞形态学和功能学提供了良好的基础。好的基础。好的基础。


技术研发人员：李琼琼 马成瑶 崔玉芹 温泉 张文华 张智慧
受保护的技术使用者：银丰生物工程集团有限公司
技术研发日：2023.03.22
技术公布日：2023/7/17