一种农用聚谷氨酸发酵液及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于微生物技术领域，涉及一种农用聚谷氨酸发酵液及其制备方法和应用。


背景技术：

2.γ-聚谷氨酸（简称γ-pga）是一种生物高分子材料。由于其具有水溶性好、可生物降解、可食用以及对人类和环境无毒等优点，因此在环境、医药、食品和化妆品等领域具有广泛的应用前景。
3.聚谷氨酸制备方法较多，包括化学合成法、提取法、微生物合成法等。微生物合成法因其生产过程容易控制、发酵产量稳定、提取率高、便于实现大规模生产等显著优势，已成为目前γ-聚谷氨酸生产的主要方法和途经。
4.cn107760732a公开了一种农业级γ-聚谷氨酸的生产方法，包括以下步骤：菌种活化：将地衣芽孢杆菌的原始菌株接种在斜面培养基上培养活化；种子液的制备；将活化后的斜面种子接种于种子培养基中，得到γ-聚谷氨酸的种子液；将种子液接种于发酵培养基中发酵；发酵结束后离心去菌体，醇沉析出聚谷氨酸，干燥，制备出黄色干粉状农业级聚谷氨酸。
5.cn110042129a公开了一种农业用γ-聚谷氨酸的制备方法，包括以下步骤：(1)微生物发酵：转接菌种至发酵罐中，维持发酵温度35-45℃，通气量1.0-2.0vvm，搅拌速度150-250rpm，发酵ph6.5-7.0，发酵48-60h，得到发酵液；(2)膜过滤：将所得发酵液添加2-4倍体积水，混合均匀后过滤，得到浓缩液；(3)喷雾干燥：将所得浓缩液加热，进行喷雾干燥。
6.但目前由于聚谷氨酸的生产成本较高，导致其价格相对较高，限制了其在农业方面的应用。如何降低聚谷氨酸的生产成本，使其更好的应用于农业生产，具有重要的意义。


技术实现要素：

7.为了解决上述技术问题，本发明提供了一种农用聚谷氨酸发酵液及其制备方法和应用，本发明以浓缩糖蜜发酵液为主要原料，利用纳豆芽孢杆菌fk001和地衣芽孢杆菌fk002进行发酵，将浓缩糖蜜发酵液中的游离谷氨酸聚合成低分子量聚谷氨酸，得到的发酵液中聚谷氨酸的含量高，不需提纯，可直接使用，降低了生产成本，满足了农业市场需求。
8.为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种农用聚谷氨酸发酵液的制备方法，包括以下步骤：（1）混合种子液制备：将纳豆芽孢杆菌种子液和地衣芽孢杆菌种子液混合，得到混合种子液；（2）发酵：将混合种子液接种到发酵培养基中发酵培养，得到所述农用聚谷氨酸发酵液。
9.优选地，步骤（1）中所述纳豆芽孢杆菌种子液中的纳豆芽孢杆菌为纳豆芽孢杆菌fk001；所述地衣芽孢杆菌种子液中的地衣芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌fk002。
10.优选地，步骤（1）中所述纳豆芽孢杆菌种子液和地衣芽孢杆菌种子液的浓度均为1
×
107cfu/ml。
11.优选地，步骤（1）中所述纳豆芽孢杆菌种子液和地衣芽孢杆菌种子液的体积比为3-8:1；进一步优选为4-7:1；最优选为5:1。
12.优选地，步骤（2）中所述混合种子液的接种量为8-25%。
13.优选地，步骤（2）中所述发酵培养基为：糖蜜10-30g/l、浓缩糖蜜发酵液100-250g/l、谷氨酸15-25g/l、玉米浆25-50g/l和氯化钙1-5g/l，ph6.0-7.0。
14.进一步优选地，步骤（2）中所述发酵培养基为：糖蜜12-25g/l、浓缩糖蜜发酵液120-240g/l、谷氨酸18-22g/l、玉米浆30-45g/l和氯化钙1.5-4.5g/l，ph6.0-7.0。
15.最优选地，步骤（2）中所述发酵培养基为：糖蜜20g/l、浓缩糖蜜发酵液200g/l、谷氨酸20g/l、玉米浆35g/l和氯化钙2.5g/l，ph6.0-7.0。
16.优选地，步骤（2）中所述发酵培养的条件为：温度32-40℃，转速160-280rpm，培养时间20-36h。
17.进一步优选地，步骤（2）中所述发酵培养的条件为：温度34-38℃，转速170-200rpm，培养时间25-30h。
18.最优选地，步骤（2）中所述发酵培养的条件为：温度35℃，转速180rpm，培养时间25h。
19.本发明以纳豆芽孢杆菌fk001和地衣芽孢杆菌fk002为发酵菌种，可以将浓缩蜜糖发酵液中的游离谷氨酸聚合成低分子量的聚谷氨酸，制备的发酵液中聚谷氨酸的含量高（35-51.4g/l），不需要提纯，可直接使用，满足农业生产需求。
20.所述的浓缩蜜糖发酵液为味丹浓缩糖蜜发酵液，其为生物发酵制备谷氨酸的副产物，含谷氨酸及未被菌种消化利用的糖源；具体成分为：游离谷氨酸含量为25g/l，氮钾≥70g/l（40-0-30），有机质≥300g/l。本发明采用浓缩糖蜜发酵液替代部分谷氨酸及碳源糖蜜，可降低生产成本。
21.本发明还提供了上述制备方法制备得到的农用聚谷氨酸发酵液。
22.本发明还提供了上述制备方法制备得到的农用聚谷氨酸发酵液在制备液体肥料中的应用。
23.本发明的有益效果为：（1）本发明的浓缩蜜糖发酵液为味丹浓缩糖蜜发酵液，其为生物发酵制备谷氨酸的副产物，含谷氨酸及未被菌种消化利用的糖源；具体成分为：游离谷氨酸含量为25g/l，氮钾≥70g/l（40-0-30），有机质≥300g/l。本发明采用浓缩糖蜜发酵液替代部分谷氨酸及碳源糖蜜，降低了生产成本；（2）本发明首次将纳豆芽孢杆菌fk001和地衣芽孢杆菌fk002应用于聚谷氨酸的生产中，利用纳豆芽孢杆菌fk001和地衣芽孢杆菌fk002的共同作用，可以将浓缩蜜糖发酵液中的游离谷氨酸聚合成低分子量的聚谷氨酸，制备的发酵液中聚谷氨酸的含量高（35-51.4g/l），不需要提纯，可直接使用，生产成本低。
具体实施方式
24.除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的
普通技术人员通常理解的相同意义。
25.以下实施例如无特殊说明，则不含有除不可避免的杂质以外的其它未明确指出的组分。各实施例中所用的原料均为市售产品。其中，浓缩蜜糖发酵液为味丹浓缩糖蜜发酵液，具体成分为：游离谷氨酸含量为25g/l，氮钾≥70g/l（40-0-30），有机质≥300g/l。所述地衣芽孢杆菌fk002和纳豆芽孢杆菌fk001均来源于烟台泓源生物肥料有限公司。
26.实施例1 纳豆芽孢杆菌fk001种子液的制备（1）菌种活化：将斜面活冻干管纳豆芽孢杆菌接种到营养琼脂培平板上，38
±
2℃培养箱中培养12-16h。
27.（2）摇瓶种子液制备：挑取1-2环平板培养的菌落，于摇瓶培养基中，38
±
2℃恒温摇床培养12-16h，即得摇瓶种子液；液体摇瓶培养基的配方为：糖蜜20-50g/l、谷氨酸50-100g/l、蛋白胨10-50g/l、硫酸铵0.1-1g/l和氯化钙0.1-1g/l，蒸馏水补足至1000ml。
28.（3）种子液制备：以接种量3-10%将摇瓶种子液接种到一级种子培养基，温度32-40℃，转速80-200rpm，培养6-12小时，即得纳豆芽孢杆菌fk001种子液；一级种子培养基的配方为：糖蜜5-30g/l，浓缩糖蜜发酵液50-150g/l，谷氨酸10-20g/l，玉米浆10-20g/l，氯化钙0.1-1g/l，ph6.0-7.0。
29.实施例2 地衣芽孢杆菌fk002种子液的制备（1）菌种活化：将斜面活冻干管地衣芽孢杆菌接种到营养琼脂培平板上，38
±
2℃培养箱中培养12-16h。
30.（2）摇瓶种子液制备：挑取1-2环平板培养的菌落，于摇瓶培养基中，38
±
2℃恒温摇床培养12-16h，即得摇瓶种子液；液体摇瓶培养基的配方为；糖蜜20-50g/l、谷氨酸50-100g/l、蛋白胨10-50g/l、硫酸铵0.1-1g/l和氯化钙0.1-1g/l，蒸馏水补足至1000ml。
31.（3）种子液制备：以接种量3-10%将摇瓶种子液接种到一级种子培养基，温度32-40℃，转速80-200rpm，培养6-12小时，即得地衣芽孢杆菌fk002种子液；一级种子培养基的配方为：糖蜜5-30g/l，浓缩糖蜜发酵液50-150g/l，谷氨酸10-20g/l，玉米浆10-20g/l，氯化钙0.1-1g/l，ph6.0-7.0。
32.实施例3 农用聚谷氨酸发酵液的制备方法（1）混合种子液制备：按体积比3:1，将纳豆芽孢杆菌fk001种子液（1
×
107cfu/ml）和地衣芽孢杆菌fk002种子液（1
×
107cfu/ml）混合，得到混合种子液；（2）发酵：按25%的接种量，将混合种子液接种到发酵培养基中发酵培养，得到所述农用聚谷氨酸发酵液；发酵培养基为：糖蜜10g/l、浓缩糖蜜发酵液250g/l、谷氨酸15g/l、玉米浆25g/l和氯化钙1g/l，ph6.0-7.0；发酵培养的条件为：温度32℃，转速160rpm，培养时间36h。
33.经检测本实施例得到的农用聚谷氨酸发酵液中γ-聚谷氨酸的含量为40.8g/l。
34.实施例4 农用聚谷氨酸发酵液的制备方法（1）混合种子液制备：按体积比8:1，将纳豆芽孢杆菌fk001种子液（1
×
107cfu/ml）和地衣芽孢杆菌fk002种子液（1
×
107cfu/ml）混合，得到混合种子液；
（2）发酵：按8%的接种量，将混合种子液接种到发酵培养基中发酵培养，得到所述农用聚谷氨酸发酵液；发酵培养基为：糖蜜30g/l、浓缩糖蜜发酵液100g/l、谷氨酸25g/l、玉米浆50g/l和氯化钙5g/l，ph6.0-7.0；发酵培养的条件为：温度40℃，转速280rpm，培养时间20h。
35.经检测本实施例得到的农用聚谷氨酸发酵液中γ-聚谷氨酸的含量为35.0g/l。
36.实施例5 农用聚谷氨酸发酵液的制备方法（1）混合种子液制备：按体积比7:1，将纳豆芽孢杆菌fk001种子液（1
×
107cfu/ml）和地衣芽孢杆菌fk002种子液（1
×
107cfu/ml）混合，得到混合种子液；（2）发酵：按10%的接种量，将混合种子液接种到发酵培养基中发酵培养，得到所述农用聚谷氨酸发酵液；发酵培养基为：糖蜜12g/l、浓缩糖蜜发酵液240g/l、谷氨酸18g/l、玉米浆30g/l和氯化钙1.5g/l，ph6.0-7.0；发酵培养的条件为：温度34℃，转速170rpm，培养时间30h。
37.经检测本实施例得到的农用聚谷氨酸发酵液中γ-聚谷氨酸的含量为44.9g/l。
38.实施例6 农用聚谷氨酸发酵液的制备方法（1）混合种子液制备：按体积比4:1，将纳豆芽孢杆菌fk001种子液（1
×
107cfu/ml）和地衣芽孢杆菌fk002种子液（1
×
107cfu/ml）混合，得到混合种子液；（2）发酵：按20%的接种量，将混合种子液接种到发酵培养基中发酵培养，得到所述农用聚谷氨酸发酵液；发酵培养基为：糖蜜25g/l、浓缩糖蜜发酵液120g/l、谷氨酸22g/l、玉米浆45g/l和氯化钙4.5g/l，ph6.0-7.0；发酵培养的条件为：温度38℃，转速200rpm，培养时间25h。
39.经检测本实施例得到的农用聚谷氨酸发酵液中γ-聚谷氨酸的含量为42.1g/l。
40.实施例7 农用聚谷氨酸发酵液的制备方法（1）混合种子液制备：按体积比5:1，将纳豆芽孢杆菌fk001种子液（1
×
107cfu/ml）和地衣芽孢杆菌fk002种子液（1
×
107cfu/ml）混合，得到混合种子液；（2）发酵：按15%的接种量，将混合种子液接种到发酵培养基中发酵培养，得到所述农用聚谷氨酸发酵液；发酵培养基为：糖蜜20g/l、浓缩糖蜜发酵液200g/l、谷氨酸20g/l、玉米浆35g/l和氯化钙2.5g/l，ph6.0-7.0；发酵培养的条件为：温度35℃，转速180rpm，培养时间25h。
41.经检测本实施例得到的农用聚谷氨酸发酵液中γ-聚谷氨酸的含量为51.4g/l。
42.由上述实施例3-7可知，本发明以味丹浓缩糖蜜发酵液为主要原料，利用纳豆芽孢杆菌fk001和地衣芽孢杆菌fk002为发酵菌种，制备得到的发酵液中γ-聚谷氨酸的含量高（35-51.4g/l），不需要提纯，可直接使用，生产成本低，满足了农业市场需求。
43.同时，为了进一步证明本发明的技术效果及新创性，进行了如下实验以验证菌株间的协同作用。
44.对比例1
本对比例与实施例4的区别仅在于：混合种子液制备过程中用等量的纳豆芽孢杆菌fk001种子液代替地衣芽孢杆菌fk002种子液，最终的混合种子液仅为纳豆芽孢杆菌fk001种子液。
45.经检测本对比例得到的农用聚谷氨酸发酵液中γ-聚谷氨酸的含量为19.3g/l。
46.对比例2本对比例与实施例4的区别仅在于：混合种子液制备过程中用等量的地衣芽孢杆菌fk002种子液代替纳豆芽孢杆菌fk001种子液；最终的混合种子液仅为地衣芽孢杆菌fk002种子液。
47.经检测本对比例得到的农用聚谷氨酸发酵液中γ-聚谷氨酸的含量为12.7g/l。
48.对比例3本对比例与实施例4的区别仅在于：混合种子液制备过程中纳豆芽孢杆菌fk001种子液和地衣芽孢杆菌fk002种子液的体积比为1:1。
49.经检测本对比例得到的农用聚谷氨酸发酵液中γ-聚谷氨酸的含量为17.2g/l。
50.由上可知，相比单一的菌株发酵，本发明两种菌株的复配可以显著提高发酵液中γ-聚谷氨酸的含量，产生了协同增效的作用。
51.应用效果评价选取32孔穴盘进行黄瓜育苗，待黄瓜出苗后进行间苗处理，挑选大小一致，生长良好的幼苗移栽，每盘32棵。
52.将实施例3-7与对比例1-3得到的农用聚谷氨酸发酵液，分别稀释1000倍数，设置清水为对照。每盘冲施500ml，每隔3天处理一次，共处理三次。试验结束后，测量株高、根长、spad值和叶面积，结果表1所示。
53.表1 农用聚谷氨酸发酵液对黄瓜幼苗的影响由上可知，本发明发酵制备得到的聚谷氨酸发酵液经稀释后，可直接用作冲施肥，具有促进黄瓜幼苗的长高、根系发育、叶片伸展以及增加叶绿素含量的作用。
54.以上是结合具体实施例对本发明进一步的描述，但这些实施例仅仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

技术特征：
1.一种农用聚谷氨酸发酵液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）混合种子液制备：将纳豆芽孢杆菌种子液和地衣芽孢杆菌种子液混合，得到混合种子液；（2）发酵：将混合种子液接种到发酵培养基中发酵培养，得到所述农用聚谷氨酸发酵液；步骤（1）中所述纳豆芽孢杆菌种子液中的纳豆芽孢杆菌为纳豆芽孢杆菌fk001；所述地衣芽孢杆菌种子液中的地衣芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌fk002。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述纳豆芽孢杆菌种子液和地衣芽孢杆菌种子液的体积比为3-8:1。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述发酵培养基为：糖蜜10-30g/l、浓缩糖蜜发酵液100-250g/l、谷氨酸15-25g/l、玉米浆25-50g/l和氯化钙1-5g/l，ph6.0-7.0。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述发酵培养基为：糖蜜12-25g/l、浓缩糖蜜发酵液120-240g/l、谷氨酸18-22g/l、玉米浆30-45g/l和氯化钙1.5-4.5g/l，ph6.0-7.0。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述混合种子液的接种量为8-25%。6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述发酵培养的条件为：温度32-40℃，转速160-280rpm，培养时间20-36h。7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述发酵培养的条件为：温度34-38℃，转速170-200rpm，培养时间25-30h。8.权利要求1-7任一项所述的制备方法制备得到的农用聚谷氨酸发酵液。9.权利要求1-7任一项所述的制备方法制备得到的农用聚谷氨酸发酵液在制备液体肥料中的应用。

技术总结
本发明属于微生物技术领域，其公开了一种农用聚谷氨酸发酵液及其制备方法和应用，所述制备方法，包括以下步骤：（1）混合种子液制备：将纳豆芽孢杆菌种子液和地衣芽孢杆菌种子液混合，得到混合种子液；（2）发酵：将混合种子液接种到发酵培养基中发酵培养，得到农用聚谷氨酸发酵液。本发明以纳豆芽孢杆菌FK001和地衣芽孢杆菌FK002为发酵菌种，可以将浓缩蜜糖发酵液中的游离谷氨酸聚合成低分子量的聚谷氨酸，制备的发酵液中聚谷氨酸的含量高，不需要提纯，可直接使用，生产成本低。生产成本低。


技术研发人员：吴春峰 许孝瑞 孙明宾 王雪颖 王国峰 孙延松 王萌
受保护的技术使用者：烟台泓源生物肥料有限公司
技术研发日：2023.06.14
技术公布日：2023/7/18