一种检测非洲猪瘟病毒的PCR引物及其应用

一种检测非洲猪瘟病毒的pcr引物及其应用
技术领域
1.本发明属于病原检测技术领域，具体涉及一种检测非洲猪瘟病毒(african swine fever virus,asfv)的pcr引物，本发明还涉及所述引物在检测asfv中应用，可用于鉴别asfv的基因型。


背景技术：

2.非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒(african swine fever virus,asfv)感染引起猪的一种高度传染性疾病，以急性、热性、出血性、高发病率和高死亡率为临床特征，又被称为非洲猪瘟疫或疣猪病。该病是世界动物卫生组织(woah)要求法定报告的动物疫病之一，我国将其列为一类动物疫病。1921年本病首次报道于肯尼亚，便一直存在于撒哈拉以南的非洲国家，1957年先后流传至西欧和拉美国家，因扑灭及时未造成巨大的影响，但仍流行于葡萄牙、意大利的撒丁岛和西班牙的西南部。
3.不同的asfv毒力差异较大，引起的临床症状也不尽相同。并且临床症状与猪的品种、健康状况、暴露途径、感染剂量和当地流行状况有关。其中高毒力毒株感染潜伏期在5-15d，且伴随高热症状，发病后5-7d死亡，死亡率高达100％；中等毒力毒株发病急，但存在一定的耐过率；而感染低毒力毒株的猪只大多无临床症状或症状不明显。
4.历史上，非洲猪瘟主要存在于非洲大陆，目前非洲大陆内部存在已知的24种基因型的毒株，非洲大陆以外只有基因i型和基因ii型的毒株。目前国内存在基因ⅰ型和基因ⅱ型两种不同基因型的asfv，且两种基因型毒株均存在不同程度的缺失或变异，导致不同毒株间毒力差异较大，引起的临床症状也不相同。
5.由于asf目前无有效疫苗，为防止该病的传播，需依赖于疫病发生后的快速处理，而这则依靠快速且可靠的诊断技术，这是控制和根除该病的重要保障。在临床中检测中，一定要区分不同基因型，通过快速鉴别分析基因型差异，可以进一步了解毒株在相应地区的分布以及流行趋势,追溯疫源及其可能的传播方式，以便及时采取应对措施。
6.目前报道的区分基因ⅰ型和基因ⅱ型两种不同的基因型asfv的方法主要为：一是针对基因b646l基因(p72蛋白)的扩增测序方法，该方法需要经过测序，仪器要求高，周期较长，测序费用贵，且当样品中有多个毒株存在，只能测序出一种毒株。二是针对ep402r基因(cd2v蛋白)的鉴别方法，但ep402r基因为高变基因，目前中国农业科学院哈尔滨兽医研究所国家非洲猪瘟参考实验室报道临床中存在部分缺失该基因的毒株，故该方法有较大局限性。另外还有一种方法为通过两对引物和两个探针检测基因ⅰ型和ⅱ型的asfv，用b646l基因的通用引物和探针判断样品是否为asfv感染，而e183l基因的引物和探针是针对基因ⅰ型特有的，所以该方法通过特异性扩增e183l基因来区分基因ⅰ型和ⅱ型毒株，但只有检测到b646l基因时才可以判断检测样品是否为asfv阳性，且该方法对重组质粒的最低检测拷贝数分别为1.07
×
102copies/μl和3.13
×
104copies/μl，敏感性较低，易出现漏检问题。


技术实现要素：

7.本发明针对现有技术存在的缺陷，开发了一种之前从未报道的asfv检测位点，针对该位点设计的引物不仅能鉴别asfv，而且能快速便捷地区分asfv不同基因型(基因ⅰ型和基因ⅱ型)，并可进行定量。
8.为实现上述目的，本发明的技术方案具体如下：
9.申请人通过对目前ncbi中可查询的asfv全基因组序列及本实验室获得的asfv序列进行大量比对和反复验证，发现在asfv毒株mgf505-9r与mgf505-10r之间存在一段非常稳定的非编码区，不同基因特征的asfv均稳定存在此非编码区，且基因ⅰ型和基因ⅱ型的asfv在此区域表达不同。故本发明基于primer premier 6分析其片段差异区域并设计检测引物如下：
10.mgf505-9r-10r-f：caggctaattgtaaatagttg(seq id no.1)
11.mgf505-9r-10r-r：aactaatgtattagcagaact(seq id no.2)
12.利用上述引物对asfv的dna进行扩增，其中基因ⅱ型的asfv可扩增出331bp的片段大小，其目标片段序列为：
13.caggctaattgtaaatagttgtagataccatataatgaatgttttattaggatagtag
14.ttcagttaagatagtagtttagttaagatagtagtttagttaagatagtagttatgtt
15.aagatagtagttctgttaagataatagtttagttaaaactagttcatgttaagttaat
16.agttttgttaagacaatagttcatttaagtcaatagttcagttaagtcaatagtttt
17.gttaagtcaatagtttagttaagtcaatagtttagttaagtcaatagtttagttaagtcaatagttatattaagacattagttctgctaatacattagtt(seq id no.3)
18.而基因ⅰ型的asfv可扩增出241bp的片段大小，其目标片段序列为：caggctaattgtaaatagttgtagataccatataatgaatgttttattaggatagtagttaatagtttagttaagacagtagttctttctgttaagatagtagttctgttaagatagtagtttagttatgatagtggtttagttaagacaatagttttgttaagacagtagttctgttaagtcaatagttcagttaagtcaatagttttgttaagtcaatagttctgctaatacattagtt(seq id no.4)
19.基于差异基因的扩增，可鉴别asfv并区分基因ⅰ型和基因ⅱ型两种不同的基因型。
20.进一步地，本发明利用所设计的pcr引物建立了一种sybr green pcr检测方法，该方法包括以下两个步骤：
21.步骤一，以提取的样本dna为模板，用上述引物使用sybr green荧光染料法扩增，收集荧光信号，观察ct值。该步骤可通过ct值的大小判定样本中是否含有非洲猪瘟病毒，从而判定病毒阴阳性。经试验验证，所设计的引物除asfv阳性样品外，与其它样品如猪圆环病毒ⅱ型(pcv2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)、猪流行性腹泻病毒(pedv)、盖塔病毒(getv)均未发生特异性扩增，说明引物特异性较好。
22.步骤二，取扩增阳性(上步中扩增有ct值)的pcr产物，加入琼脂糖凝胶板加样孔中，外加2000dna marker作为分子量参照物，进行琼脂糖凝胶电泳，使用凝胶成像仪观察并记录结果。该步骤可根据扩增条带的大小进一步鉴定基因ⅰ型和基因ⅱ型的asfv，若扩增条带为241bp(低于250bp)为基因ⅰ型毒株，若扩增条带为331bp(高于250bp)为基因ⅱ型毒株。
23.本发明可用的检测方法不局限于所提供的荧光染料法，以上述所提供的检测位点和引物为基础，由此衍生的其它一系列以pcr原理为基础的检测方法都在本发明的保护范
围之内。
24.本发明建立的方法既可用于非洲猪瘟病的临床诊断，又能用于以非临床诊断为目的的非洲猪瘟病毒实验室筛查鉴定。该方法具有准确性高，特异性、重复性好等特点，可以准确、快速、高效的检测到asfv并区分基因ⅰ型和基因ⅱ型两种不同的基因型。其中，对基因ⅰ型和基因ⅱ型asfv标准质粒的最低检测浓度均为1copies/μl，对基因ⅰ型和基因ⅱ型asfv病毒的检测下限均为1个tcid
50
。
25.更详尽的技术方案参见具体实施例。
附图说明
26.图1：本发明设计的引物对基因ⅰ型毒株和基因ⅱ型毒株的核酸扩增条带。
27.图2：asfvⅰ和asfvⅱ的阳性质粒构建谱图。
28.图3：本发明构建的方法对不同基因型asfv的琼脂糖凝胶电泳鉴定结果。
29.图4：本发明检测asfv的特异性试验结果。
30.图5：普通pcr法检测asfv不同基因型标准质粒的灵敏性试验结果。
31.图6：sybr green法检测asfv不同基因型标准质粒的灵敏性试验结果。
32.图7：sybr green法检测asfv基因ⅰ型病毒的灵敏性试验结果。
33.图8：sybr green法检测asfv基因ⅱ型病毒的灵敏性试验结果。
具体实施方式
34.以下结合具体实施例对本发明进一步详细说明。
35.对不同基因型的asfv基因进行比较，发现在mgf505-9r与mgf505-10r之间不同基因型间存在稳定性差异，导致该基因片段的表达不同，研究还发现该非编码区在asfv基因组中非常稳定，不同基因特征的asfv均存在此非编码区。
36.因此该片段有望作为区分基因ⅰ型和基因ⅱ型的靶基因，本研究基于此设计了一对pcr扩增引物，该引物敏感性好，特异性强，能准确鉴别asfv及其不同基因型。接着利用该引物开发了一套荧光染料pcr方法，经临床验证，与woah推荐使用的探针法定量pcr结果一致，其阳性样品的定量扩增产物可直接使用琼脂糖凝胶电泳鉴定其片段长度，根据其片段长度不同鉴定其基因型。在基因ⅰ型毒株中该片段长241bp，在基因ⅱ型毒株中该片段长331bp。将扩增产物测序分析，测序结果与设计目的片段基因序列相同。
37.部分实验材料和操作方法如下：
38.(1)毒株
39.本研究所用asfv毒株均来自本实验室分离，并保存于华中农业大学动物生物安全三级实验室。
40.(2)核酸提取方法
41.本研究用到的核酸提取试剂盒购自于天根生化科技有限公司，具体操作如下：
42.a.取200μl病毒液加入20μl得蛋白k，混匀；
43.b.加入200μlgb，冲股份颠倒混匀，70℃放置10min，简短离心；
44.c.加入200μl无水乙醇，立即振荡混匀15s(可能出现絮状沉淀)，简短离心；
45.d.摆放吸附柱，将上述溶液转移至吸附柱中，12000rpm离心30s，弃废液；
46.e.在吸附柱中加入500μlgd(已加入无水乙醇的)，12000rpm离心30s，弃废液；
47.f.在吸附柱中加入600μl漂洗液pw(已加入无水乙醇得)，12000rpm离心30s，弃废液；
48.g.重复操作f
49.h.12000rpm离心2min，弃废液，置室温放置2min左右以晾干吸附柱内的漂洗液；
50.i.将吸附柱转入干净的ep管内，向吸附柱中央内膜上悬空滴加50-200μl洗脱缓冲液te，室温放置2-5min，12000rpm离心2min；
51.j.将离心所得的液体重新滴加到吸附柱内膜上，重复操作i；
52.k.将产物置于4℃保存备用。
53.(3)不同基因型asfv-mgf505质粒的构建
54.使用本研究设计的引物分别扩增本实验室分离的基因ⅰ型毒株核酸和基因ⅱ型毒株核酸，扩增可见基因ⅰ型样品在241bp处出现扩增条带，基因ⅱ型样品在331bp处出现扩增条带(如图1)；分别使用biomiga gel/pcr extraction kit(胶/pcr产物回收试剂盒)回收基因ⅰ型和基因ⅱ型扩增的dna目的片段。
55.使用t4 dna ligase(2001a)和pmd
tm
18-t vector cloning kit(6011)两个试剂盒分别将扩增回收的基因ⅰ型和基因ⅱ型dna目的片段链接在pmd18-t载体上(如图2)，连接后的产物转化至dh5α感受态细胞。
56.转化完成后，分别挑取基因ⅰ型和基因ⅱ型的较大的克隆重组菌落，接种于含有氨苄抗生素的5ml lb液体培养基，置于37℃摇床中过夜培养，设置180r/min。将过夜培养的菌液按照质粒提取试剂盒操作说明进行重组质粒的提取。本研究用到的质粒提取试剂盒购自于天根生化科技有限公司。
57.实施例1荧光定量pcr检测方法的建立
58.1.引物序列：
59.mgf505-9r-10r-f：caggctaattgtaaatagttg
60.mgf505-9r-10r-r：aactaatgtattagcagaact
61.2.检测步骤：
62.(1)使用吸附柱法或磁珠法提取组织、血液、环境等样品中的病毒dna；
63.(2)以提取的dna为模板，用上述引物使用sybr green荧光染料法扩增，扩增条件如表1，观察扩增ct值，从而判定是否含有非洲猪瘟病毒，判定病毒阴阳性；
64.(3)取扩增阳性(上步中扩增有ct值)的pcr产物5μl，加入1.5％琼脂糖凝胶板加样孔中，外加5μl 2000 dna marker作为分子量参照物，180v电泳至加样板2/3处，使用凝胶成像仪观察，记录结果(如图3)；
65.(4)若扩增条带为241bp(低于250bp)为基因ⅰ型毒株，若扩增条带为331bp(高于250bp)为基因ⅱ型毒株。
66.步骤(2)中所述的扩增体系为：
67.表1pcr反应体系
68.成分体积(μl)2
×
sybrgreenmix10.0上游引物(10μmol/l)0.90
下游引物(10μmol/l)0.90模板5.0ddh2o3.2总体积20.0
69.其中，所述的反应条件为：
70.95℃预变性3min；95℃变性15s，61.4℃延伸30s，收集荧光信号，循环40次。
71.3.反应温度、引物浓度的优化
72.为进一步确定最佳退火温度，分别采用55-65℃的八个温度区间进行pcr扩增。根据结果显示，使用不同退火温度验证后，可见退火温度为61.4℃时扩增效率最高，故最佳退火温度为61.4℃(表2)。
73.表2退火温度优化
[0074][0075][0076]
分别以10μmol/l的引物浓度0.1μl、0.2μl、0.3μl、0.4μl、0.5μl、0.6μl、0.7μl、0.8μl、0.9μl、1.0μl进行pcr反应，确定最佳引物使用量。根据结果显示，引物在使用浓度为10μmol/l时0.9μl体积的ct值最低，效果最好(表3)。
[0077]
表3不同引物浓度优化
[0078][0079]
实施例2检测效果评价
[0080]
1.特异性验证
[0081]
按照sybr greenⅰ荧光定量反应体系，分别使用猪圆环病毒ⅱ型(pcv2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)、猪流行性腹泻病毒(pedv)、盖塔病毒(getv)，asfvⅰ型和asfvⅱ型阳性样品，以depc水为阴性对照，验证引物特异性。
[0082]
根据结果显示，除asfv阳性样品外，其它样品均未特异性扩增(如图4)。
[0083]
2.灵敏度验证
[0084]
将标准质粒以1
×
10
10
为初始拷贝数进行10倍比稀释，用普通pcr进行对比，结果可见图5，普通pcr能检测到基因ⅰ型标准质粒最低浓度为1
×
109copies/μl，基因ⅱ型质粒检测的最低浓度为1
×
107copies/μl。
[0085]
将标准质粒以1
×
10
10
copies/μl为初始拷贝数进行10倍比稀释，用本方法分别对构建的标准质粒进行定量扩增后进行琼脂糖凝胶电泳，结果可见图6，本方法能检测到基因ⅰ型标准质粒和基因ⅱ型质粒检测的最低浓度均为1copies/μl。
[0086]
以200个tcid
50
、100个tcid
50
、50个tcid
50
、10个tcid
50
、5个tcid
50
、1个tcid
50
浓度的病毒为模板进行荧光定量pcr仪检测，并设置阴性对照，每个浓度做三次重复，以s型荧光曲线出现时作为最低检测浓度。从检测结果可以看出，asfvⅰ型荧光定量pcr方法检测下限为1个tcid
50
(图7)，asfvⅱ型荧光定量pcr方法检测下限为1个tcid
50
(图8)。
[0087]
3.重复性验证
[0088]
随机选取不同比例稀释后的三个asfvⅰ型和asfvⅱ型病毒进行三次重复实验，并计算平均值、标准差和变异系数。根据结果可知asfvⅰ型三次扩增ct值的变异系数小于1.2％，asfvⅱ型三次扩增ct值的变异系数小于1.0％，同一浓度试验组误差均不到1个循环。表明所构建的方法具有较高的可重复性，具体可见表4。
[0089]
表4.sybr greenⅰ实时荧光pcr的不同浓度ct值重复性分析
[0090][0091]
4.临床样品检测
[0092]
对收集到100份临床样品，用所建立的sybr green荧光定量pcr方法进行检测，分别与woah和国家标准方法对比。
[0093]
《陆生动物卫生法典》(woah)中推荐的方法如下：
[0094]
(1)核酸提取
[0095]
采用dna提取试剂盒对各类样本进行病毒核酸提取。
[0096]
(2)引物和探针
[0097]
taqman探针引物检测asfv的b646l基因(编码p72蛋白)
[0098]
上游引物qpcr-f：5
′‑
ctgctcatggtatcaatcttatcga-3
′
[0099]
下游引物qpcr-r：5
′‑
gataccacaagatcagccgt-3
′
[0100]
taqman探针qpcr-probe：fam-ccacgggaggaataccaacccagtg-tamra
[0101]
(3)核酸扩增体系如表5所示
[0102]
表5.扩增体系
[0103]
成分体积(μl)premixextaq
tm
(probeqpcr)10.0forwardprimer(10μm)0.4reverseprimer(10μm)0.4probe(10μm)0.2模板dna2.0rnasefreedh2o7.0总体积20.0
[0104]
(4)扩增程序
[0105]
woah推荐方法扩增程序为95℃5min；95℃10sec、60℃30sec、45个循环，收集fam荧光信号。
[0106]
(5)试验成立条件
[0107]
ct值≤38判断为asfv阳性，无ct值判断为阴性；38＜ct值＜40判为asfv疑似，需要进行二次检测，若复检结果ct值仍＜40则判定为阳性，否则判为阴性。
[0108]
《非洲猪瘟诊断技术》国家标准(gb/t 18648-2020)中荧光pcr方法如下：
[0109]
(1)核酸提取
[0110]
采用dna提取试剂盒提取各类样本中的病毒核酸，详细参考实验材料(2)；每次提取的核酸至少包括一个阳性对照和一个阴性对照。阳性对照为asfv核酸阳性样品，阴性对照为无核酸酶水。
[0111]
(2)引物和探针
[0112]
针对asfv b6464l基因的保守序列设计了一对引物和探针。
[0113]
上游引物vp72-f1：5
′‑
gctttcaggatagagatacagctct-3
′
[0114]
下游引物vp72-r1：5
′‑
ccgtagtggaagggtatgtaagag-3
′
[0115]
taqman探针vp72-t1：fam-ccgtaactgctcatggtatcaatcttatcg-bhq1
[0116]
(3)核酸扩增
[0117]
每个样品配置18μl荧光pcr反应混合液，组成如表6所示。
[0118]
表6.扩增体系
[0119]
成分体积(μl)荧光pcr预混液(2
×
)10.0vp72-f1(10μmol/l)0.8vp72-r1(10μmol/l)0.8vp72-t1(10μmol/l)0.5无核酸酶水5.9核酸2.0总体积20.0
[0120]
每次荧光pcr扩增时均设置阴、阳性及空白对照。阴阳性对照均来自于样品，空白对照则用无核酸酶水为模板。加入模板后密封pcr扩增管，进行瞬时离心；将所有pcr扩增管放入荧光pcr仪中。
[0121]
(4)扩增程序
[0122]
扩增条件：50℃孵育2min；95℃预变性5min；95℃变性15s，58℃退火延伸1min，45个循环，在每一个循环的58℃时收集fam荧光信号。
[0123]
(5)试验成立条件
[0124]
阳性对照的ct值＜30且出现特异性扩增曲线，阴性对照无ct值或阴性对照的ct值≥40且无特异性扩增曲线，试验成立结果有效；否则重新进行试验。
[0125]
被检样品ct值≤38且出现特异性扩增曲线，则判定为asfv核酸阳性；当无ct值或ct值≥40，则判定为asfv核酸阴性；当38＜ct值＜40且出现特异性扩增曲线，则判定为疑似，对疑似样品模板量加倍(4.0μl dna模板)进行3个重复，有2个ct值＜40且出现特异性扩增曲线判定为asfv阳性，否则判定为阴性。
[0126]
结果显示100份样品中，有47份检测结果为阳性与woah和国家标准方法检测的结果一致，如表7。使用本方法扩增阳性的47份产物电泳分析，其中基因ⅰ型毒株样品有3株，基因ⅱ型样品有44株。同时对阳性样品使用测序方法扩增b646l基因(p72蛋白)，测序分析，结果与本研究鉴定结果一致，但常规测序检测方法仅能鉴定22份强阳性样品(ct值低于30的样品)，存在一定的局限性(表8)，表明本研究方法使用范围更广，且更便捷区分基因ⅰ型和基因ⅱ型毒株样品。
[0127]
表7.不同方法对asfv阴阳性检测结果对比
[0128][0129][0130]
表8.不同方法对asfv不同基因型鉴定结果对比
[0131]

技术特征：
1.一种检测非洲猪瘟病毒(african swine fever virus,asfv)的pcr引物，包括正向引物和反向引物，所述引物的核苷酸序列分别如seq id no.1和seq id no.2所示。2.权利要求1所述的pcr引物在非诊断目的检测非洲猪瘟病毒中的应用。3.权利要求1所述的pcr引物在制备检测非洲猪瘟病毒的试剂盒中的应用。4.一种检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于：该试剂盒中包含权利要求1所述的pcr引物。5.一种非诊断目的检测非洲猪瘟病毒的方法，其特征在于：该方法包括利用权利要求1所述的引物对样本核酸进行pcr扩增的步骤。6.如权利要求5所述检测非洲猪瘟病毒的方法，其特征在于：所述pcr扩增的体系中含有荧光染料。7.如权利要求6所述检测非洲猪瘟病毒的方法，其特征在于：所述pcr扩增的体系如下：成分体积(μl)2
×
sybr green mix10.0上游引物(10μmol/l)0.90下游引物(10μmol/l)0.90样本核酸5.0ddh2o3.2总体积20.0。8.如权利要求6所述检测非洲猪瘟病毒的方法，其特征在于：所述pcr扩增的程序为95℃预变性3min；95℃变性15s，61.4℃延伸30s，循环40次。9.如权利要求5所述检测非洲猪瘟病毒的方法，其特征在于：还包括将阳性扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳的步骤，并根据扩增条带的大小鉴定asfv的基因型。

技术总结
本发明公开了一种检测非洲猪瘟病毒(African Swine fever virus,ASFV)的PCR引物，包括正向引物和反向引物，所述引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，本发明还公开了所述引物在检测非洲猪瘟病毒中的应用以及一种检测非洲猪瘟病毒的方法，该方法准确性高，特异性、重复性好，可以准确、快速、高效的检测到ASFV并区分基因Ⅰ型和基因Ⅱ型两种不同的基因型。型两种不同的基因型。型两种不同的基因型。


技术研发人员：何启盖 于学祥 吴昊蔚 李栋凡 陈晓雨 许谦
受保护的技术使用者：华中农业大学
技术研发日：2023.03.27
技术公布日：2023/7/18