微生物稀释液及其应用的制作方法

1.本发明涉及微生物技术领域，具体涉及微生物稀释液及其应用。


背景技术：

2.对土壤样品进行微生物活菌计数是一种常见的土壤微生物的研究方法，反映土壤中某一类微生物的生长情况。例如，可以通过选择性培养的方法对土壤中的烃氧化菌进行计数，从而研究由于地下油气富集导致的烃类微渗漏的情况。土壤样品微生物活菌计数的一个常见的方法是平板培养法，其原理是将一定量的土壤样品悬浮于定量的稀释液中，经过梯度稀释，选取合适的稀释度的稀释液，接种到装有固体培养基的平板上，经过一段时间的培养后，对形成的菌落数进行计数。现在对于土壤中微生物活菌计数常用的稀释液是灭菌的纯水，但是土壤本身及其中微生物来源十分广泛，组成也十分复杂，微生物在土壤中一般附着于土壤颗粒之上，简单的震荡有时候并不能让微生物从土壤颗粒上脱落到稀释液中。且由于土壤颗粒沉降很快，所以在使用纯水作为稀释液进行稀释和平板计数时，还存在测定值较真实值偏低、不够准确，检测结果的重复性不好等缺点。


技术实现要素：

3.有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供微生物稀释液及其应用，本发明提供的微生物稀释液能够有效分离土壤微生物且提高土壤中微生物检出率，本发明还提供了微生物稀释液在检测、分离或稀释土壤微生物中的应用。
4.本发明提供了稀释液，包括：0～0.1wt％琼脂和0～0.5wt％羧甲基纤维素。
5.所述琼脂与所述羧甲基纤维素相互配合使用，在上述浓度范围内，所述稀释液能够有效降低土壤颗粒的沉降速度，进一步增加了土壤颗粒表面附着的微生物分离至所述稀释液的数量，同时由于所述稀释液中还包括琼脂，进一步提供了微生物在震荡中的保护作用，提高其生存率，从而获得更好的实验效果。
6.进一步的，所述琼脂与所述羧甲基纤维素的质量比为1:5。实验表明，在此质量比范围下，所述琼脂与所述羧甲基纤维素之间配合紧密，能够更好地分离或稀释土壤中微生物，从而获得更好的实验效果。
7.在一些具体的实施例中，所述稀释液包括0.09wt％琼脂和0.45wt％羧甲基纤维素，余量为水。实验表明，在此浓度下，所述琼脂与所述羧甲基纤维素对土壤微生物的分离效果最佳。
8.本发明还提供了所述的稀释液在检测、分离或稀释土壤微生物中的应用。
9.本发明提供了土壤微生物计数方法，采用所述的稀释液浸泡土壤样品后，对稀释液中微生物进行计数检测。
10.进一步的，所述土壤样品经震荡混匀后浸泡至少30min。
11.在一些具体实施例中，所述浸泡时间为60min。实验表明，浸泡60min后，所述土壤微生物分离效果更佳，计数检测结果的均值更高，能检测到更多的烃氧化菌，且重复样的相
对标准偏差均值较低，说明其重复检测的重复性也较好，是优选的土壤浸泡时间。
12.进一步的，所述土壤样品浸泡后，经梯度稀释后再进行计数检测。
13.进一步的，所述计数检测方法为平板培养法。
14.进一步的，所述微生物为烃氧化菌。
15.本发明提供了制备所述稀释液的方法，包括：
16.对所用器具进行清洗；
17.对所述琼脂、羧甲基纤维素以及所述水进行称量；
18.对所述琼脂、羧甲基纤维素以及所述水进行溶解，得到溶解物；
19.对所述溶解物进行高温高压灭菌，得到稀释液；
20.对所述稀释液进行分装。
21.进一步的，所述对所用器具进行清洗包括:对所述器具进行超声清洗和/或纯化水冲洗。
22.进一步的，所述高温高压灭菌包括:对所述溶解物进行温度为105～121℃，压力为0.02～0.10mpa，时间为10～30分钟的灭菌。
23.在一些具体实施例中，对所述溶解物进行温度为121℃，压力为0.10mpa，时间为20分钟的灭菌。
24.本发明提供了稀释液，包括：0～0.1wt％琼脂和0～0.5wt％羧甲基纤维素，还提供了所述稀释液在检测、分离或稀释土壤微生物中的应用。本发明提供的稀释液能够有效分离土壤微生物且提高土壤中微生物检出率。本发明提供的采用所述稀释液的土壤微生物计数方法，操作简单，计数结果准确且重复性好。本发明提供的所述稀释液能够有效降低土壤颗粒的沉降速度，进一步增加了土壤颗粒表面附着的微生物分离至所述稀释液的数量，同时由于所述稀释液中还包括琼脂，进一步提供了微生物在震荡稀释中的保护主要，提高其生存率。本发明提供的土壤微生物计数方法，土壤样品经所述稀释液浸泡60min后，所述土壤微生物分离效果最佳，计数检测结果均值最高，能检测到更多的烃氧化菌，且重复样的相对标准偏差均值较低，说明其重复检测的重复性也较好，是优选的土壤浸泡时间。
附图说明
25.图1示实施例1中三种稀释液配方mv均值对比图；
26.图2示实施例1中三种稀释液配方重复样相对标准偏差均值对比图；
27.图3示实施例2中五种稀释液配方mv均值对比图；
28.图4示实施例2中五种稀释液配方重复样相对标准偏差均值对比图；
29.图5示实施例3中三种均质浸泡方式mv均值对比图；
30.图6示实施例3中三种均质浸泡方式重复样相对标准偏差均值对比图。
具体实施方式
31.本发明提供了微生物稀释液及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改
动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
32.本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：
33.实施例1
34.选取采自于新疆自治区乌苏市境内，准噶尔盆地南缘的15个农田土壤样品开展本实验。
35.设计对照组-稀释液采用纯水；实验组1-稀释液采用0.01％mpbs+0.5％tween20；实验组2-稀释液采用0.09％琼脂+0.45％羧甲基纤维素。除了稀释液之外，土壤样品中烃氧化菌的其他检测步骤参照u.s.patent 3880142(hitzman，1959)hitzman，d.0.，1959.prospecting for petroleum deposits(detecting hydrocarbonconsuming bacteria colonies by artificial hydrocarbon nutrient culturing).u.s.patent 3,880,142，assigned to phillips petroleum co.平板计数的结果直接记为该样品的微生物值(microbial value，mv值)。
36.上述三种稀释液配方进行检测时，每个样品重复检测三次，取三次的均值作为该样品的最终mv值，以评估不同稀释液的效果。将15个样品采用三种不同的稀释液获得的mv值均值结果制作柱状进行对比，结果如图1所示，图1为本发明实施例1三种不同的稀释液配方的检测结果均值对比图。
37.从图1看，实验组2即0.09％琼脂+0.45％羧甲基纤维素的稀释液所得到的mv值均值为300，最高；实验组1即0.01％mpbs+0.5％tween20的稀释液所得到的mv值均值为232，中等，对照组即纯水稀释液所得到的mv值均值为208，最低。
38.上述三种稀释液配方进行检测时，每个样品重复检测三次，计算相同样品重复检测三次所获得的mv值的相对标准偏差，并计算相同检测方法的15个样品mv值相对标准偏差的均值，以评估不同稀释液对于检测重复性的效果。将15个样品采用三种不同的稀释液获得的三次重复检测mv值的相对标准偏差均值结果制作柱状图进行对比，结果如图2所示，图2为本发明实施例1三种不同的稀释液配方重复检测的相对标准偏差均值结果对比图。
39.从图2看，实验组2即0.09％琼脂+0.45％羧甲基纤维素的稀释液所得到的重复样的相对标准偏差均值为7.47％，最低；实验组1即0.01％mpbs+0.5％tween20的稀释液所得到的重复样的相对标准偏差均值为9.00％，中等；对照组即纯水稀释液所得到的重复样的相对标准偏差均值为11.49％，最高。
40.综合mv值均值和重复样mv相对标准偏差均值的结果来看，实验组2即0.09％琼脂+0.45％羧甲基纤维素的稀释液所得到的mv值均值最高，能检测到更多的烃氧化菌，且重复样的相对标准偏差均值低，说明其重复检测的重复性也较好。
41.实施例2
42.选取采自于新疆自治区乌苏市境内，准噶尔盆地南缘的15个农田土壤样品开展本实验。
43.设计对照组-稀释液采用纯水；实验组1-稀释液采用0.03％琼脂+0.15％羧甲基纤维素；实验组2-稀释液采用0.05％琼脂+0.25％羧甲基纤维素；实验组3-稀释液采用0.07％琼脂+0.35％羧甲基纤维素；实验组4-稀释液采用0.09％琼脂+0.45％羧甲基纤维素。除了稀释液之外，土壤样品中烃氧化菌检测的其他步骤参照u.s.patent 3880142(hitzman，
1959)hitzman，d.0.，1959.prospecting for petroleum deposits(detecting hydrocarbonconsuming bacteria colonies by artificial hydrocarbon nutrient culturing).u.s.patent 3,880,142，assigned to phillips petroleum co.平板计数的结果直接记为该样品的微生物值(microbial value，mv值)。
44.上述三种稀释液配方进行检测时，每个样品重复检测三次，取三次的均值作为该样品的最终mv值，以评估不同稀释液的效果。将15个样品采用三种不同的稀释液获得的mv值结果计算均值，并制作柱状图进行对比，结果如图3所示，图3为本发明实施例2五种不同的稀释液配方的检测结果均值对比图。
45.从图3看，五种稀释液检测的15个样的mv值均值，实验组4即0.09％琼脂+0.45％羧甲基纤维素的稀释液所得到的mv值均值为131，最高；实验组2即0.05％琼脂+0.25％羧甲基纤维素的稀释液所得到的mv值均值为112，为第二高；实验组3即0.07％琼脂+0.35％羧甲基纤维素的稀释液所得到的mv值均值为100，为第三高；实验组2即0.03％琼脂+0.15％羧甲基纤维素的稀释液和对照组即纯水稀释液所得到的mv值均值分别为82和87，最低。
46.上述五种稀释液配方进行检测时，每个样品重复检测三次，计算相同样品重复检测三次所获得的mv值的相对标准偏差，并计算相同检测方法的15个样品mv值相对标准偏差的均值，以评估不同稀释液对于检测重复性的效果。将15个样品采用三种不同的稀释液获得的三次重复检测mv值的相对标准偏差均值结果制作柱状图进行对比，结果如图4所示，图4为本发明实施例2三种不同的稀释液配方重复检测的相对标准偏差均值结果对比图。
47.从图4看，琼脂浓度低于0.05％时，重复检测mv值的相对标准偏差均值相对高，如对照组为13.59％，实验组1为16.38％；琼脂浓度等于高于0.05％之后，重复检测mv值的相对标准偏差均值会显著降低，如实验组2为11.38％，实验组3为10.15％，实验组4为10.86％。
48.综合mv值均值和重复样mv相对标准偏差均值的结果来看，实验组4即0.09％琼脂+0.45％羧甲基纤维素的稀释液所得到的mv值均值最高，能检测到更多的烃氧化菌，且重复样的相对标准偏差均值低，说明其重复检测的重复性也较好，是优选的琼脂+羧甲基纤维素稀释液配方。
49.实施例3
50.选取采自于新疆自治区乌苏市境内，准噶尔盆地南缘的15个农田土壤样品开展本实验。
51.所有实验的稀释液均采用0.09％琼脂+0.45％羧甲基纤维素的配方。设计对照组-将土壤加入稀释液并震荡混匀后，立即进行后续梯度稀释等步骤；实验组1-将土壤加入稀释液并震荡混匀后，浸泡30分钟，再进行后续梯度稀释等步骤；实验组2-将土壤加入稀释液并震荡混匀后，浸泡60分钟，再进行后续梯度稀释等步骤。除了稀释液和土壤加入后的浸泡步骤之外，土壤样品中烃氧化菌检测的其他步骤参照u.s.patent 3880142(hitzman，1959)hitzman，d.0.，1959.prospecting for petroleum deposits(detecting hydrocarbonconsuming bacteria colonies by artificial hydrocarbon nutrient culturing).u.s.patent3,880,142，assigned to phillips petroleum co.平板计数的结果直接记为该样品的微生物值(microbial value，mv值)。
52.上述三种土壤浸泡步骤进行检测时，每个样品重复检测三次，取三次的均值作为
该样品的最终mv值，以评估不同土壤浸泡步骤的效果。将15个样品采用三种不同的土壤浸泡步骤获得的mv值均值结果制作柱状进行对比，结果如图5所示，图5为本发明实施例3三种不同的土壤浸泡步骤检测结果均值对比图。
53.从图5看，实验组2即土壤浸泡60分钟所得到的mv值均值为189，最高；实验组1即土壤浸泡30分钟所得到的mv值均值为173，中等；对照组即不进行浸泡的步骤所得到的mv值均值为161，最低。
54.上述三种土壤浸泡步骤进行检测时，每个样品重复检测三次，计算相同样品重复检测三次所获得的mv值的相对标准偏差，并计算相同检测方法的15个样品mv值相对标准偏差的均值，以评估不同土壤浸泡步骤对于检测重复性的效果。将15个样品采用三种不同的土壤浸泡步骤获得的三次重复检测mv值的相对标准偏差均值结果制作柱状图进行对比，结果如图6所示，图6为本发明实施例3三种不同的土壤浸泡步骤重复检测的相对标准偏差均值结果对比图。
55.从图6看，实验组1即土壤浸泡30分钟所得到的重复检测mv值相对标准偏差均值为8.73％，最低；实验组3即土壤浸泡60分钟所得到的重复检测mv值相对标准偏差均值为10.20％，中等；对照组即土壤不浸泡所得到的重复检测mv值相对标准偏差均值为10.73％，最高。
56.综合mv值均值和重复样mv相对标准偏差均值的结果来看，实验组2即土壤浸泡60分钟步骤所得到的mv值均值最高，能检测到更多的烃氧化菌，且重复样的相对标准偏差均值中等，说明其重复检测的重复性也较好，是优选的土壤浸泡时间。
57.以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.稀释液，其特征在于，包括：0～0.1wt％琼脂和0～0.5wt％羧甲基纤维素。2.根据权利要求1所述的稀释液，其特征在于，所述琼脂与所述羧甲基纤维素的质量比为1:5。3.根据权利要求2所述的稀释液，其特征在于，包括0.09wt％琼脂和0.45wt％羧甲基纤维素，余量为水。4.权利要求1～3任一项所述的稀释液在检测、分离或稀释土壤微生物中的应用。5.土壤微生物计数方法，其特征在于，采用权利要求1～3任一项所述的稀释液浸泡土壤样品后，对稀释液中微生物进行计数检测。6.根据权利要求5所述的计数方法，其特征在于，所述土壤样品经震荡混匀后浸泡至少30min。7.根据权利要求6所述的计数方法，其特征在于，所述浸泡时间为60min。8.根据权利要求5～7任一项所述的计数方法，其特征在于，所述土壤样品浸泡后，经梯度稀释后再进行计数检测。9.根据权利要求8所述的计数方法，其特征在于，所述计数检测方法为平板培养法。10.根据权利要求5～9任一项所述的计数方法，其特征在于，所述微生物为烃氧化菌。

技术总结
本发明提供了稀释液，包括：0～0.1wt％琼脂和0～0.5wt％羧甲基纤维素，还提供了所述稀释液在检测、分离或稀释土壤微生物中的应用。本发明提供的稀释液能够有效分离土壤微生物且提高土壤中微生物的检出率，还能够有效降低土壤颗粒和微生物的沉降速度。本发明提供的采用所述稀释液的土壤微生物计数方法，通过有效分离土壤微生物，浸泡60min后，计数检测结果均值最高，能检测到更多的微生物，操作简单，计数结果准确且重复性好。结果准确且重复性好。


技术研发人员：郝纯 吕黎 梅海
受保护的技术使用者：盎亿泰地质微生物技术（北京）有限公司
技术研发日：2023.04.11
技术公布日：2023/7/18