一种可防治家禽葡萄球菌病的葡萄球菌噬菌体及其应用的制作方法

1.本发明涉及生物技术领域，具体为一种可防治家禽葡萄球菌病的葡萄球菌噬菌体及其应用。


背景技术：

2.家禽葡萄球菌病主要是由金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)引起的一种急性或慢性传染病，它对于鸡的危害性特别大,是非常容易造成鸡死亡的一种传染性疾病。在临床上常表现多种类型，如关节炎、腱鞘炎、脚垫肿、脐炎和葡萄球菌性败血症等，给养禽业造成较大的损失。鸡葡萄球菌病是一种易感传染性疾病，因此必须加强对鸡葡萄球菌病的研究和防治工作，加强对它的重视程度，找出防治措施和方法，避免鸡葡萄球菌病给养殖带来更大的伤害，从而造成更大的经济财产损失。
3.近年来，噬菌体被广泛用于防治细菌感染并取得了优异的成果。其杀菌的高效性和专一性使其在临床使用上表现出极大地优势，诸多的研究表明葡萄球菌噬菌体在防治葡萄球菌对家禽造成的感染中具有良好的应用前景。
4.申请cn 102417896 a公开了一种金黄色葡萄球菌的噬菌体及其应用，该噬菌体直接喷涂于固体食品表面，或混合于含菌食品中，用于抑制食品中的金黄色葡萄球菌。
5.现有金黄色葡萄球菌噬菌体大多用于食品领域或者奶牛乳房炎治疗，而未见报道用于家禽养殖中控制葡萄球菌病。发明提出一种可防治家禽葡萄球菌病的葡萄球菌噬菌体gsa-p12，为家禽葡萄球菌病的防治提供了一种新的生物防控措施。


技术实现要素：

6.针对现有技术存在的不足，本发明目的在于提供了一株金黄色葡萄球菌噬菌体gsa-p12，所述噬菌体的保藏编号为cctcc no：m 2022725。本发明的另一个目的在于提供了金黄色葡萄球菌噬菌体在制备防治关节炎型葡萄球菌病生物药物中的应用。
7.为了实现上述目的，本发明是通过如下的技术方案来实现：一种可防治家禽葡萄球菌病的葡萄球菌噬菌体，包括葡萄球菌噬菌体gsa-p12，申请人自湖北某养鸡场附近水样中筛选出一株金黄色葡萄球菌噬菌体，该噬菌体已于2022年05月26日送至中国典型培养物保藏中心保藏，保藏地址为：中国武汉武汉大学，保藏编号：cctcc no：m 2022725，分类命名：金黄色葡萄球菌噬菌体(staphylococcus aureus phage)gsa-p12。
8.进一步的，所述葡萄球菌噬菌体gsa-p12具有常规金黄色葡萄球菌噬菌体的形态特性，且具备很高的发酵活力，当发酵体系中噬菌体接种终浓度为3.2
×
107pfu/ml，宿主菌终浓度为2.9
×
108cfu/ml，28℃发酵12h后，发酵液效价可达到3.7x10
11
pfu/ml。
9.本发明的有益效果：
10.1.该可防治家禽葡萄球菌病的葡萄球菌噬菌体gsa-p12不仅发酵效率高，可用于大规模工业发酵生产，其对家禽关节炎型葡萄球菌病具有良好的治疗作用，可有效降低家禽葡萄球菌引起的关节感染，提高存活率。
11.2.该可防治家禽葡萄球菌病的葡萄球菌噬菌体及其应用为治疗葡萄球菌病提供了一种安全、无毒副作用且可大规模发酵生产的生物防控措施。
具体实施方式
12.为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
13.实施例1：金黄色葡萄球菌噬菌体gsa-p12分离纯化
14.采集湖北某葡萄球菌发病鸡场附近水样8份，每份30ml。将水样5000rpm离心10min后取15ml上清液过滤除菌，取滤液10ml与10ml 2
×
tsb液体培养基及1ml处于对数期的金黄色葡萄球菌菌液(108cfu/ml)均匀混合，于37℃下180rpm过夜培养，富集噬菌体。将样本富集液5000rpm离心10min，取上清液过0.22μm的微孔滤膜除菌得到含有噬菌体的滤液。取滤液1ml与其宿主金黄色葡萄球菌菌液500ul均匀混合，静置15min使其与细菌表面的受体充分结合。将上述混合液加入7ml冷却至50℃的tsb半固体琼脂培养基，混匀后立即铺于已凝固的tsa平板上，待琼脂凝固后于37℃倒置培养8-12h，观察噬菌斑生长情况。在形成噬菌斑的双层平板上，用无菌枪头挑取大而透亮的噬菌斑，于1ml sm液中振荡解吸附后过0.22μm的微孔滤膜除菌得噬菌体滤液，将滤液接种于5ml tsb液体培养基中，加入100ul过夜活化的宿主金黄色葡萄球菌菌液并混匀，37℃下180rpm过夜培养，5000rpm离心10min取上清过0.22μm的微孔滤膜，滤液采用双层平板法观察噬菌斑形态。重复操作3-5次后，即可得形状和大小一致的噬菌斑。
15.自湖北某鸡场水样中分离得到金黄色葡萄球菌噬菌体gsa-p12。该噬菌体在金黄色葡萄球菌菌苔上产生单一的圆形噬菌斑，中心透亮，直径约为1mm。该噬菌体已于2022年05月26日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：金黄色葡萄球菌噬菌体(staphylococcus aureus phage)gsa-p12，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：cctcc no：m 2022725。
16.实施例2：金黄色葡萄球菌噬菌体gsa-p12最佳发酵条件测定
17.挑取宿主金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)单个菌落，接种到盛有3ml tsb培养液的试管中，37℃摇床中180rpm振荡培养12h，得到宿主菌悬液。将菌悬液以1:100比例转接到l0ml tsb培养液，37℃180rpm振荡培养至对数前期。将噬菌体gsa-p12及其宿主葡萄球菌分别稀释至一定的浓度并计数，按照不同的比例混合培养，加入tsb液体培养基使各管总体积相同。每个浓度比例准备四份，分别于25℃、28℃、32℃和37℃温度环境中180rpm振荡培养12h。培养结束后将发酵液进行6000g离心l0min并收集上清，将上清液过0.22μm的微孔滤膜后采用双层平板法计数。各点均作双份复管培养取平均值，以产生最高噬菌体效价的条件为最佳发酵条件。实验重复3次。
18.结果如表1所示，当噬菌体gsa-p12浓度为3.2
×
107pfu/ml，宿主菌浓度为2.9
×
108cfu/ml，发酵温度为28℃时，噬菌体gsa-p12发酵效价达到最高3.7x10
11
pfu/ml。
19.表1不同感染复数下葡萄球菌噬菌体的效价
[0020][0021]
实施例3：葡萄球菌噬菌体gsa-p12的温度稳定性试验
[0022]
取若干支无菌15ml离心管，各加入9ml tsb后置于相应温度的恒温水浴中，待温度平衡后分别加入1ml噬菌体纯培养液，于4℃、25℃、37℃、45℃、55℃、65℃、75℃、85℃的温度中分别作用1h、2h、12h、24h、48h和72h。作用时间结束后取出样品管并立即置于室温水浴冷却，经适当稀释后采用双层平板法测定噬菌体效价。各点均作双份复管培养取平均值，实验重复3次。
[0023]
结果如表2所示，葡萄球菌噬菌体gsa-p12在温度为45℃以下活性基本保持不变，在55℃水浴24h后仍有较高的效价，在4-45℃具有良好的稳定性，可长期保存。
[0024]
表2葡萄球菌噬菌体于不同温度下存放不同时间后的效价(起始效价：3.5x10
9 pfu/ml)
[0025][0026]
实施例4:葡萄球菌噬菌体gsa-p12对葡萄球菌裂解范围试验
[0027]
取效价为5.6x10
9 pfu/ml葡萄球菌噬菌体gsa-p12原液，10倍倍比稀释至10-4
，分别取原液及10-3
和10-4
三个浓度采用点滴法来测定噬菌体的裂解谱。
[0028]
挑取分离自临床的36株鸡源金黄色葡萄球菌单克隆、12株缓慢葡萄球菌单克隆、5株产色葡萄球菌单克隆，分别接种于盛有3ml tsb的离心管中，37℃180rpm培养12h，制得各株细菌菌悬液。分别取1ml菌悬液与tsb半固体培养基混合铺于已制备好的tsa平板上，各取5ul噬菌体培养液及稀释液点滴于平板上。待自然风干后37℃培养12-16h，观察结果。试验重复三次。
[0029]
结果如表3所示，该噬菌体原液可裂解36株鸡源金黄色葡萄球菌中的32株，稀释液可裂解36株鸡源金黄色葡萄球菌中的29株(裂解率为80.6％)，12株缓慢葡萄球菌可裂解6株(裂解率为50％)、5株产色葡萄球菌可裂解2株(裂解率为40％)，并且结合原液及稀释液裂解效果，可推测该噬菌体可能含有噬菌体裂解酶类可抑菌或杀菌的物质。通过裂解谱测定发现，该噬菌体裂解谱广，在防治葡萄球菌引起的感染方面具有极大的应用潜力。
[0030]
表3葡萄球菌噬菌体gsa-p12裂解谱测定结果
[0031]
[0032]
[0033][0034]
“‑”
表示不裂解；“+”表示裂解，裂解斑模糊；“++”表示裂解，裂解斑清晰。
[0035]
实施例5：噬菌体gsa-p12发酵制备：
[0036]
挑取宿主葡萄球菌单个菌落，接种到盛有3ml tsb培养液的试管中，37℃摇床中180rpm振荡培养12h，得到宿主菌悬液。将菌悬液以1:100比例转接到500ml tsb培养液中，37℃180rpm振荡培养至对数前期并测定其菌悬液浓度。发酵制备的体系为6l，发酵培养基为tsb培养基。采用火焰接种法接种，以其最佳的发酵条件向发酵罐中接入噬菌体和宿主菌。发酵过程中通入无菌空气，并加入3
‰
消泡剂，发酵制备时间为12h。待发酵结束后，将噬菌体与宿主菌的全部混合液自取样口取出接入无菌容器中，6000rpm离心15min，取上清液经真空抽气泵抽滤至无菌过滤器装置内，得到噬菌体发酵液于4℃下保存。
[0037]
由表4可知，噬菌体gsa-p12在28℃条件下发酵12h后，效价可高达5.6x10
11
pfu/ml。因此，利用发酵法进行噬菌体的大规模工业制备是切实可行的，为该噬菌体的工业生产和推广应用提供切实可行的方法。
[0038]
表4 金黄色葡萄球菌噬菌体gsa-p12的发酵动态
[0039]
接入噬菌体终浓度接入宿主菌终浓度发酵温度发酵液效价
6.1
×
107pfu/ml5.5
×
107cfu/ml28℃5.6
×
10
11
pfu/ml
[0040]
实施例6：噬菌体gsa-p12对雏鸡关节炎型葡萄球菌病的防治作用
[0041]
选取60只3日龄肉雏鸡，随机分成3组(空白组、攻毒组和治疗组)，每组20只，预饲3天后治疗组腿部关节给予108cfu/kg的金黄色葡萄球菌和109pfu/kg噬菌体，攻毒组给予108cfu/kg的金黄色葡萄球菌，空白组给予等量pbs缓冲液。治疗组自攻毒之日起连续三天给予噬菌体治疗。治疗结束观察3天后剖检全部鸡只，结果见表5。
[0042]
表5结果显示：金黄色葡萄球菌噬菌体gsa-p12可有效防治家禽葡萄球菌病，降低感染家禽关节葡萄球菌携带率，提高存活率。
[0043]
表5 噬菌体对葡萄球菌病治疗效果
[0044]
分组数量(只)肿褪率带菌率存活率空白组2000100％治疗组2005％100％攻毒组2085％100％65％
[0045]
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
[0046]
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

技术特征：
1.一种可防治家禽葡萄球菌病的葡萄球菌噬菌体，其特征在于：包括葡萄球菌噬菌体gsa-p12，申请人自湖北某养鸡场附近水样中筛选出一株金黄色葡萄球菌噬菌体，该噬菌体已于2022年05月26日送至中国典型培养物保藏中心保藏，保藏地址为：中国武汉武汉大学，保藏编号：cctccno：m2022725，分类命名：金黄色葡萄球菌噬菌体(staphylococcusaureusphage)gsa-p12。2.根据权利要求1所述葡萄球菌噬菌体的应用，其特征在于：使用以保藏编号为cctccno：m2022725的金黄色葡萄球菌噬菌体为有效成分或唯一有效成分制备成家禽口服生物药物，应用于家禽葡萄球菌病的防控。

技术总结
本发明提供一种可防治家禽葡萄球菌病的葡萄球菌噬菌体，包括葡萄球菌噬菌体GSA-P12，申请人自湖北某养鸡场附近水样中筛选出一株金黄色葡萄球菌噬菌体，该噬菌体已于2022年05月26日送至中国典型培养物保藏中心保藏，保藏地址为：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCCNO：M2022725，分类命名：金黄色葡萄球菌噬菌体(staphylococcusaureusphage)GSA-P12，该葡萄球菌噬菌体GSA-P12应用于家禽葡萄球菌病的防控，可用于大规模工业发酵生产，其对家禽关节炎型葡萄球菌病具有良好的治疗作用，可有效降低家禽葡萄球菌引起的关节感染，提高存活率，为治疗葡萄球菌病提供了一种安全、无毒副作用且可大规模发酵生产的生物防控措施。且可大规模发酵生产的生物防控措施。


技术研发人员：王喜亮 张秀玲 黄金梅 徐岳 田甲 罗莉莉 张晓东
受保护的技术使用者：权利要求书1页说明书8页
技术研发日：2023.03.21
技术公布日：2023/7/18