羧酸酯酶响应的诊疗一体化探针及其制备方法与应用

1.本发明属于生物医药领域，具体涉及羧酸酯酶响应的诊疗一体化探针及其制备方法与应用。


背景技术：

2.恶性肿瘤的发病率和死亡率持续升高，严重威胁人类生命健康，也给家庭和社会带来了沉重的经济负担。因此，亟需发展肿瘤早期检测手段和有效治疗新方法。基于分子影像的诊疗一体化探针同时整合分子影像模块和肿瘤治疗模块，不仅可同时满足诊断和治疗需求，而且能可视化药物的在体分布和释放过程，这种成像指导的治疗模式有利于治疗效果的实时监控及治疗方案的及时优化，有望为实现肿瘤的精准治疗及个性化治疗提供新的方案。羧酸酯酶在多种恶性肿瘤中过表达，是一种潜在的肿瘤标志物。因此，发展羧酸酯酶响应的诊疗一体化探针对于恶性肿瘤的早期诊断和有效治疗具有重大的意义。
3.近年来，基于近红外荧光探针的近红外荧光成像可有效避免来自生物体的背景荧光干扰，且组织穿透能力强、对活体光损伤小，被广泛用于恶性肿瘤早期诊断的研究。由于化学、光动力、声动力治疗手段都有其内在的不足，多手段联合治疗方可达到更好的肿瘤抑制效果。因此，发展兼具近红外荧光成像和多手段联合治疗的分子探针将为肿瘤的诊疗一体化提供新的技术手段。
4.然而，目前针对羧酸酯酶响应的近红外荧光探针以及其在肿瘤的诊疗一体化应用鲜有报道，是目前亟待解决的技术问题。


技术实现要素：

5.为解决上述现有技术中存在的技术问题，本发明提供一种羧酸酯酶响应的纳米诊疗一体化探针，该探针荧光波长位于近红外区，可实现肿瘤的近红外荧光成像诊断，并且兼具化学、光动力、声动力联合治疗性能，可显著杀伤肿瘤细胞。
6.为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案来实现：
7.第一方面，本发明提供一种羧酸酯酶响应的小分子诊疗探针，所述小分子诊疗探针的结构通式为：
[0008][0009]
式中，r为甲基、乙基、丙基中的任意一种。
[0010]
第二方面，本发明提供一种羧酸酯酶响应的小分子诊疗探针的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
[0011]
步骤1：在有机溶剂中加入近红外荧光染料、苯丁酸氮芥、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(edc)和4-二甲氨基吡啶(dmap)进行反应；
[0012]
步骤2：反应结束后，分离提纯，得到所述小分子诊疗探针。
[0013]
进一步地，在所述步骤1中，有机溶剂为四氢呋喃、n,n-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、氯仿、乙腈、甲醇中的至少一种；近红外荧光染料的结构式为：
[0014][0015]
式中，r为甲基、乙基、丙基中的任意一种。
[0016]
进一步地，在所述步骤1中，有机溶剂的体积为1～20ml；近红外荧光染料、苯丁酸氮芥、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶的摩尔比为1:(1～5):(1～5):(0.005～0.05)；反应时间为10～200min，反应温度为-10～50℃。
[0017]
第三方面，本发明提供一种羧酸酯酶响应的纳米诊疗一体化探针，所述纳米诊疗一体化探针是通过微乳液法使前述的小分子诊疗探针经过聚(乳酸-共-乙醇酸)-聚乙二醇(plga-peg)包封后所得。
[0018]
第四方面，本发明提供一种羧酸酯酶响应的纳米诊疗一体化探针的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
[0019]
步骤1：在有机溶剂中加入前述的小分子诊疗探针和聚(乳酸-共-乙醇酸)-聚乙二醇，超声处理，再加入聚乙烯醇的水溶液，继续反应；
[0020]
步骤2：反应结束后，离心处理，得到所述纳米诊疗一体化探针。
[0021]
进一步地，在所述步骤1中，有机溶剂为四氢呋喃、二氯甲烷、氯仿、环己烷中的至少一种。
[0022]
进一步地，在所述步骤1中，有机溶剂的体积为1～20ml；小分子诊疗探针和聚(乳酸-共-乙醇酸)-聚乙二醇的质量比为1:(1～15)；聚乙烯醇的水溶液是由质量为100～500mg的聚乙烯醇溶于5～50ml水中形成；超声时间为2～30min，反应时间为10～48h。
[0023]
第五方面，本发明提供前述的羧酸酯酶响应的纳米诊疗一体化探针在制备用于肿瘤诊断和/或肿瘤治疗的试剂中的应用。
[0024]
进一步地，所述肿瘤诊断为肿瘤近红外荧光成像诊断；所述肿瘤治疗为化学、光动力和声动力联合治疗。
[0025]
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
[0026]
1、本发明的分析波长位于近红外区，可有效避免生物体背景荧光干扰，组织穿透力强，对活体光损伤小。
[0027]
2、本发明制备的羧酸酯酶响应的纳米诊疗一体化探针可对肿瘤细胞高表达的羧酸酯酶表现出近红外荧光增强响应，可实现肿瘤的近红外荧光成像诊断。
[0028]
3、本发明制备的羧酸酯酶响应的纳米诊疗一体化探针具备化学、光动力、声动力联合治疗性能，可显著杀伤肿瘤细胞，抑制裸鼠肿瘤生长，是一种优良的诊疗试剂。
[0029]
4、本发明制备的羧酸酯酶响应的纳米诊疗一体化探针组成确定，具备良好的生物安全性，对裸鼠无明显毒性，满足临床用药基本需求。
[0030]
5、本发明方法具有操作简便、成本低、快速、灵敏的优点，易于推广和应用。
附图说明
[0031]
图1为实施例1合成的小分子诊疗探针hc的1h nmr图。
[0032]
图2为实施例1合成的hc的
13
c nmr图。
[0033]
图3为实施例1合成的hc的高分辨质谱图。
[0034]
图4为实施例1包封后的纳米诊疗一体化探针plga-peg@hc的透射电镜图。
[0035]
图5为实施例1包封后的纳米诊疗一体化探针plga-peg@hc的粒径分布图。
[0036]
图6为实施例2中纳米诊疗一体化探针plga-peg@hc对羧酸酯酶的吸收光谱响应图，其中曲线a为plga-peg@hc(0.2mg/ml)的吸收光谱，曲线b为plga-peg@hc(0.2mg/ml)与羧酸酯酶(100u/l)反应后的吸收光谱。
[0037]
图7为实施例2中纳米诊疗一体化探针plga-peg@hc对不同浓度羧酸酯酶的荧光响应图，图中羧酸酯酶的浓度从下到上依次为0，2，5，10，20，30，40，50，60，70，80，90和100u/l。
[0038]
图8为实施例3中纳米诊疗一体化探针plga-peg@hc对hela和hcerepic细胞的共聚焦成像图，图中第一列为白光通道，第二列为荧光通道。
[0039]
图9为实施例3中纳米诊疗一体化探针plga-peg@hc用于羧酸酯酶抑制剂磷酸三苯酯预处理hela细胞的共聚焦成像图，图中第一行为白光通道，第二行为荧光通道。
[0040]
图10为实施例4中肿瘤裸鼠尾静脉注射plga-peg@hc后不同时间节点的活体荧光成像，每幅图的左侧为对照组，右侧为实验组。
[0041]
图11为实施例5中dcfh-da在pbs(曲线a)和plga-peg@hc(0.2mg/ml)与羧酸酯酶(100u/l)反应液(曲线b)中经660nm激光辐照后在525nm处荧光强度的变化。
[0042]
图12为实施例5中dpbf在pbs(曲线a)和plga-peg@hc(0.2mg/ml)与羧酸酯酶
(100u/l)反应液(曲线b)中经超声刺激后在425nm处吸光度的变化。
[0043]
图13为实施例6中不同方式处理后的hela细胞(图a)和hcerepic细胞(图b)的存活率。
[0044]
图14为实施例7中不同治疗组裸鼠的肿瘤体积变化曲线。
[0045]
图15为实施例7中不同治疗组裸鼠在治疗14天后的肿瘤图片。
[0046]
图16为实施例8中不同治疗组裸鼠的体重变化曲线。
[0047]
图17为实施例8不同治疗组裸鼠在治疗14天后的主要血清生化指标。
[0048]
图18为实施例8不同治疗组裸鼠在治疗14天后各主要脏器的病理切片分析。
具体实施方式
[0049]
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
[0050]
实施例1、羧酸酯酶响应的纳米诊疗一体化探针plga-peg@hc的制备
[0051]
小分子诊疗探针hc按照下述路线合成：
[0052][0053]
具体步骤：将近红外荧光染料(410mg，1mmol)、苯丁酸氮芥(450mg，1.5mmol)、edc(230mg，1.2mmol)、dmap(1.8mg，0.01mmol)按比例在二氯甲烷(5ml)中混合均匀，并在室温下反应90min。混合液减压浓缩后经柱层析法纯化，得到小分子探针hc，为紫色粉末。
[0054]
小分子诊疗探针hc的包封：
[0055]
称取1mg hc和5mg plga-peg，分别溶于1ml二氯甲烷中，室温下，超声5min后，将二者混合，加二氯甲烷至4ml，继续超声5min。将聚乙烯醇(200mg)溶于10ml水中并加入上述有机相，室温搅拌24h，离心处理，上清液即为包封后的纳米诊疗一体化探针plga-peg@hc。
[0056]
小分子探针hc确证结构如下：
[0057]1h nmr和
13
c nmr图参见图1和2。1h nmr(400mhz,298k,cdcl3)：δ8.63(d,1h),7.49(m,2h),7.40(d,2h),7.27(s,1h),7.12(d,3h),7.08(s,1h),6.98(m,1h),6.77(d,1h),6.66(d,2h),4.57(t,2h),3.72(t,4h),3.64(t,4h),2.76(d,4h),2.65(m,4h),2.07(t,4h),1.98(t,2h),1.80(s,6h),1.08(t,3h).
13
c nmr(100mhz,298k,cdcl3):δ178.8,171.7,160.0,153.1,152.8,146.4,144.7,142.2,141.5,131.1,130.3,130.2,129.9,129.5,128.3,128.0,122.6,119.8,119.1,115.6,113.5,112.4,112.4,109.5,106.5,53.7,51.1,47.7,40.7,34.0,33.8,29.6,28.3,28.3,26.7,24.3,21.7,20.3,11.6.
[0058]
高分辨质谱：c
42h47
cl2n2o
3+
，m
+
；计算值：697.2958；测定值：697.2954(图3)。
[0059]
经透射电子显微镜(图4)和动态光散射(图5)证实小分子探针包封成功，所得纳米诊疗一体化探针plga-peg@hc为大小均匀的球形，粒径约100nm，分散性良好。
[0060]
实施例2、纳米诊疗一体化探针plga-peg@hc对羧酸酯酶的光学响应
[0061]
称取0.2g纳米诊疗一体化探针plga-peg@hc，溶于10ml超纯水，配成探针储备液(又称母液，浓度为20mg/ml)；将50μl探针母液加到一定量的磷酸盐缓冲溶液(pbs，0.01m)中，然后加入不同浓度的羧酸酯酶溶液，再用pbs定容至5ml。37℃反应10分钟后，测试吸收光谱和荧光发射光谱。荧光发射光谱测定时以670nm激发，激发和发射狭缝宽度分别为10nm和5nm。
[0062]
图6所示为纳米诊疗一体化探针plga-peg@hc对羧酸酯酶的吸收光谱响应图，图6中a为plga-peg@hc(0.2mg/ml)的吸收光谱，b为plga-peg@hc(0.2mg/ml)与羧酸酯酶(100u/l)反应后的吸收光谱。图7所示为纳米诊疗一体化探针plga-peg@hc对羧酸酯酶的荧光响应图，羧酸酯酶的浓度范围为0-100u/l。图7中羧酸酯酶的浓度从下到上依次为0，2，5，10，20，30，40，50，60，70，80，90和100u/l。以上实验表明纳米诊疗一体化探针plga-peg@hc对羧酸酯酶表现出显著的荧光增强响应。
[0063]
实施例3、纳米诊疗一体化探针plga-peg@hc用于肿瘤细胞成像
[0064]
(1)在37℃和5％ co2条件下，用含有10％(v/v)胎牛血清(fbs)、100u/ml青霉素、100μg/ml的链霉素的dmem培养基培养人宫颈癌细胞hela和人正常宫颈上皮细胞hcerepic。
[0065]
(2)将对数生长期的hela和hcerepic细胞接种于激光共聚焦皿中，培养24h后弃去培养液并用pbs(ph 7.4)清洗三次，再与本发明制备的plga-peg@hc(1mg/ml)共孵育30min后置于激光共聚焦显微镜成像。成像激发波长为635nm，发射波长的收集范围为650-750nm。
[0066]
图8所示为hela和hcerepic细胞的共聚焦成像图，可以看出，hela细胞显示明亮的红色荧光，而正常细胞hcerepic荧光微弱，说明plga-peg@hc可以对肿瘤细胞进行选择性荧光成像。
[0067]
图9所示为plga-peg@hc用于羧酸酯酶抑制剂磷酸三苯酯预孵育的hela细胞的共聚焦成像图。抑制剂组经磷酸三苯酯预处理的细胞荧光显著降低，说明plga-peg@hc在肿瘤细胞中的荧光增强响应是由于肿瘤细胞过表达的羧酸酯酶所引起的。
[0068]
实施例4、纳米诊疗一体化探针plga-peg@hc用于裸鼠肿瘤活体成像
[0069]
(1)本实验得到山西医科大学动物伦理与使用委员会的批准，实验动物为5周龄balb/c裸鼠，体重15g
±
1g/只，均在无菌环境下饲养。使用hela细胞建立肿瘤模型，将细胞以5
×
106个/ml的密度进行稀释，放置于冰上，用6％水合氯醛麻醉裸鼠后取200μl细胞悬液经皮下注射到裸鼠右侧腋下，每隔一天称量裸鼠体重并测量肿瘤大小，按公式v＝a*b2/2(a为长径，b为短径)计算肿瘤体积，待体积超过50mm3时进行成像实验。
[0070]
(2)取建模成功的裸鼠，尾静脉注射plga-peg@hc(最终浓度为10mg/ml)，在不同的时间节点对裸鼠进行荧光成像，观察荧光在体内的分布。成像时激发波长为670nm，发射波长为750nm。
[0071]
图10所示为不同时间节点裸鼠的活体荧光成像图。对照组(尾静脉注射pbs)始终没有荧光，而注射plga-peg@hc的裸鼠肿瘤在2h即发出荧光，8h时达到最大，且肿瘤部位的荧光远远高于其它部位。这表明plga-peg@hc可以通过被动靶向到达裸鼠肿瘤部位并特异性打开荧光信号，在肿瘤成像诊断中具有潜在的应用价值。
[0072]
实施例5、纳米诊疗一体化探针plga-peg@hc的体外光动力和声动力效果
[0073]
为评估plga-peg@hc的光动力和声动力效果，利用商业化活性氧探针2’,7
’‑
二氯
二氢荧光素二乙酸酯(dcfh-da)和1,3-二苯基异苯并吡喃(dpbf)分别对体系在激光辐照和超声刺激下产生活性氧的性能进行评估。dcfh-da在525nm处的荧光强度与活性氧浓度正相关，dpbf在425nm处的吸光度与单线态氧浓度负相关。将plga-peg@hc(0.2mg/ml)与羧酸酯酶(100u/l)在37℃摇床中反应20min，向反应体系中加入活化好的dcfh-da(5nm)，然后用660nm激光照射反应液一定时间后测试荧光光谱以评估其光动力性能，荧光激发波长为490nm。向反应体系中加入dpbf(20μg/ml)，超声(1w/cm2)不同时间后，记录425nm处的吸光度以评估其声动力性能。
[0074]
图11所示为不同体系(a为dcfh-da，b为dcfh-da与plga-peg@hc及羧酸酯酶的反应液)在525nm处的荧光随激光辐照时间的变化图。可以看出，随着激光辐照时间的延长，plga-peg@hc与羧酸酯酶反应体系中dcfh-da在525nm处的荧光逐渐增强，而激光辐照几乎不影响dcfh-da本身的荧光，这表明plga-peg@hc与羧酸酯酶反应体系在660nm激光照射下可产生活性氧，具备光动力治疗潜质。
[0075]
图12所示为不同体系(a为dpbf，b为dpbf与plga-peg@hc及羧酸酯酶的反应液)在425nm处的吸光度随超声时间的变化图。可以看出，随着超声时间的延长，plga-peg@hc与羧酸酯酶反应体系中dpbf在425nm处的吸光度逐渐下降，而dpbf本身的吸光度几乎不受超声影响，这表明plga-peg@hc与羧酸酯酶反应体系在超声刺激下具有产生单线态氧的能力，可用于声动力治疗。
[0076]
实施例6、纳米诊疗一体化探针plga-peg@hc用于肿瘤细胞选择性杀伤
[0077]
通过mtt法评估plga-peg@hc对不同细胞的杀伤性能。将对数生长期的hela和hcerepic细胞接种于96孔板，贴壁培养24h后加入不同浓度的plga-peg@hc并孵育24h，弃去培养液，用pbs清洗3次后激光组用660nm激光(0.25w/cm2)照射10min，超声组间断性超声(0.75w/cm2)治疗5min(即超声15s，间歇15s，共5min)，复合组为激光和超声叠加处理，对照组置于黑暗环境。细胞用pbs清洗3次后，向每孔加入100μl mtt溶液(0.5mg/ml)，继续孵育4h后弃去mtt，pbs清洗后加入dmso 150μl。最后利用酶标仪测定490nm处的吸光度，计算细胞存活率。
[0078]
图13所示为不同方式处理后hela(图a)和hcerepic(图b)细胞的存活率。可以看出，随着plga-peg@hc浓度的增大，hela细胞的存活率逐渐下降，当浓度为2.0mg/ml时，hela细胞的存活率仅为66％，而hcerepic细胞的存活率仍高达86％。这是由于hela细胞内过表达的羧酸酯酶引发探针水解，释放出的化疗药物苯丁酸氮芥对细胞具有杀伤作用。另外，在660nm激光或超声刺激单独存在下，plga-peg@hc孵育的hela细胞的存活率都进一步降低，提示plga-peg@hc在细胞层面具有声动力和光动力杀伤能力；超声和激光同时存在时，hela细胞的存活率最低，仅剩18％，而相同条件下hcerepic细胞的存活率仍然在60％以上。这些结果表明探针plga-peg@hc可通过化疗、光动力和声动力治疗三种方式联合杀伤肿瘤细胞，而对正常细胞具有较低的毒副作用。
[0079]
实施例7、纳米诊疗一体化探针plga-peg@hc用于裸鼠抗肿瘤治疗
[0080]
肿瘤模型裸鼠的建立同实施例4，待肿瘤体积超过100mm3时开始治疗。将裸鼠随机分为7组(n＝3)并采取对应的治疗方式。分组情况如下：pbs组、pbs+激光(l)+超声(us)组、hc+l+us组、plga-peg@hc组、plga-peg@hc+us组、plga-peg@hc+l组和plga-peg@hc+l+us组。治疗时探针通过尾静脉注射至裸鼠体内(100μl，其中plga-peg@hc浓度为10mg/ml、hc浓度
为13.95μg/ml)，注射8h后激光组用660nm激光(0.75w/cm2)照射肿瘤部位10min、超声组用超声仪(1.5w/cm2)超声处理5min，复合组为激光和超声叠加处理。每两天治疗一次，共3次。治疗期间，每隔一天测量肿瘤长、短径，按公式v＝a*b2/2(a为长径，b为短径)计算肿瘤体积。治疗结束后，解剖肿瘤并拍照。
[0081]
图14所示为不同组裸鼠的肿瘤体积变化曲线，图15为不同组裸鼠在治疗14天后的肿瘤图片。这些结果表明plga-peg@hc可联合化疗、光动力和声动力治疗三种方式发挥抗肿瘤作用。
[0082]
实施例8、纳米诊疗一体化探针plga-peg@hc的生物安全性
[0083]
实施例7中14天治疗周期内每隔一天记录裸鼠的体重。14天治疗周期结束后，麻醉裸鼠，眼眶采血，将采集的血样离心(3000rpm/min)10min，取上层血清用生化分析仪分别检测肝功能指标丙氨酸转氨酶(alt)和天冬氨酸转氨酶(ast)以及肾功能指标尿素氮(bun)和肌酐(cre)；完成上述操作后将裸鼠处死，取出心、肝、脾、肺、肾，用4％的多聚甲醛固定，石蜡包埋切片后用苏木精和曙红进行染色，在荧光显微镜下观察。
[0084]
图16所示为不同组裸鼠的体重变化曲线，各组裸鼠体重均略有增长；图17所示为不同组裸鼠在治疗14天后的主要血清生化指标，可以看出，各治疗组裸鼠的肝功和肾功指标与对照组相比无显著性差异；图18所示为不同组裸鼠在治疗14天后各主要脏器的病理切片分析，结果显示各主要脏器无明显异常，这些结果均表明纳米诊疗一体化探针plga-peg@hc具有良好的生物安全性，基于该探针的肿瘤治疗无明显副作用。
[0085]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

技术特征：
聚乙二醇，超声处理，再加入聚乙烯醇的水溶液，继续反应；步骤2：反应结束后，离心处理，得到所述纳米诊疗一体化探针。7.根据权利要求6所述的一种羧酸酯酶响应的纳米诊疗一体化探针的制备方法，其特征在于，在所述步骤1中，有机溶剂为四氢呋喃、二氯甲烷、氯仿、环己烷中的至少一种。8.根据权利要求6所述的一种羧酸酯酶响应的纳米诊疗一体化探针的制备方法，其特征在于，在所述步骤1中，有机溶剂的体积为1～20ml；小分子诊疗探针和聚(乳酸-共-乙醇酸)-聚乙二醇的质量比为1:(1～15)；聚乙烯醇的水溶液是由质量为100～500mg的聚乙烯醇溶于5～50ml水中形成；超声时间为2～30min，反应时间为10～48h。9.一种权利要求5所述的羧酸酯酶响应的纳米诊疗一体化探针在制备用于肿瘤诊断和/或肿瘤治疗的试剂中的应用。10.根据权利要求9所述的一种羧酸酯酶响应的纳米诊疗一体化探针的应用，其特征在于，所述肿瘤诊断为肿瘤近红外荧光成像诊断；所述肿瘤治疗为化学、光动力和声动力联合治疗。

技术总结
本发明属于生物医药领域，具体涉及羧酸酯酶响应的诊疗一体化探针及其制备方法与应用。本发明公开了一种如下述结构通式所示的小分子诊疗探针，该小分子诊疗探针是在有机溶剂中加入近红外荧光染料、苯丁酸氮芥、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)发生反应所得。本发明利用聚(乳酸-共-乙醇酸)-聚乙二醇(PLGA-PEG)对上述小分子诊疗探针包封后得到纳米诊疗一体化探针，所得纳米诊疗一体化探针的荧光波长位于近红外区，可实现肿瘤的近红外荧光成像诊断，并且兼具化学、光动力、声动力联合治疗性能，可显著杀伤肿瘤细胞。可显著杀伤肿瘤细胞。可显著杀伤肿瘤细胞。


技术研发人员：李丽红 李娇娇 张琪 任国栋 刁海鹏 刘文 王浩江 王斌
受保护的技术使用者：山西医科大学
技术研发日：2023.04.06
技术公布日：2023/7/18