一种重组蛛丝蛋白、重组蛛丝蛋白混合纤维及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及蛋白质领域，尤其涉及一种重组蛛丝蛋白、重组蛛丝蛋白混合纤维、重组蛛丝蛋白混合纤维的制备方法、生物材料和用途。


背景技术：

2.今天，人类正面临着不可持续资源枯竭的危机，天然聚合物因其丰富的来源和可持续性而受到越来越多的关注。蜘蛛蛋白作为一种结构蛋白，在自然界众多天然高分子材料中受到了特别的关注，成年蜘蛛至少分泌7种蛋白丝，其中牵引丝因其优异的综合力学性能受到广泛研究。
3.蜘蛛牵引丝是由蜘蛛主壶腹腺的柱形上皮细胞产生的，至少以两种蛋白质组分(masp1和masp2)为核心形成的一种具有多级结构的蛋白质纤维。大多数蜘蛛牵引丝蛋白包含中央大的重复核心域，两侧是小的非重复末端结构域。重复核心域的数量及不同类型的重复片段对蛛丝的材料学性能起决定性作用。两端结构域在参与蛛丝蛋白在腺体中的储存和拉伸成丝自组装过程具有重要作用。根据蛛丝蛋白masp1和masp2的分子结构，两种蜘蛛蛋白都被认为以不同的方式对牵引丝的机械性能做出了贡献。其中masp1被认为是蜘蛛牵引丝刚性性能的主要来源，而masp2被认为对其弹性性能具有很大贡献。蜘蛛可以通过将两种蛋白以不同的比例混合得到具有不同力学性能的纤维，以实现不同的生理功能。
4.由于蜘蛛的产丝量少且不易大规模饲养，所以人造蛛丝纤维制备主要通过表达重组蛛丝蛋白并进行人工纺丝来实现。然而目前人工体外合成的蛛丝纤维的力学性能仍无法与天然蜘蛛丝相媲美。其中一个主要原因是大多数的重组蛛丝蛋白只改造了单一masp1或masp2基因序列，对于两种蛋白在体内形成异源二聚体或在体外共混的研究较少，另一方面，许多重组蛛丝蛋白在异源合成时缺乏末端结构域，均导致两种蛋白很难交叉自组装，影响纤维性能。


技术实现要素：

5.技术问题
6.有鉴于此，本发明要解决的技术问题是，如何提供一种重组蛛丝蛋白、重组蛛丝蛋白混合纤维、重组蛛丝蛋白混合纤维的制备方法、生物材料和用途。
7.本发明通过模拟蜘蛛天然状态开发两种蛋白按天然蛋白比例在体外混合以及将两种蛋白在体内进行融合表达形成纤维，对于开发蛛丝蛋白新型组装体和提升人造蛛丝纤维性能具有十分重要的意义。
8.解决方案
9.为解决以上技术问题，本发明提供如下技术方案：
10.第一方面，本发明提供一种重组蛛丝蛋白，其包含至少两种重组蛋白：sp-1-k融合蛋白和sp-2-k融合蛋白；
11.所述sp-1-k融合蛋白为下述a1)～a4)蛋白中任一种：
12.a1)其氨基酸序列包括：m个直接串联的表现形式如[s1-elp1]所示的的氨基酸序列单元，其中，s1表示如seq id no:1所示的氨基酸序列，elp1为类弹性蛋白序列，[s1
–
elp1]表示s1序列和elp1序列串联；m表示[s1
–
elp1]序列的重复数，m为1-36之间的整数；
[0013]
其中，seq id no:1所示的氨基酸序列如下：
[0014]
gpygpgasaaaaaaggygpgsgqqgpgqqgpgqqgpgqqgpgqq
[0015]
a2)其氨基酸序列包括：在a1)中相邻的氨基酸序列单元[s1
–
elp1]之间连有连接序列，可选地，连接序列包括两个或四个氨基酸，可选地所述连接序列为同尾的不同酶切位点酶切后再连接后编码的两个或四个氨基酸；可选地，连接序列为两个氨基酸；可选地，连接序列可以为ts(其为同尾的酶切位点spei(a/ctagt)酶切后的尾部和nhei(g/ctagc)酶切后的头部，再次连接后(actagc)的编码氨基酸)，由于多个重复单元直接合成具有一定的难度，以酶切位点的方式连接重复单元时就会产生这种连接序列，而且酶切位点是可以根据需求选择的，即ts也可以替换成其它因更换酶切位点产生的序列，一般来说两个氨基酸或四个氨基酸均可以；
[0016]
a3)其氨基酸序列包括：a1)或a2)所示的氨基酸序列经过一个、两个或以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与a1)所示的蛋白质具有相同或相近性质的蛋白质；
[0017]
a4)其氨基酸序列包括：在a1)或a2)或a3)的n端引入天然蛛丝氨基结构域，和/或在a1)或a2)或a3)的c端引入天然蛛丝羧基结构域；
[0018]
a5)其氨基酸序列包括：在a1)或a2)或a3)或a4)的n端和/或c端引入组氨酸标签；
[0019]
所述sp-2-k融合蛋白为下述b1)～b4)中任一种：
[0020]
b1)其氨基酸序列包括：n个直接串联的表现形式如[s2-elp2]所示的的氨基酸序列单元，其中，s2表示如seq id no:2所示的氨基酸序列；elp2为类弹性蛋白序列；[s2
–
elp2]表示s2序列和elp2序列串联；n表示[s2
–
elp2]序列的重复数，n为1-36之间的整数；
[0021]
其中，seq id no:2所示的氨基酸序列如下：
[0022]
gssaaaaaaaasgpggygpenqgpsgpggygpggp
[0023]
b2)其氨基酸序列包括：b1)中相邻的氨基酸序列单元[s2
–
elp2]之间有连接序列，所述连接序列为同尾的不同酶切位点酶切后再连接后编码的两个或四个氨基酸；
[0024]
b3)其氨基酸序列包括：b1)或b2)所示的氨基酸序列经过一个、两个或以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与a1)所示的蛋白质具有相同或相近性质的蛋白质；
[0025]
b4)其氨基酸序列包括：b1)或b2)或b3)的n端引入天然蛛丝氨基结构域，和/或在b1)或b2)或b3)的c端引入天然蛛丝羧基结构域；
[0026]
b5)在b1)或b2)或b3)或b4)的n端和/或c端引入组氨酸标签。
[0027]
进一步地，sp-1-k融合蛋白中：
[0028]
m为8-24之间的整数，可选地为8-16之间的整数，可选地为10-14之间的整数，可选地为12；
[0029]
elp1的氨基酸序列包含若干如seq id no:3：vpgxg所示的氨基酸序列串联而成的氨基酸序列，表现形式为(vpgxg)i，其中，x为赖氨酸或精氨酸或其它氨基酸，可选地x为赖
氨酸；i为seq id no:3序列的重复数，i为1-40之间的整数，可选地地i为3-10之间的整数，可选地i为3-8之间的整数，可选地i为4-6之间的整数，可选地i为5。
[0030]
seq id no:3的氨基酸序列为：vpgxg，x为赖氨酸或精氨酸或其它氨基酸，可选地x为赖氨酸；
[0031]
可选地，sp-1-k融合蛋白的氨基酸序列的表现形式为
[0032]
[gpygpgasaaaaaaggygpgsgqqgpgqqgpgqqgpgqqgpgqq-(vpgkg)i]m，其中，m表示[s1
–
elp1]序列(gpygpgasaaaaaaggygpgsgqqgpgqqgpgqqgpgqqgpgqq-(vpgkg)i)的重复数，m为1-36之间的整数，可选地为8-16之间的整数，可选地为10-14之间的整数，可选地为12；i为3-10之间的整数，可选地i为3-8之间的整数，可选地i为4-6之间的整数，可选地i为5。
[0033]
可选地，氨基酸序列单元的氨基酸序列[s1
–
elp1]如seq id no:4所示，序列如下：
[0034]
gpygpgasaaaaaaggygpgsgqqgpgqqgpgqqgpgqqgpgqqvpgkgvpg kgvpgkgvpgkgvpgkg
[0035]
进一步地，sp-2-k融合蛋白中：
[0036]
n为8-24之间的整数，可选地为8-16之间的整数，可选地为10-14之间的整数，可选地为12；
[0037]
elp2的氨基酸序列包含若干如seq id no:3：vpgxg所示的氨基酸序列串联而成的氨基酸序列，表现形式为(vpgxg)j，其中，x为赖氨酸或精氨酸或其它氨基酸，可选地x为赖氨酸；j为seq id no:3序列的重复数，j为1-40之间的整数，可选地j为3-10之间的整数，可选地j为3-8之间的整数，可选地j为4-6之间的整数，可选地j为5。
[0038]
可选地，sp-2-k融合蛋白的序列的表现形式为
[0039]
[gssaaaaaaaasgpggygpenqgpsgpggygpggp(vpgkg)j]n，其中，n表示[s2
–
elp2]序列(gssaaaaaaaasgpggygpenqgpsgpggygpggp(vpgkg)j)的重复数，n为1-36之间的整数，可选地为8-16之间的整数，可选地为10-14之间的整数，可选地为12；j为3-10之间的整数，可选地j为3-8之间的整数，可选地j为4-6之间的整数，可选地j为5。
[0040]
可选地，氨基酸序列单元的氨基酸序列[s2
–
elp2]如seq id no:5所示，序列如下：
[0041]
gssaaaaaaaasgpggygpenqgpsgpggygpggpvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkg
[0042]
进一步地，sp-1-k融合蛋白的a3)蛋白和/或sp-2-k融合蛋白的b3)蛋白中，天然蛛丝氨基结构域包含如seq id no:6所示的氨基酸序列。
[0043]
seq id no:6所示的氨基酸序列如下：
[0044]
gqantpwsskanadafinsfisaasntgsfsqdqmedmsligntlmaamdnmggritpsklqaldmafassvaeiaaseggdlgvttnaiadaltsafyqttgvvnsrfiseirsligmfaqasandvyasagsgsggggygassasaasasaaapsgvayqapaqaqisftlrgqqpvs
[0045]
进一步地，sp-1-k融合蛋白的a3)和/或sp-2-k融合蛋白的b3)中，天然蛛丝的羧基结构域包含如seq id no:7所示的氨基酸序列。
[0046]
seq id no:7所示的氨基酸序列如下：
[0047]
gaasaavsvggygpqsssapvasaaasrlsspaassrvssavsslvssgptnqaalsntissvvsqvsasnpglsgcdvlvqallevvsalvsilgsssigqinygasaqytqmvgqsvaqalag
[0048]
可选地，sp-1-k融合蛋白的序列如seq id no:8或9所示。
[0049]
seq id no:8序列(1174个氨基酸，其含有氨基结构域和羧基结构域)如下：
[0050]
mgqantpwsskanadafinsfisaasntgsfsqdqmedmsligntlmaamdnmggritpsklqaldmafassvaeiaaseggdlgvttnaiadaltsafyqttgvvnsrfiseirsligmfaqasandvyasagsgsggggygassasaasasaaapsgvayqapaqaqisftlrgqqpvsggggsggggshmasgpygpgasaaaaaaggygpgsgqqgpgqqgpgqqgpgqqgpgqqvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgtsgpygpgasaaaaaaggygpgsgqqgpgqqgpgqqgpgqqgpgqqvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgtsgpygpgasaaaaaaggygpgsgqqgpgqqgpgqqgpgqqgpgqqvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgtsgpygpgasaaaaaaggygpgsgqqgpgqqgpgqqgpgqqgpgqqvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgtsgpygpgasaaaaaaggygpgsgqqgpgqqgpgqqgpgqqgpgqqvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgtsgpygpgasaaaaaaggygpgsgqqgpgqqgpgqqgpgqqgpgqqvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgtsgpygpgasaaaaaaggygpgsgqqgpgqqgpgqqgpgqqgpgqqvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgtsgpygpgasaaaaaaggygpgsgqqgpgqqgpgqqgpgqqgpgqqvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgtsgpygpgasaaaaaaggygpgsgqqgpgqqgpgqqgpgqqgpgqqvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgtsgpygpgasaaaaaaggygpgsgqqgpgqqgpgqqgpgqqgpgqqvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgtsgpygpgasaaaaaaggygpgsgqqgpgqqgpgqqgpgqqgpgqqvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgtsgpygpgasaaaa
[0051]
aaggygpgsgqqgpgqqgpgqqgpgqqgpgqqvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvp
[0052]
gkgtsgaasaavsvggygpqsssapvasaaasrlsspaassrvssavsslvssgptnq
[0053]
aalsntissvvsqvsasnpglsgcdvlvqallevvsalvsilgsssigqinygasaqyt
[0054]
qmvgqsvaqalagts
[0055]
seq id no:9所示的序列为seq id no:8序列下划线标记部分(982个氨基酸)，其含有羧基结构域。
[0056]
可选地，sp-2-k融合蛋白的序列如seq id no:10或11所示。
[0057]
seq id no:10的序列(1066个氨基酸，其含有氨基结构域和羧基结构域)如下：
[0058]
mgqantpwsskanadafinsfisaasntgsfsqdqmedmsligntlmaamdnmggritpsklqaldmafassvaeiaaseggdlgvttnaiadaltsafyqttgvvnsrfiseirsligmfaqasandvyasagsgsggggygassasaasasaaapsgvayqapaqaqisftlrgqqpvsggggsggggshmasgssaaaaaaaasgpggygpenqgpsgpggygpggpvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgtsgssaaaaaaaasgpggygpenqgpsgpggygpggpvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgtsgssaaaaaaaasgpggygpenqgpsgpggygpggpvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgtsgssaaaaaaaasgpggygpenqgpsgpggygpggpvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgtsgssaaaaaaaasgpggygpenqgpsgpggygpggpvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgtsgssaaaaaaaasgpggygpenqgpsgpggygpggpvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgtsgssaaaaaaaasgpggygpenqgpsgpggygpggpvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgtsgssaaaaaaaasgpggygpenqgpsgpggygpggpvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgtsgssaaaaaaaasgpggygpenqgpsgpggygpggpvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgtsgssaaaaaaaasgpggygpenqgpsgpggygpggpvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgtsgssaaaaaaaasgpggygpenqgpsgpggygpggpvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgtsgssaaaaaaaasgpggygpenqgpsgpggygpggpvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgtsgaasaavsvggygpqsssapvasaaasrlsspaassrvssavsslvssgptnqaalsntissvvsqvsasnpglsgcdvlvqallevvsalvsilgsssigqinygasaqytqmvgqsvaqalagts
[0059]
seq id no:11所示的序列为seq id no:10序列下划线标记部分(874个氨基酸)，其含有羧基结构域。
[0060]
进一步地，所述sp-1-k融合蛋白和sp-2-k融合蛋白的重量比为(0.2～3)：1，可选地为(0.6～2)：1，可选地为(0.6～1.5)：1，可选地为1.5：1。
[0061]
进一步地，所述sp-1-k融合蛋白和sp-2-k融合蛋白通过体外共混或微生物体内共表达获得的融合蛋白。
[0062]
第二方面，提供一种重组蛛丝蛋白混合纤维，其包括第一方面所述的重组蛛丝蛋白，其为人工纺丝；
[0063]
可选地，所述sp-1-k融合蛋白和sp-2-k融合蛋白的重量比为(0.2～3)：1，可选地为(0.6～2)：1，可选地为(0.6～1.5)：1，可选地为1.5：1。
[0064]
第三方面，提供一种第二方面所述的重组蛛丝蛋白混合纤维的制备方法，其包括：
[0065]
将所述sp-1-k融合蛋白和sp-2-k融合蛋白溶于溶剂中制备蛋白溶液，利用注射泵将所述蛋白溶液挤出到凝固浴中固化成初生纤维。
[0066]
进一步地，所述溶剂为六氟异丙醇或甲酸。
[0067]
进一步地，所述sp-1-k融合蛋白和sp-2-k融合蛋白按重量比(0.2～3)：1溶于六氟异丙醇中制备蛋白溶液，可选地，所述sp-1-k融合蛋白和sp-2-k融合蛋白在蛋白溶液中的质量分数为150～200mg/ml，可选地为150mg/ml，可选地，所述sp-1-k融合蛋白和sp-2-k融合蛋白分别通过重组大肠杆菌表达后纯化获得。
[0068]
进一步地，所述sp-1-k融合蛋白和sp-2-k融合蛋白通过在重组大肠杆菌体内共表达后纯化获得，可选地，溶于甲酸溶液中。
[0069]
进一步地，所述凝固浴为以体积比计80-100％甲醇溶液，可选地为90％甲醇溶液。
[0070]
进一步地，还包括对初生纤维的后拉伸：将初生纤维浸泡在拉伸浴中变软后，将其拉伸至原长的2～5倍，得后拉伸纤维。可选地，拉伸浴为以体积比计0-80％甲醇溶液，可选地为50％甲醇溶液。
[0071]
第四方面，提供与第一方面所述重组蛛丝蛋白、或第二方面所述的重组蛛丝蛋白混合纤维或第三方面所述的制备方法制备的重组蛛丝蛋白混合纤维相关的生物材料，所述生物材料为c1)至c4)中的任一种：
[0072]
c1)编码第一方面所述的重组蛛丝蛋白的sp-1-k融合蛋白和/或sp-2-k融合蛋白的核酸分子；
[0073]
c2)含有c1)所述核酸分子的表达盒；
[0074]
c3)含有c1)所述核酸分子的重组载体，或含有c2)所述表达盒的重组载体；可选地，所述重组载体采用pet25b质粒或pbluescript ii ks质粒；
[0075]
c4)含有c1)所述核酸分子的重组微生物，或含有b2)所述表达盒的重组微生物，或含有c3)所述重组载体的重组微生物；可选地，所述重组微生物为重组大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、哺乳动物细胞、酵母细胞或昆虫细胞。
[0076]
第五方面，提供一种第一方面所述的重组蛛丝蛋白或第二方面所述的重组蛛丝蛋白混合纤维或第三方面所述的制备方法制备的重组蛛丝蛋白混合纤维相或第四方面所述的生物材料的用途，所述用途包括以下d1)至d5)中的任一种或几种：
[0077]
d1)航天航空领域、军事领域或制备生物材料；
[0078]
d2)纸产品；
[0079]
d3)薄膜；
[0080]
d4)纺织品；
[0081]
d5)涂层。
[0082]
有益效果
[0083]
(1)本发明通过将两种重组蛛丝蛋白按比例在体外进行混合制成纤维，研究所述混合蛋白纤维在断裂强度、杨氏模量、韧性上均较单一蛋白纤维的优势，二是通过将两种重组蛛丝蛋白在体内进行共表达，通过引入两端结构域，在大肠杆菌内将两种蛋白自组装，来模拟蜘蛛天然状态以便获得具有优异机械性能的蛋白纤维。两种方式均有助于实现蛋白纤维的大批量制备。
[0084]
(2)本发明从仿生角度出发，利用基因工程技术，设计了两种重组蛛丝融合蛋白，利用天然蜘蛛牵引丝部分序列和亲水性类弹性蛋白融合，利用大肠杆菌表达系统时提高可溶性表达(可溶性表达可达20mg/l)，为开发重组蛛丝蛋白纤维提供了新方法。
[0085]
(3)本发明的sp-1-k融合蛋白和sp-2-k融合蛋白可以在体外经过不同比例混合，其综合力学性能均优于单一蛋白纤维。按天然蛛丝成分3:2比例混合形成的重组融合蛛丝纤维，其韧性可与天然蛛丝相媲美。
[0086]
(4)本发明还将sp-1-k融合蛋白和sp-2-k融合蛋白在大肠杆菌中通过二硫键进行融合表达，尽可能模拟蜘蛛天然状态以便获得具有优异机械性能的蛋白纤维。
[0087]
(5)本发明的纺丝工艺简便，易重复，可大量制备且经过后拉伸之后更为长程有序。尽管使用有机试剂进行纺丝，依然具有生物相容性和安全性，为纤维在医学领域应用提供了新材料。
附图说明
[0088]
一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
[0089]
图1.本发明的实施例1的重组蛛丝蛋白和共表达表达重组蛛丝蛋白载体构建示意图；其中，a为sp-1-k-羧基结构域蛋白的重组表达载体，b为sp-2-k-羧基结构域蛋白的重组表达载体，c为氨基结构域-sp-1-k-羧基结构域蛋白和氨基结构域-sp-2-k-羧基结构域蛋白融合的重组载体；
[0090]
图2.本发明使用的纺丝装置示意图；
[0091]
图3.本发明的实施例1的sp-1-k-羧基结构域蛋白拉伸前后力学性能测试曲线图；其中，a为拉伸前，b为拉伸后；
[0092]
图4.本发明的实施例1的sp-2-k-羧基结构域蛋白拉伸前后力学性能测试曲线图；其中，a为拉伸前，b为拉伸后；
[0093]
图5.本发明的实施例2的混合蛋白拉伸前后力学性能测试曲线图；其中，a为拉伸前，b为拉伸后；
[0094]
图6.本发明的实施例3的共表达重组蛛丝蛋白拉伸前后力学性能测试曲线图；其中，a为拉伸前，b为拉伸后；
[0095]
图7.本发明的体外混合蛋白纤维和体内共表达蛋白纤维细胞相容性图；其中，a、b、c、d分别是a是混合蛋白纤维在495nm波长下激发活细胞显色；b是混合蛋白纤维在539nm波长下激发死细胞显色；c是共表达蛋白纤维在495nm波长下激发活细胞显色；d是共表达蛋白纤维在539nm波长下激发死细胞显色。
[0096]
图8.本发明的小鼠食用体外混合蛋白纤维后肝功、肾功化验指标图。
具体实施方式
[0097]
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0098]
另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的原料、方案、方法、手段等未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。
[0099]
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
[0100]
以下实施例中，力学性能检测的检测方法为：采用纤维拉伸仪进行纤维力学性能测试。对所有原纤维测试时，拉伸速度为6mm/min，夹距间距离为3mm，检测纤维断裂强度、韧性和延展性，其中：
[0101]
纤维强度断裂强度断裂时的拉伸的为应力除以横截面，应力直接从机器中获取，横截面积利用圆形公式。
[0102]
纤维韧性为应力-应变曲线包围的面积。应力，应变直接从机器中获取。
[0103]
杨氏模量为线性弹性变形范围内应力-应变曲线的斜率。所用数据处理均利用origin pro 2016处理。
[0104]
以下实施例中，细胞相容性检测的检测方法为：
[0105]
利用小鼠胚胎成纤维细胞(3t3)验证纤维生物相容性。培养细胞操作如下：
[0106]
1)细胞复苏：先将胎牛血清(fbs)，dmem培养基置于37℃水浴锅中预热。再将储存在液氮中的3t3细胞快速取出，在37℃水浴锅中加热融化。在超净台中，将4ml培养基(20％ fbs和80％ dmem)置于25cm2细胞培养瓶中，再将融化后的1ml细胞注入其中，在37℃，5％ co2培养箱中培养。
[0107]
2)细胞传代：先将胎牛血清(fbs)，dmem培养基、pbs溶液、胰酶置于37℃水浴锅中预热。当上述细胞贴附在培养瓶底部且生长到适合传代时，在超净台中，弃掉上清液，用pbs溶液缓慢清洗两次。再加入1ml胰酶，将培养瓶置于恒温培养箱中2min，将贴附在培养瓶底部的细胞充分消化下来。再加入2-3ml培养基(10％ fbs和90％dmem)终止消化，吹吸壁上细胞。再将细胞悬浮液转移至15ml离心管中，在离心机中以4℃，1000rpm离心5min后弃上清。利用15ml培养基(10％ fbs和90％ dmem)重悬细胞后置于75cm2细胞培养瓶中，在37℃，5％ co2培养箱中培养。
[0108]
将纤维固定在6孔板中，在超净台中利用紫外灯灭菌30min。将培养好的细胞利用上述步骤消化，离心后，加入12ml培养基(10％ fbs和90％ dmem)重悬。再按照每孔2ml注入含有纤维的6孔板中，在37℃，5％ co2培养箱中培养。待细胞在纤维附着在纤维表面及周围后，利用细胞活死体染色法验证细胞活性。
[0109]
以下实施例中，细胞活死体染色法具体操作如下：
[0110]
用50μl的dmso溶液稀释calcein-am试剂，使其最终浓度为1mmol/l。取5μl浓度为1mmol/l的calcein-am试剂于1ml pbs溶液中，得到pbs-calcein-am溶液。在每个孔中加入此溶液20μl，在37℃，5％ co2培养箱中培养20min。操作过程中避光。结束后再加入10μl碘化丙锭(pi)，在37℃，5％ co2培养箱中培养10min。之后在共聚焦显微镜下观察。在495nm波长下激发calcein-am使其发绿光，在539nm波长下激发pi使其发红光。
[0111]
以下实施例中，肝功、肾功化验检测的检测方法为：
[0112]
为了进一步验证混合纤维的安全性，我们将20cm的纤维包裹在面包中，并连续7天喂给balb/c小鼠。我们在第9天取小鼠1ml全血。将全血在4度冰箱内静止12h，待分层后1000rpm离心1min，取上层血清。将血清委托生物公司进行化验。
[0113]
融合蛋白的表达载体的构建方法：
[0114]
1)构建基本基因元件：按如下顺序串联而成的编码序列：ndei+nhei+氨基酸序列单元的编码序列+spei+(cac)6+taatga+ecori，其中，ndei酶切位点为catatg、nhei酶切位点为gctagc、spei酶切位点为actagt、(cac)6为组氨酸标签序列、taatga为终止密码子和ecori酶切位点为gaattc。分别构建基本基因元件[s1
–
elp1]、基本基因元件[s2
–
elp2]，具体地：
[0115]
基本基因元件[s1
–
elp1]：为按如下顺序串联而成的编码序列：ndei+nhei+seq id no:4所示的氨基酸序列的编码序列+spei+(cac)6+taatga+ecori。
[0116]
基本基因元件[s2
–
elp2]：为按如下顺序串联而成的编码序列：ndei+nhei+seq id no:5所示的氨基酸序列的编码序列+spei+(cac)6+taatga+ecori。
[0117]
基本基因元件[s1
–
elp1]、[s2
–
elp2]分别采用人工合成，例如委托苏州金唯智公司。
[0118]
一种可行的氨基酸序列单元的串联方法如下：
[0119]
1)基因元件2的获得；通过nhei和spei双酶切将基本基因元件(1或2)和pbluescript ii ks质粒(市售，在这里简称m13)连接，获得嵌合蛋白单体载体，简称m13-单体；将m13-单体通过nhei和spei双酶切获得基因元件2。
[0120]
2)嵌合蛋白二聚体载体(简称m13-二聚体载体)的获得：将基因元件2与经过nhei酶切的m13-单体，在t4连接酶(购自takara公司)作用下，获得嵌合蛋白二聚体载体(m13-二聚体)。其中，基因元件2尾部的spei粘性末端与m13-单体线性片段的nhei粘性末端连接，连接处变成actagc(编码的氨基酸序列为ts)。
[0121]
3)嵌合蛋白四聚体载体(简称m13-四聚体载体)的获得：通过nhei和spei双酶切从m13-二聚体上获得嵌合蛋白二聚体基因片段(嵌合蛋白二聚体基因片段可表示为：nhei粘性末端+氨基酸序列单元的编码序列+actagc+氨基酸序列单元的编码序列+spei粘性末端)，嵌合蛋白二聚体基因片段与经过nhei酶切的m13-二聚体，在t4连接酶作用下，获得嵌合蛋白四聚体载体(简称m13-四聚体载体)。
[0122]
嵌合蛋白四聚体载体(简称m13-四聚体载体)经nhei和spei双酶切获得的嵌合蛋白四聚体基因片段可以表示为：nhei粘性末端+氨基酸序列单元的编码序列+actagc+氨基酸序列单元的编码序列+actagc+氨基酸序列单元的编码序列+actagc+c-elp蛋白单元的编码序列+spei粘性末端。
[0123]
4)按照上述方式可不断获得嵌合蛋白八聚体载体(简称m13-八聚体载体)、嵌合蛋白十二聚体载体(简称m13-十二聚体载体)、嵌合蛋白二十四聚体载体(简称m13-二十四聚体载体)等多聚体载体(统称m13-多聚体载体)，再通过ndei和ecori双酶切分别连接到pet25b质粒上，形成表达载体pet25b-多聚体，准备转入到reca重组酶缺陷型大肠杆菌blr(de3)表达系统进行iptg诱导表达。
[0124]
5)为优化蛋白，将羧基结构域片段(spei+seq id no:7所示的氨基酸序列的编码序列+spei)用spei酶切，再将m13-多聚体载体用spei酶单酶切，在t4连接酶作用下，获得带ctd序列的m13-多聚体载体；再通过ndei和ecori双酶切连接到pet25b质粒上，形成表达载体pet25b-多聚体-ctd，根据氨基酸序列单元的序列和数量不同，可以获得多种表达载体，包括：
[0125]
以编码基本基因元件[s1
–
elp1]构成的十二聚体表达载体pet25b-[s1
–
elp1]
12-ctd(相邻的如seq id no:4所示的氨基酸序列之间有连接氨基酸为ts，羧基结构域和如seq id no:4所示的氨基酸序列之间也有连接氨基酸ts)；该表达载体表达的融合蛋白命名为sp-1-elp-羧基结构域(其含有如seq id no:9所示的氨基酸序列)。
[0126]
以编码基本基因元件[s2
–
elp2]构成的十二聚体表达载体pet25b-[s2
–
elp2]
12-ctd(相邻的如seq id no:5所示的氨基酸序列之间有连接氨基酸为ts，羧基结构域和如seq id no:5所示的氨基酸序列之间也有连接氨基酸ts)；该表达载体表达的融合蛋白命名为sp-2-elp-羧基结构域(其含有如seq id no:11所示的氨基酸序列)。
[0127]
关于共表达载体的构建如图1所示，在表达载体pet25b-[s1
–
elp1]
12-ctd、pet25b-[s2
–
elp2]
12-ctd上增加编码如seq id no:6所示的氨基酸序列的天然蛛丝氨基结构域。具体方法如下：
[0128]
在表达载体pet25b-[s1
–
elp1]
12-ctd上添加氨基结构域：将编码如seq id no:6所示的氨基酸序列的氨基结构域片段利用pcr技术在编码如seq id no:6所示的氨基酸序列的基因序列两端加上同源臂1(碱基序列如seq id no:12所示：tttaactt taagaaggagatatacatatgggtcaagcgaacaccc)、同源臂2(碱基序列如se q id no:13所示：gtacggaccgctagccatatgactgccaccgccaccgctaccg ccaccgccacttacgggttgttgccc)，再将嵌合蛋白十二聚体载体(pet25b-sp-1-elp-ctd)用ndei酶单酶切，在购自vazyme公司的重组酶clonexpressⅱ(在体外由重组酶催化的同源重组反应只能在载体切口附近～10bp以内的位置进行)作用下，进行同源重组，获得带有氨基结构域和羧基结构域的表达载体pet25b-ntd-sp-1-elp-ctd，获得融合蛋白ntd-sp-1-elp-ctd，其含有如seq id no:8所示的氨基酸序列。
[0129]
在表达载体pet25b-[s2
–
elp2]
12-ctd上添加氨基结构域：方法参考同上，将编码如seq id no:6所示的氨基酸序列的氨基结构域片段利用pcr技术在编码如seq id no:6所示的氨基酸序列的基因序列两端加上同源臂1(碱基序列如seq id no:12所示：tttaactttaagaaggagatatacatatgggtcaagcgaacaccc))、同源臂3(碱基序列如seq id no:14所示：gcagccgcagaagagccgctagccatatgact gccaccgccaccgctaccgccaccgccacttacgggttgttgcccgcg)。获得带有氨基结构域和羧基结构域的表达载体pet25b-ntd-sp-2-elp-ctd，获得融合蛋白ntd-sp-2-elp-ctd，其含有如seq id no:10所示的氨基酸序列。
[0130]
构建共表达质粒，将表达载体pet25b-ntd-sp-1-elp-ctd用bgiii酶和bamhi酶双酶切，再将pet25b-ntd-sp-2-elp-ctd)用bgiii酶单酶切，在购自takara公司的t4连接酶作
用下，将两种蛋白克隆到同一表达载体上，获得如图1c所示的重组表达载体pet25b-ntd-sp-1-elp-ctd-ntd-sp-2-elp-ctd(其含有如seq id no:8、10所示的氨基酸序列)。
[0131]
实施例1：单一重组蛛丝蛋白纤维的制备
[0132]
将表达载体pet25b-[s1
–
elp1]
12-ctd、pet25b-[s2
–
elp2]
12-ctd分别经过reca重组酶缺陷型工程化大肠杆菌blr(de3)表达后纯化，获得冻干的sp-1-elp-羧基结构域融合蛛丝蛋白和sp-2-k-羧基结构域融合蛛丝蛋白，按蛋白浓度150mg/l分别溶于200μl六氟异丙醇中，使用1ml注射器吸取蛋白溶液，选择200μm内径的针头，再将蛋白溶液挤入90％甲醇水溶液(凝固浴)中，并用注射泵调节推进速度为5μl/min，用转筒收集器以线速度为0.6m/min的速度来收集纤维(图2)，得初生纤维。将收集到的纤维至于50％甲醇中浸泡至纤维变软，随后将纤维取出立即后拉伸至原长的200％左右，得到后拉伸纤维，对制备的纤维进行力学性能检测(图3-4)。
[0133]
图3结果表明，sp-1-elp-羧基结构域融合蛋白，拉伸前(初生纤维)的拉伸强度为102.68
±
5.76mpa，韧性为246.9
±
17.9mj/m3；拉伸后(后拉伸纤维)的拉伸强度为242.85
±
7.12mpa，韧性为57.19
±
3.98mj/m3。表明拉伸后，拉伸强度增加，韧性降低。
[0134]
图4结果表明，sp-2-elp-羧基结构域融合蛋白，拉伸前(初生纤维)的拉伸强度为142.32
±
7.99mpa，韧性为286.82
±
27.28mj/m3；拉伸后(后拉伸纤维)的拉伸强度为269.65
±
13.33mpa，韧性为69.34
±
9.61mj/m3。表明拉伸后，拉伸强度增加，韧性降低。
[0135]
实施例2：两种重组蛛丝蛋白体外混合纤维的制备
[0136]
将实施例1中的两种蛋白sp-1-elp-羧基结构域融合蛋白和sp-2-k-羧基结构域融合蛋白按重量比3:2的比例溶于200μl六氟异丙醇中(蛋白浓度150mg/l)，将混合后的蛋白溶液，离心取上清液用注射器挤入90％甲醇溶液(凝固浴)中，并用注射泵调节推进速度为5μl/min，用转筒收集器以线速度为0.6m/min的速度来收集纤维，得初生纤维。将收集到的纤维至于50％甲醇中浸泡至纤维变软，随后将纤维取出立即后拉伸至原长的200％左右，得到后拉伸纤维，制备的纤维进行力学性能检测(图5)
[0137]
图5结果表明，sp-1-elp-羧基结构域融合蛋白和sp-2-k-羧基结构域融合蛋白按3:2比例物理混合获得的纤维，拉伸前(初生纤维)的拉伸强度为188.18
±
5.03mpa，检测韧性为256.8
±
14.72mj/m3；拉伸后(后拉伸纤维)的拉伸强度为362.83
±
11.23mpa，检测韧性为174.76
±
9.79mj/m3。表明拉伸后，拉伸强度增加，韧性降低。
[0138]
还表明，两种融合蛋白物理混合后纤维相对单一融合蛋白的拉伸强度有所提高。
[0139]
实施例2a
[0140]
本实施例与实施例2的区别在于，sp-1-elp-羧基结构域融合蛋白和sp-2-k-羧基结构域融合蛋白按2:3混合，其拉伸后的拉伸强度为293.45
±
14.33mpa，韧性100.36
±
18.02mpa，模量5.91
±
0.99gpa。
[0141]
实施例3：两种重组蛛丝体内共表达蛋白纤维的制备
[0142]
将表达载体pet25b-ntd-sp-1-elp-ctd-ntd-sp-2-elp-ctd经过reca重组酶缺陷型工程化大肠杆菌blr(de3)表达后纯化，获得共表达蛋白，溶于98％甲酸中(蛋白浓度150mg/l)，将混合后的蛋白溶液，离心取上清液用注射器挤入甲醇溶液(凝固浴)中，并用注射泵调节推进速度为5μl/min，用转筒收集器以线速度为0.6m/min的速度来收集纤维，得初生纤维。将收集到的纤维至于50％甲醇中浸泡至纤维变软，随后将纤维取出立即后拉伸至
原长的100％左右，得到后拉伸纤维，制备的纤维进行力学性能检测(图6)。
[0143]
图6结果表明，氨基结构域-sp-1-elp-羧基结构域和氨基结构域-sp-2-k-羧基结构域的融合蛋白共表达后获得的纤维，拉伸前(初生纤维)的拉伸强度为232.41
±
5.89mpa，检测韧性为355.05
±
30.75mj/m3；拉伸后(后拉伸纤维)的拉伸强度为336.21
±
27.37mpa，检测韧性为86.93
±
6.11mj/m3。表明拉伸后，拉伸强度增加，韧性降低。
[0144]
实施例4：本发明制备的蛋白纤维之间性能对比
[0145]
本发明采用两种带羧基的12聚重组蛛丝蛋白纤维，通过调节序列和混合比例制备的纤维力学性能有所差异，其强度、韧性、模量性能对比见表1；
[0146]
表1各实施例的混合纤维拉伸前后的性能
[0147][0148]
混合后的纤维综合力学性能优于单一蛋白纤维。按天然蛛丝成分3:2比例混合形成的重组融合蛛丝纤维，其韧性可与天然蛛丝媲美，这为探索改善蛋白纤维力学性能提供了新思路。
[0149]
实施例5：体外混合蛋白纤维和体内共表达蛋白纤维细胞毒性实验
[0150]
3t3细胞(小鼠胚胎成纤维细胞，购自上海继和生物公司)在添加10％胎牛血清和1％双抗(青霉素和庆大霉素)的dmem中培养。采用3t3细胞检测两种蛋白纤维的细胞毒性。测试前，利用经过高温121℃高压灭菌30min的胶布将实施例2制备的sp-1-elp-羧基:sp-2-k-羧基两种蛋白按照3:2比例混合后制成蛋白纤维(图7(a)、(b))和实施例3制备的体内共表达蛋白纤维(图7(c)、(d))固定在12孔板底部，然后在uv柜中消毒12小时。将细胞按照50000个/ml注入12孔板中与纤维共培养24小时。取出培养液，用pbs缓冲液洗三次。加入1μl calcein-am染色活性活细胞和1μl propidium iodide(pi)染色凋亡细胞孵育10-20分钟。用激光共聚焦扫描显微镜(lscm)在发射波长为495nm的am和539nm的pi下观察两种蛋白纤维和对照细胞。通过实验可知，细胞均可在两种纤维上生长，表明纤维具有良好生物相容性。
[0151]
实施例6：体外混合蛋白纤维生物安全性实验
[0152]
将实施例2的sp-1-elp-羧基:sp-2-k-羧基两种蛋白按照3:2比例混合后制成蛋白
纤维。纺成纤维以每天每只20cm纤维投喂balb/c小鼠，每天投喂6只balb/c小鼠，并每天记录体重。对照组为6只不投喂纤维balb/c小鼠，每天记录体重。一周后，从小鼠眼眶中取≈1ml血液。通过在4℃冰箱内静止24小时获得血清。然后在4℃离心机中以3000转/分，离心15分钟，取上清液。用全自动生化分析仪检测肝功肾功指标。与肝肾功能相关的13项血液生化指标，包括丙氨酸氨基转移酶(alt)、天门冬氨酸氨基转移酶(ast)、alt/ast、总蛋白(tp)、白蛋白(alb)、球蛋白(glob)、白蛋白/球蛋白(a/g)、碱性磷酸酶(alp)、乳酸脱氢酶(ldh)、γ-谷氨酰转移酶(ggt)、尿酸(ua)、肌酐(crea)和二氧化碳(co2)，并计算每个实验组和对照组之间的显著差异，通过化验指标数据可知，实验组和对照组除碱性磷酸酶(alp)外，其他指标没有显著性差异(p》0.05)。alp单一指标的差异可能是个体差异所造成。这些结果表明，混合蛋白纤维具有良好的生物安全性。这为随后在生物医学和医疗设备中的应用提供了可能性。(图8)
[0153]
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。针对上述示例性实施方案所做的任何简单修改、等同变化与修饰，都应落入本发明的保护范围。

技术特征：
1.重组蛛丝蛋白，其包含至少两种重组蛋白：sp-1-k融合蛋白和sp-2-k融合蛋白；所述sp-1-k融合蛋白为下述a1)～a5)蛋白中任一种：a1)其氨基酸序列包括：m个直接串联的表现形式如[s1-elp1]所示的的氨基酸序列单元，其中，s1表示如seq id no:1所示的氨基酸序列，elp1为类弹性蛋白序列，[s1
–
elp1]表示s1序列和elp1序列串联；m表示[s1
–
elp1]序列的重复数，m为1-36之间的整数；a2)其氨基酸序列包括：在a1)中相邻的氨基酸序列单元[s1
–
elp1]之间连有连接序列，可选地，连接序列包括两个或四个氨基酸；a3)其氨基酸序列包括：a1)或a2)所示的氨基酸序列经过一个、两个或以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与a1)所示的蛋白质具有相同或相近性质的蛋白质；a4)其氨基酸序列包括：在a1)或a2)或a3)的n端引入天然蛛丝氨基结构域，和/或在a1)或a2)或a3)的c端引入天然蛛丝羧基结构域；a5)其氨基酸序列包括：在a1)或a2)或a3)或a4)的n端和/或c端引入组氨酸标签；所述sp-2-k融合蛋白为下述b1)～b5)中任一种：b1)其氨基酸序列包括：n个直接串联的表现形式如[s2-elp2]所示的的氨基酸序列单元，其中，s2表示如seq id no:2所示的氨基酸序列；elp2为类弹性蛋白序列；[s2
–
elp2]表示s2序列和elp2序列串联；n表示[s2
–
elp2]序列的重复数，n为1-36之间的整数；b2)其氨基酸序列包括：在b1)中相邻的氨基酸序列单元[s2
–
elp2]之间连有连接序列，可选地，连接序列包括两个或四个氨基酸；b3)其氨基酸序列包括：b1)或b2)所示的氨基酸序列经过一个、两个或以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与b1)所示的蛋白质具有相同或相近性质的蛋白质；b4)其氨基酸序列包括：在b1)或b2)或b3)的n端引入天然蛛丝氨基结构域，和/或在b1)或b2)或b3)的c端引入天然蛛丝羧基结构域；b5)其氨基酸序列包括：在b1)或b2)或b3)或b4)的n端和/或c端引入组氨酸标签。2.根据权利要求1所述的重组蛛丝蛋白，其特征在于，sp-1-k融合蛋白中：m为8-24之间的整数，可选地为8-16之间的整数，可选地为10-14之间的整数，可选地为12；elp1的氨基酸序列包含若干如seq id no:3：vpgxg所示的氨基酸序列串联而成的氨基酸序列，表现形式为(vpgxg)
i
，其中，x为赖氨酸或精氨酸或其它氨基酸，可选地x为赖氨酸；i为seq id no:3序列的重复数，i为1-40之间的整数，可选地地i为3-10之间的整数，可选地i为3-8之间的整数，可选地i为4-6之间的整数，可选地i为5；可选地，氨基酸序列单元的氨基酸序列[s1
–
elp1]如seq id no:4所示；可选地，a2)蛋白中，所述连接序列为同尾的不同酶切位点酶切后再连接后编码的两个或四个氨基酸。3.根据权利要求1或2所述的重组蛛丝蛋白，其特征在于，sp-2-k融合蛋白中：n为8-24之间的整数，可选地为8-16之间的整数，可选地为10-14之间的整数，可选地为12；elp2的氨基酸序列包含若干如seq id no:3：vpgxg所示的氨基酸序列串联而成的氨基酸序列，表现形式为(vpgxg)
j
，其中，x为赖氨酸或精氨酸或其它氨基酸，可选地x为赖氨酸；j为seq id no:3序列的重复数，j为1-40之间的整数，可选地j为3-10之间的整数，可选地j
为3-8之间的整数，可选地j为4-6之间的整数，可选地j为5；可选地，氨基酸序列单元的氨基酸序列[s2
–
elp2]如seq id no:5所示；可选地，b2)蛋白中，所述连接序列为同尾的不同酶切位点酶切后再连接后编码的两个或四个氨基酸。4.根据权利要求1至3任一所述的重组蛛丝蛋白，其特征在于，sp-1-k融合蛋白的a3)蛋白和/或sp-2-k融合蛋白的b3)蛋白中，天然蛛丝氨基结构域包含如seq id no:6所示的氨基酸序列；和/或，sp-1-k融合蛋白的a3)和/或sp-2-k融合蛋白的b3)中，天然蛛丝的羧基结构域包含如seq id no:7所示的氨基酸序列；可选地，sp-1-k融合蛋白的序列如seq id no:8或9所示；可选地，sp-2-k融合蛋白的序列如seq id no:10或11所示。5.根据权利要求1至4任一所述的重组蛛丝蛋白，其特征在于，所述sp-1-k融合蛋白和sp-2-k融合蛋白的重量比为(0.2～3)：1，可选地为(0.6～2)：1，可选地为(0.6～1.5)：1，可选地为1.5：1或2：3；和/或，所述sp-1-k融合蛋白和sp-2-k融合蛋白通过体外共混或微生物体内共表达获得的融合蛋白。6.一种重组蛛丝蛋白混合纤维，其包括权利要求1至5任一所述的重组蛛丝蛋白，其为人工纺丝；可选地，所述sp-1-k融合蛋白和sp-2-k融合蛋白的重量比为(0.2～3)：1，可选地为(0.6～2)：1，可选地为(0.6～1.5)：1，可选地为1.5：1或2：3。7.一种权利要求6所述的重组蛛丝蛋白混合纤维的制备方法，其特征在于，包括：将所述sp-1-k融合蛋白和sp-2-k融合蛋白溶于溶剂中制备蛋白溶液，利用注射泵将所述蛋白溶液挤出到凝固浴中固化成初生纤维。8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述溶剂为六氟异丙醇或甲酸；可选地，所述sp-1-k融合蛋白和sp-2-k融合蛋白按重量比(0.2～3)：1溶于六氟异丙醇中制备蛋白溶液，可选地，所述sp-1-k融合蛋白和sp-2-k融合蛋白在蛋白溶液中的质量分数为150～200mg/ml，可选地为150mg/ml，可选地，所述sp-1-k融合蛋白和sp-2-k融合蛋白分别通过重组大肠杆菌表达后纯化获得；可选地，所述sp-1-k融合蛋白和sp-2-k融合蛋白通过在重组大肠杆菌体内共表达后纯化获得，可选地，溶于甲酸溶液中；和/或，所述凝固浴为以体积比计80％-100％甲醇溶液，可选地为90％甲醇溶液；和/或，还包括对初生纤维的后拉伸：将初生纤维浸泡在拉伸浴中变软后，将其拉伸至原长的2～5倍，得后拉伸纤维。9.与权利要求1至5任一项所述重组蛛丝蛋白、或权利要求6所述的重组蛛丝蛋白混合纤维或权利要求7或8所述的制备方法制备的重组蛛丝蛋白混合纤维相关的生物材料，其特征在于，所述生物材料为c1)至c4)中的任一种：c1)编码权利要求1至5任一所述的重组蛛丝蛋白的sp-1-k融合蛋白和/或sp-2-k融合蛋白的核酸分子；c2)含有c1)所述核酸分子的表达盒；
c3)含有c1)所述核酸分子的重组载体，或含有c2)所述表达盒的重组载体；可选地，所述重组载体采用pet25b质粒或pbluescript ii ks质粒；c4)含有c1)所述核酸分子的重组微生物，或含有b2)所述表达盒的重组微生物，或含有c3)所述重组载体的重组微生物；可选地，所述重组微生物为重组大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、哺乳动物细胞、酵母细胞或昆虫细胞。10.一种权利要求1至5任一所述的重组蛛丝蛋白或权利要求6所述的重组蛛丝蛋白混合纤维或权利要求7或8所述的制备方法制备的重组蛛丝蛋白混合纤维或权利要求9所述的生物材料的用途，所述用途包括以下d1)至d5)中的任一种或几种：d1)航天航空领域、军事领域或制备生物材料；d2)纸产品；d3)薄膜；d4)纺织品；d5)涂层。

技术总结
本发明涉及一种重组蛛丝蛋白、重组蛛丝蛋白混合纤维及其制备方法和应用，涉及蛋白质领域，其包含至少两种重组蛋白：SP-1-K融合蛋白和SP-2-K融合蛋白，本发明从仿生角度出发，利用基因工程技术，设计了两种重组蛛丝融合蛋白，利用天然蜘蛛牵引丝部分序列和亲水性类弹性蛋白融合，为开发重组蛛丝蛋白纤维提供了新方法。方法。


技术研发人员：请求不公布姓名
受保护的技术使用者：北京新诚中科技术有限公司
技术研发日：2023.04.11
技术公布日：2023/7/18