一种可注射型透明质酸钠包裹聚乳酸微球的制备方法与流程

1.本发明属于注射类面部填充剂技术领域，涉及一种可注射型透明质酸钠包裹聚乳酸微球的制备方法。


背景技术：

2.面部衰老是一个复杂的过程，受多重因素影响，包括基因缺陷、光照、外部环境、炎症反应及疾病等等。面部衰老的特征主要包括软组织缺失、胶原蛋白流失、皮肤水合度下降等，进而造成脸部细纹、皱纹的产生。目前，应用比较广泛的是交联透明质酸钠填充针，通过物理填充支撑面部凹陷的部位，但透明质酸钠在人体内会被吸收，即使交联过的透明质酸钠凝胶的降解时间一般也不超过1年。为了进一步延长填充材料的维持时间，可降解的聚合物微球材料进入了大众的视野。
3.聚乳酸(polylactic acid，pla)是美国食品药品监督管理局(fda)批准的可在人体内使用的一种可降解高分子材料。聚乳酸及其共聚物由于其良好的生物相容性和生物降解性，已广泛应用在可吸收医疗器械、药物控释、组织工程等领域。植入后的聚乳酸在体内首先降解为乳酸，参与糖类代谢过程中的三羧酸循环，后被体内的酶代谢为终产物二氧化碳和水，排除体外。聚乳酸材料经皮下注射后，可以刺激皮下细胞分泌大量的以胶原为主的细胞外基质，从而促进胶原蛋白的产生。随着聚乳酸的降解，填充部位最终可被新生的自体组织代替，从而达到改善肤质、抚平皱纹、面部塑形等长久性美容的效果。
4.然而，聚乳酸属于一种疏水性较强的材料，很难在水溶液中复溶，分散性差，容易聚集沉降。这就导致在皮内注射时容易堵针、注射时使用较粗针头导致患者疼痛感增强、注射材料分布不均一、注射后容易出现皮下结节等问题。现阶段，常采用羧甲基纤维素钠(cmc)或者交联的透明质酸钠(ha)凝胶作为助悬剂来改善上述问题。羧甲基纤维素钠不是人体内源性物质，就其生物相容性而言，并非最佳选择。而且cmc作为聚乳酸产品的助悬试剂，一般需要较长时间的水化作用才能用于注射。交联的ha凝胶中不免会引入交联剂，而交联剂的去除则需要较长时间的透析过程，大大延长了整个工艺的操作时间。此外，和透明质酸这类人体内源性物质相比，聚乳酸微球这种硬度较强的材料经皮下注射后会被人体快速识别为异物，因此异物反应如红肿、发炎现象更为明显。对于敏感型人群来说，注射纯的聚乳酸类微球产品具有较大的风险。
5.例如：公开号为cn110051882a的专利中公开了一种聚乳酸微球的制备方法，通过将聚乳酸溶液与聚乙烯醇溶液混合，经高速剪切、冷冻干燥得到聚乳酸微球，但该方法制备的聚乳酸微球在水溶液中的分散性较差、复溶时间长，一般需要提前2天进行复溶后才能进行注射；申请号为cn201410438010.3公开了一种注射用聚乳酸微球和交联透明质酸混合凝胶及其制备方法，但聚乳酸微球亲水性差，难以在透明质酸钠凝胶中分散均匀，也不利于在人体水环境中分散，注射后易结块，且有毒交联剂的引入降低了最终产品的安全性；公告号为cn105126166b的专利文件中公开了一种注射用含两亲性微球的透明质酸混合凝胶及其制备方法，在一定程度上解决了微球易分散、不易集结成块的问题，但交联剂1,4-丁二醇二
缩水甘油醚的引入降低了生物安全性，长时间透析除交联剂的过程也延长了整个反应工序。公告号为cn109010910b的专利文件中公开了一种可注射左旋聚乳酸微球的制备方法，通过将溶有左旋聚乳酸的有机溶液直接滴加到羧甲基纤维素钠/甘露醇的水溶液中，冷冻干燥后即得到可注射左旋聚乳酸微球，但该法制备的微球尺寸均一性不佳，且小分子类水相试剂对微球的分散稳定性也有待进一步加强。


技术实现要素：

6.本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种可注射型透明质酸钠包裹聚乳酸微球的制备方法，制成的透明质酸钠包裹聚乳酸微球，具有更好的生物相容性、更短的复溶时间和更好的稳定性，一方面，利用透明质酸本身良好的亲水性能，冻干的透明质酸钠包裹的聚乳酸微球可以很好的复溶在注射用水中，大大减少了复溶时间长、颗粒分散不均一等问题。另一方面，经透明质酸钠包裹的聚乳酸微球经皮下注射后，首先接触的是生物相容性更好的透明质酸钠，避免了与聚乳酸微球直接接触造成的刺激性更强的炎症现象。随着微球外层透明质酸钠的酶化降解，内层的聚乳酸微球就会暴露出来，进一步发挥刺激机体自身胶原蛋白生成的作用。
7.实现上述目的的技术方案是：一种可注射型透明质酸钠包裹聚乳酸微球的制备方法，包括以下步骤：
8.s1，水相制备步骤：将聚乙烯醇溶于水溶液中，70℃加热搅拌溶解，配成聚乙烯醇溶液，然后将聚乙烯醇溶液降至室温后，加入透明质酸钠粉末，搅拌混合均匀后，即得水相；
9.s2，油相制备步骤：将聚乳酸粉末溶于有机溶剂中，混合均匀，即为油相；
10.s3，微球制备步骤：在搅拌作用下，将步骤s2得到的油相逐滴滴加入步骤s1得到的水相中，于室温下搅拌形成乳浊液；
11.s4，后处理步骤：搅拌乳浊液至反应完成后，采用多次水洗离心的方法清洗乳浊液中的微球，冷冻干燥后得到透明质酸钠包裹的聚乳酸微球。
12.上述的一种可注射型透明质酸钠包裹聚乳酸微球的制备方法，步骤s1中，所述聚乙烯醇的分子量优选为20000～300000da，聚乙烯醇水溶液的浓度为0.3～2g/ml
13.上述的一种可注射型透明质酸钠包裹聚乳酸微球的制备方法，步骤s1中，所述透明质酸钠的分子量优选为400000～2000000da，水相中透明质酸钠的浓度优选为0.1～1.5g/ml。
14.上述的一种可注射型透明质酸钠包裹聚乳酸微球的制备方法，步骤s2中，所述聚乳酸粉末采用聚乙二醇(peg)改性的聚乳酸(pla)粉末；所述有机溶剂采用二氯甲烷或三氯甲烷。
15.上述的一种可注射型透明质酸钠包裹聚乳酸微球的制备方法，步骤s2中，所述聚乙二醇改性的聚乳酸粉末包括聚乙二醇改性的左旋聚乳酸(plla-peg)粉末、聚乙二醇改性的右旋聚乳酸(pdla-peg)粉末和聚乙二醇改性的外消旋聚乳酸(pdlla-peg)粉末。
16.上述的一种可注射型透明质酸钠包裹聚乳酸微球的制备方法，步骤s2中，所述聚乙二醇改性的聚乳酸粉末的分子量优选为10000-400000da，且其中聚乙二醇链段与聚乳酸链段的分子量之比优选为(5～500):1，油相中聚乳酸的浓度为0.005～1.0g/ml。
17.上述的一种可注射型透明质酸钠包裹聚乳酸微球的制备方法，步骤s3中，油相向
水相中滴加时的搅拌速度优选为100～1500rpm，搅拌反应时间优选为2～10h。
18.上述的一种可注射型透明质酸钠包裹聚乳酸微球的制备方法，步骤s4中，多次水洗离心的方法清洗微球的过程中，每次水洗离心所用的离心速度为优选为1000～6000rpm，离心时间优选为2min～20min。
19.本发明的可注射型透明质酸钠包裹聚乳酸微球的制备方法，直接将透明质酸钠引入水相中，利用乳化技术在聚乙二醇改性的聚乳酸微球表面包裹一层透明质酸钠，具有以下有益效果：
20.(1)现有制备的聚乳酸微球的制备方法最常用的是将聚乳酸溶于有机试剂中作为油相滴入含表面活性剂的水相溶液中，但制备出的聚乳酸微球由于其具有较强的疏水性，很难复溶于水溶液中，本技术中采用的是聚乙烯醇改性后的聚乳酸，大大改善了纯的聚乳酸亲水性差的缺陷，可以在一定程度上提高材料的复溶性和稳定性。另外，聚乳酸微球外层包裹的透明质酸钠具有优异的亲水性能，可以进一步缩短在水溶液中的复溶时间，提高微球在注射用水中的分散均一性和稳定性；
21.(2)聚乳酸微球外层包裹的是未交联的透明质酸钠，虽然交联后的透明质酸钠凝胶可以延长降解时间，但引入的交联剂无疑会增加毒性风险。本技术中选用的未交联的透明质酸钠的分子量经大量实验筛选确定，其完全降解需要的时间远远长于微球在水溶液中的复溶时间，因此无需担心透明质酸钠包裹的聚乳酸微球在复溶过程中就降解完全而导致聚乳酸微球重新分散不均一的情况。此外，pla-peg分子中的聚乙二醇链段可以通过抑制血浆蛋白、酶等物质在peg表面的黏附，在一定程度上抑制ha的降解，并可以提高微球的稳定性；
22.(3)透明质酸钠包裹的聚乳酸微球外层的透明质酸钠具有良好的生物相容性，经皮下注射后，机体最先接触到的是微球外层的透明质酸钠，生物安全性高，极大的降低了硬度较强的聚乳酸微球对机体的刺激性，并且透明质酸钠本身的补水保湿性能又可以在一定程度上改善皮肤的水合状态。在透明质酸酶的作用下，微球外层的透明质酸钠逐渐降解，聚乙二醇改性的聚乳酸微球彻底暴露，开始刺激皮下胶原蛋白的再生；
23.(4)通过乳液法制备透明质酸钠包裹的聚乳酸微球与注射用水复溶后，易于注射，可用作面部填充剂，减少面部皱纹，重焕肌肤的弹性和活力，且维持时间长、对皮肤无刺激作用。本发明的操作工艺简单，易于控制，产品质量稳定，可用于产业化生产。
附图说明
24.图1为实施例1制备的透明质酸钠包裹的聚乳酸微球复溶在注射用水中5h后，在显微镜下观察到的图片；
25.图2为实施例2制备的透明质酸钠包裹的聚乳酸微球复溶在注射用水中5h后，在显微镜下观察到的图片；
26.图3为实施例3制备的透明质酸钠包裹的聚乳酸微球复溶在注射用水中5h后，在显微镜下观察到的图片；
27.图4为实施例4制备的透明质酸钠包裹的聚乳酸微球复溶在注射用水中5h后，在显微镜下观察到的图片。
具体实施方式
28.为了使本技术领域的技术人员能更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图对其具体实施方式进行详细地说明：
29.实施例1
30.一种可注射型透明质酸钠包裹聚乳酸微球的制备方法，包括以下步骤：
31.s1，水相制备步骤：取1.0g分子量为47000da的聚乙烯醇溶于99.0g注射用水中，70℃加热搅拌溶解，配成浓度为1％的聚乙烯醇溶液。聚乙烯醇水溶液降至室温后，向其中加入0.5g分子量为1600000da的透明质酸钠粉末，搅拌混合均匀，即得水相；
32.s2，油相制备步骤：取0.1g plla-peg粉末(plla分子量为20000da，peg分子量为2000da)溶解于4ml二氯甲烷中，搅拌混合均匀后即得浓度为0.025g/ml的聚乳酸有机试剂溶液，即为油相；
33.s3，微球制备步骤：在250rpm的搅拌速度下，将步骤s2得到的油相用注射器逐滴滴加入步骤s1得到的水相中，于室温下搅拌形成乳浊液，继续反应5h；
34.s4，后处理步骤：反应完成后，多次水洗离心清洗微球，其中每次离心转速为4000rpm，离心时间为10min。最后冷冻干燥得到透明质酸钠包裹的聚乳酸微球。
35.请参阅图1，将冻干的透明质酸钠包裹的聚乳酸微球复溶在注射用水中，剧烈晃动混匀后静置。5h后在光学显微镜下观察，聚合物微球的尺寸在20～50μm，且微球并未聚集，分散良好，结果如图1所示。
36.实施例2
37.一种可注射型透明质酸钠包裹聚乳酸微球的制备方法，包括以下步骤：
38.s1，水相制备步骤：取0.5g分子量为205,000da的聚乙烯醇溶于99.5g注射用水中，70℃加热搅拌溶解，配成浓度为0.5％的聚乙烯醇溶液。聚乙烯醇水溶液降至室温后，向其中加入0.7g分子量为1200000da的透明质酸钠粉末，搅拌混合均匀后，即得水相；
39.s2，油相制备步骤：取0.25g plla-peg粉末(plla分子量为200000da，peg分子量为4000da)溶解于4ml二氯甲烷中，搅拌混合均匀后即得浓度为0.0625g/ml的聚乳酸有机试剂溶液，即为油相；
40.s3，微球制备步骤：在500rpm的搅拌速度下，将步骤s2得到的油相用注射器逐滴滴加入步骤s1得到的水相中，于室温下搅拌形成乳浊液，继续反应4h；
41.s4，后处理步骤：反应完成后，多次水洗离心清洗微球，其中每次离心转速为4500rpm，离心时间为12min。最后冷冻干燥得到透明质酸钠包裹的聚乳酸微球。
42.请参阅图2，将冻干的透明质酸钠包裹的聚乳酸微球复溶在注射用水中，剧烈晃动混匀后静置。5h后在光学显微镜下观察，聚合物微球的尺寸在15～25μm，且微球并未聚集，分散良好，结果如图2所示。
43.实施例3：
44.一种可注射型透明质酸钠包裹聚乳酸微球的制备方法，包括以下步骤：
45.s1，水相制备步骤：取1.5g分子量为85,000da的聚乙烯醇溶于98.5g注射用水中，70℃加热搅拌溶解，配成浓度为1.5％的聚乙烯醇溶液。聚乙烯醇水溶液降至室温后，向其中加入1.0g分子量为720,000da的透明质酸钠粉末，搅拌混合均匀后，即得水相；
46.s2，油相制备步骤：取0.3g plla-peg粉末(plla分子量为100,000da，peg分子量为
1500da)溶解于3ml二氯甲烷中，搅拌混合均匀后即得浓度为0.1g/ml的聚乳酸有机试剂溶液，即为油相；
47.s3，微球制备步骤：在150rpm的搅拌速度下，将步骤s2得到的油相用注射器逐滴滴加入步骤s1得到的水相中，于室温下搅拌形成乳浊液，继续反应6h；
48.s4，后处理步骤：反应完成后，多次水洗离心清洗微球，其中每次离心转速为3500rpm，离心时间为15min。最后冷冻干燥得到透明质酸钠包裹的聚乳酸微球。
49.请参阅图3，将冻干的透明质酸钠包裹的聚乳酸微球复溶在注射用水中，剧烈晃动混匀后静置。5h后在光学显微镜下观察，聚合物微球的尺寸在20～35μm，且微球并未聚集，分散良好，结果如图3所示。
50.实施例4：
51.一种可注射型透明质酸钠包裹聚乳酸微球的制备方法，包括以下步骤：
52.s1，水相制备步骤：取1.0g分子量为150,000da的聚乙烯醇溶于99.0g注射用水中，70℃加热搅拌溶解，配成浓度为1％的聚乙烯醇溶液。聚乙烯醇水溶液降至室温后，向其中加入1.5g分子量为600,000da的透明质酸钠粉末，搅拌混合均匀后，即得水相；
53.s2，油相制备步骤：取0.1g plla-peg粉末(plla分子量为50,000da，peg分子量为1000da)溶解于5ml二氯甲烷中，搅拌混合均匀后即得浓度为0.02g/ml的聚乳酸有机试剂溶液，即为油相；
54.s3，微球制备步骤：在250rpm的搅拌速度下，将步骤s2得到的油相用注射器逐滴滴加入步骤s1得到的水相中，于室温下搅拌形成乳浊液，继续反应5h；
55.s4，后处理步骤：反应完成后，多次水洗离心清洗微球，其中每次离心转速为4500rpm，离心时间为15min。最后冷冻干燥得到透明质酸钠包裹的聚乳酸微球。
56.请参阅图4，将冻干的透明质酸钠包裹的聚乳酸微球复溶在注射用水中，剧烈晃动混匀后静置。5h后在光学显微镜下观察，聚合物微球的尺寸在25～45μm，且微球并未聚集，分散良好，结果如图4所示。
57.本发明的可注射型透明质酸钠包裹聚乳酸微球的制备方法，采用的是聚乙烯醇改性后的聚乳酸，大大改善了纯的聚乳酸亲水性差的缺陷，可以在一定程度上提高材料的复溶性和稳定性。另外，聚乳酸微球外层包裹的透明质酸钠具有优异的亲水性能，可以进一步缩短在水溶液中的复溶时间，提高微球在注射用水中的分散均一性和稳定性；聚乳酸微球外层包裹的是未交联的透明质酸钠，其完全降解需要的时间远远长于微球在水溶液中的复溶时间，因此无需担心透明质酸钠包裹的聚乳酸微球在复溶过程中就降解完全而导致聚乳酸微球重新分散不均一的情况；此外，pla-peg分子中的聚乙二醇链段可以通过抑制血浆蛋白、酶等物质在peg表面的黏附，在一定程度上抑制ha的降解，并可以提高微球的稳定性；聚乳酸微球外层的透明质酸钠具有良好的生物相容性，经皮下注射后，机体最先接触到的是微球外层的透明质酸钠，生物安全性高，极大的降低了硬度较强的聚乳酸微球对机体的刺激性，并且透明质酸钠本身的补水保湿性能又可以在一定程度上改善皮肤的水合状态。在透明质酸酶的作用下，微球外层的透明质酸钠逐渐降解，聚乙二醇改性的聚乳酸微球彻底暴露，开始刺激皮下胶原蛋白的再生；通过乳液法制备透明质酸钠包裹的聚乳酸微球与注射用水复溶后，易于注射，可用作面部填充剂，减少面部皱纹，重焕肌肤的弹性和活力，且维持时间长、对皮肤无刺激作用。本发明的操作工艺简单，易于控制，产品质量稳定，可用于产
业化生产。
58.综上所述，本发明的可注射型透明质酸钠包裹聚乳酸微球的制备方法，通过乳化技术，可以制备一系列尺寸可控、颗粒均匀、生物相容性强的可注射型透明质酸钠包裹的聚乳酸微球；透明质酸钠包裹后的聚乳酸微球在水溶液中复溶时间短，微球分散均匀，可注射效果好，不良反应小；此外，本发明的制备方法工艺步骤简单，适合工业应用的大量制备。
59.本技术领域中的普通技术人员应当认识到，以上的实施例仅是用来说明本发明，而并非用作为对本发明的限定，只要在本发明的实质精神范围内，对以上所述实施例的变化、变型都将落在本发明的权利要求书范围内。

技术特征：
1.一种可注射型透明质酸钠包裹聚乳酸微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：s1，水相制备步骤：将聚乙烯醇溶于水溶液中，70℃加热搅拌溶解，配成聚乙烯醇溶液，然后将聚乙烯醇溶液降至室温后，加入透明质酸钠粉末，搅拌混合均匀后，即得水相；s2，油相制备步骤：将聚乳酸粉末溶于有机溶剂中，混合均匀，即为油相；s3，微球制备步骤：在搅拌作用下，将步骤s2得到的油相逐滴滴加入步骤s1得到的水相中，于室温下搅拌形成乳浊液；s4，后处理步骤：搅拌乳浊液至反应完成后，采用多次水洗离心的方法清洗乳浊液中的微球，冷冻干燥后得到透明质酸钠包裹的聚乳酸微球。2.根据权利要求1所述的一种可注射型透明质酸钠包裹聚乳酸微球的制备方法，其特征在于，步骤s1中，所述聚乙烯醇的分子量优选为20000～300000da，聚乙烯醇水溶液的浓度为0.3～2g/ml。3.根据权利要求1所述的一种可注射型透明质酸钠包裹聚乳酸微球的制备方法，其特征在于，步骤s1中，所述透明质酸钠的分子量优选为400000～2000000da，水相中透明质酸钠的浓度优选为0.1～1.5g/ml。4.根据权利要求1所述的一种可注射型透明质酸钠包裹聚乳酸微球的制备方法，其特征在于，步骤s2中，所述聚乳酸粉末采用聚乙二醇改性的聚乳酸粉末；所述有机溶剂采用二氯甲烷或三氯甲烷。5.根据权利要求4所述的一种可注射型透明质酸钠包裹聚乳酸微球的制备方法，其特征在于，步骤s2中，所述聚乙二醇改性的聚乳酸粉末包括聚乙二醇改性的左旋聚乳酸粉末、聚乙二醇改性的右旋聚乳酸粉末和聚乙二醇改性的外消旋聚乳酸粉末。6.根据权利要求4所述的一种可注射型透明质酸钠包裹聚乳酸微球的制备方法，其特征在于，步骤s2中，所述聚乙二醇改性的聚乳酸粉末的分子量优选为10000-400000da，且其中聚乙二醇链段与聚乳酸链段的分子量之比优选为(5～500):1，油相中聚乳酸的浓度为0.005～1.0g/ml。7.根据权利要求1所述的一种可注射型透明质酸钠包裹聚乳酸微球的制备方法，其特征在于，步骤s3中，油相向水相中滴加时的搅拌速度优选为100～1500rpm，搅拌反应时间优选为2～10h。8.根据权利要求1所述的一种可注射型透明质酸钠包裹聚乳酸微球的制备方法，其特征在于，步骤s4中，多次水洗离心的方法清洗微球的过程中，每次水洗离心所用的离心速度为优选为1000～6000rpm，离心时间优选为2min～20min。

技术总结
本发明公开了一种可注射型透明质酸钠包裹聚乳酸微球的制备方法，通过乳液法制备透明质酸钠包裹的聚乳酸微球，一方面，利用透明质酸本身良好的亲水性能，冻干的透明质酸钠包裹的聚乳酸微球可以很好的复溶在注射用水中，大大减少了复溶时间长、颗粒分散不均一等问题。另一方面，经透明质酸钠包裹的聚乳酸微球经皮下注射后，首先接触的是生物相容性更好的透明质酸钠，避免了与聚乳酸微球直接接触造成的刺激性更强的炎症现象。随着微球外层透明质酸钠的酶化降解，内层的聚乳酸微球就会暴露出来，进一步发挥刺激机体自身胶原蛋白生成的作用。此外，本发明的制备方法工艺步骤简单，适合工业应用的大量制备。业应用的大量制备。业应用的大量制备。


技术研发人员：郭家宏 方伟 王飞飞 马骁 郭振宇
受保护的技术使用者：云南云科特色植物提取实验室有限公司 美达丝（上海）生物科技有限公司
技术研发日：2023.03.29
技术公布日：2023/7/18