一种通过胚挽救获得水曲柳与白蜡种间杂交F1代的方法

一种通过胚挽救获得水曲柳与白蜡种间杂交f1代的方法
技术领域
1.本发明属于生物技术育种领域，具体涉及一种通过胚挽救获得水曲柳与白蜡种间杂交f1代的方法。


背景技术：

2.水曲柳(fraxinusmandshuricarupr.)别名大叶梣、东北梣，是木犀科(oleacee)白蜡属(fraxinus)的高大落叶乔木。水曲柳主要分布于我国北部，与胡桃楸，黄菠萝并称为“三大硬阔”，目前作为国家储备林计划的二级保护树种，是东北地区的主要造林和用材树种，但在生产中还存在着“大小年现象”影响种子产量，有性、无性繁殖效率低、在组培繁殖过程中又存在极易休眠老化等瓶颈问题，严重阻碍了水曲柳无性规模化繁殖的生产，严重限制了水曲柳良种的推广利用。
3.白蜡树(fraxinuschinensisroxb.)为落叶乔木，耐瘠薄干旱，在轻度盐碱地也能生长。植株萌发力强，材理通直，生长迅速，柔软坚韧，供编制各种用具，并有较高药用价值。
4.在自然界中，林木杂种优势广泛存在，是林木杂交育种的主要研究热点，杂种优势的产生机制是杂交产生了基因重组，使得杂交子代表现出多种多样超出亲本的性状。林木杂交育种具有同时聚合出父本和母本的优良的性状的优点，可以通过杂交的手段有目的性的培育出优良的杂交子代，并从中筛选出良种，这样可以极大的扩充林木种质资源。
5.有研究表明，以新疆的大叶白蜡、天津的绒毛白蜡、北京的大叶白蜡、小叶白蜡、绒毛白蜡、盘锦的绒毛白蜡为父本，花粉经过高压静电场处理后，与水曲柳进行杂交，从而获得杂交种，对于获得的杂交种子多采用播种或者是对成熟胚进行培养的方式进行繁殖，对未成熟的杂交胚或者是败育、退化的胚的研究还未见报道。
6.远缘杂交中获得的合子胚在早期发育阶段容易出现败育或退化或畸形胚等现象。为了防止育种效率的降低，通过对未成熟的胚离体培养进行胚挽救，使得植物胚在适宜的离体培养条件下获得再生植株，在植物育种中具有十分重要的理论与实践意义。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种通过胚挽救获得水曲柳与白蜡种间杂交f1代的方法，解决了水曲柳和白蜡之间远缘杂交中胚的畸形、幼胚败育、未成熟胚无法获得杂种植株等问题。
8.为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案为：
9.一种通过胚挽救获得水曲柳与白蜡种间杂交f1代的方法，包括如下步骤：
10.(1)父本花粉的获取：父本选择赤峰地区的白蜡树，在4月下旬-5月初期间，观察雄花即将散粉时，采集白蜡花枝，温室水培，收集散落的花粉，4℃保存；
11.(2)花粉活力检测：用fda染色花粉后，在荧光显微镜下观察花粉活力；
12.(3)母本的选择：选择哈尔滨地区本土优良水曲柳作为母本；
13.(4)母本花枝套袋：在5月初，雌花花芽膨大到刚刚伸出时，用杂交袋套住花枝，最
顶端的雌花与曲别针封口端保持3-5cm的距离时，将杂交袋开口端收紧后用绳子将杂交袋与枝条绑紧；
14.(5)人工授粉：在雌花伸出约3-5cm、柱头发亮时进行授粉，打开曲别针封口端，用毛笔蘸取有活力的花粉轻轻涂抹到雌花柱头上，授完粉后再用曲别针封好口，并将标有序号的吊牌挂在对应枝条上；
15.(6)摘袋：待水曲柳雄花花粉完全散去后，一般为人工授粉完成后7-10d，将杂交袋摘下；(7)无菌胚珠的获取：授粉后35d开始取样，流水冲洗2-4h后转移至紫外消毒后的超净台中，在无菌条件下，对杂交果实进行消毒，先用75％酒精短暂浸泡果实10-15s，倒去废液，无菌水冲洗干净后用2％-3％naclo溶液浸泡10-15min，倒去废液后用灭菌后的蒸馏水冲洗5次，每次3-5min，在超净工作台中用无菌镊子扒去杂交杂交果实的果皮，获得无菌胚珠；
16.(8)胚挽救离体培养：在无菌条件下，将(7)中的胚珠接种在发育培养基中，置于25
±
2℃环境下，黑暗培养7-8周，胚珠逐渐发育成熟；
17.(9)胚的萌发培养：将(8)中培养的胚珠转移至弱光条件下培养，光照强度为10μmol
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，光周期12h/d，温度25
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2℃，培养10-15d，子叶长出并转绿；
18.(10)胚的二次萌发培养：对(9)中没有萌发的胚顶端切个斜口后转入胚的二次萌发培养基中，光照强度为80μmol
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，光周期12h/d，温度25
±
2℃，培养10-15d，子叶长出并转绿；
19.(11)幼苗培养：将(9)和(10)中长出子叶的胚转移至幼苗生长培养基中，光照强度为80μmol
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，光周期12h/d，温度25
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2℃，20-25d，获得幼苗；
20.(12)幼苗移栽：当步骤(9)得到的幼苗长至2-3对复叶时从培养基中取出，清洗根部后移栽到育苗盘中，透明盖子覆盖保湿，置于温室中培养，两周后揭开盖子。
21.上述方案中，步骤(7)所述胚珠取自授粉后35-117d的果实。
22.上述方案中，步骤(8)所述胚珠发育培养基为：以wpm为基本培养基，添加30-60g/l的蔗糖、5.4-6.0g/l的琼脂、1.5g/l的活性炭，不同浓度的激素组合：0.1-2.0mg/l的6-ba、0.5-2.0mg/l的kt、1-5.0mg/l的iaa、1-5.0mg/l的0.5-2.0ga3，培养基的ph值为5.8-6.0。上述方案中，步骤(10)所述胚的二次萌发培养基为：以wpm为基本培养基，添加30-60g/l的蔗糖、5.4-6.0g/l的琼脂、1.5g/l的活性炭，不同浓度的激素组合：0.2-1.0mg/l的6-ba、0.05-0.5mg/l的naa、0.2-1mg/l的zt、0.5-2mg/l的ga3，培养基的ph值为5.8-6.0。上述方案中，步骤(11)所述的幼苗生长培养基为wpm基本培养基，幼苗培养时间为20-25d。上述方案中，步骤(12)所述幼苗植株的移栽种植方法为：将步骤(11)中得到的杂交植株从培养基中取出，洗净附着在根部表面的培养基，将其移栽到育苗盘中，移栽基质为草炭土：蛭石：沙子＝2：1：1，装入育苗盘中，浇透水，温室中培养，设置温度25～28℃、光周期12h/d、湿度60％、光照强度80μmol
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，每天透气30min，2周后将盖子完全打开，3d浇一次水。
23.本发明的有益效果：
24.(1)本发明选用了优良材质的水曲柳作为母本和抗逆速生的白蜡树作为父本进行远缘杂交，利用幼胚挽救技术克服了种间杂交导致的胚畸形、幼胚败育、未成熟胚无法获得杂种植株导致的胚败育而无法获得杂交f1代植株的问题。
25.(2)本发明通过选择合适的幼胚挽救接种时期和离体诱导培养条件，杂种幼胚经过两次离体培养可诱导萌发，幼苗经炼苗移栽后获得杂种植株，本发明方法克服了水曲柳
与白蜡种间杂交的不亲和性，通过离体诱导培养获得杂种植株，杂种植株可通过无性繁殖和长期保存，优良株系可以推广应用，也为水曲柳品种进一步改良提供新种质；
26.(3)本发明提供了一套完整的利用胚挽救技术获得水曲柳与白蜡远缘杂交后代的方法，该方法对丰富水曲柳品种的遗传基础、优化育种技术都具有积极作用。
附图说明
27.图1为水曲柳
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白蜡杂交的果实。
28.图2为水曲柳
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白蜡杂交的胚珠。
29.图3为水曲柳
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白蜡杂交的胚珠培养后子叶长出变绿。
30.图4为水曲柳
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白蜡杂交的胚珠培养后获得的植株，左边第1棵为水曲柳苗，右边4棵为水曲柳
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白蜡杂交f1代苗。
具体实施方式
31.为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
32.实施例：
33.一种通过胚挽救获得水曲柳与白蜡种间杂交f1代的方法，包括：
34.基本培养基为wpm培养基，以下培养基于121℃，1.1mpa条件下灭菌20mim。
35.(a)胚珠培养的发育培养基为wpm+60g/l蔗糖+6g/l琼脂+1.5g/l活性炭+表1中的激素；(b)胚的二次萌发培养基为wpm+30g/l蔗糖+6g/l琼脂+1.5g/l活性炭+表2中的激素；
36.(c)幼苗生长培养基为wpm+30g/l蔗糖+6g/l琼脂。
37.(1)父本花粉的获取：父本选择赤峰市区的白蜡树，在4月下旬-5月初期间，观察雄花即将散粉时，采集白蜡花枝，温室水培，收集散落的花粉，4℃保存；
38.(2)花粉活力检测：将冷藏的花粉用fda染色，在荧光显微镜下观察花粉形态，并统计花粉活力，选择花粉活力在20％以上的花粉进行后续杂交实验；
39.(3)母本的选择：选择哈尔滨市区内本土优良水曲柳作为母本，树龄在30年以上；
40.(4)母本花枝套袋：在5月初，雌花花芽膨大到刚刚伸出时，用杂交袋套住花枝，最顶端的雌花与曲别针封口端保持3-5cm的距离时，将杂交袋开口端收紧，后用绳子将杂交袋与枝条绑紧；
41.(5)人工授粉：在雌花伸出约3-5cm且柱头发亮时，天气晴朗时进行人工授粉，打开杂交袋上的曲别针封口端，用毛笔蘸取有活力的花粉轻轻涂抹到雌花柱头上，授完粉后再用曲别针将杂交袋封好口，并将标有序号的吊牌挂在对应枝条上；
42.(6)摘袋：待水曲柳雄花花粉完全散去后，一般为人工授粉完成后7-10d，将杂交袋摘下；
43.(7)无菌胚珠的获取：授粉后分别在35d、50d、68d、117d取样(图1)，流水冲洗2-4h后转移至紫外消毒后的超净台中，在无菌条件下，用75％酒精浸泡果实10-15s，倒去酒精后用无菌水冲洗3次，每次3-5min，再用2％-3％naclo溶液浸泡10-15min，倒去naclo溶液后用灭无菌水冲洗5次，每次3-5min，之后在无菌条件下用镊子扒掉杂交果实的果皮，获得胚珠(图2)；
44.(8)胚挽救离体培养：在无菌条件下，将(7)中的胚珠接种在发育培养基(a)中，置于25
±
2℃培养箱中，暗培养7-8周，胚珠逐渐发育成熟；
45.(9)胚的萌发培养：将(8)中培养的胚珠转移至弱光条件下培养，光照强度为10μmol
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，光周期12h/d，温度25
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2℃，培养10-15d，子叶长出并转绿(图3)；此时统计胚挽救培养的萌发率(见表1)，结果显示6-ba为0.1mg/l，ga3为0.5mg/l时，kt为0.5或1.0mg/l、iaa为1.0或5.0mg/l时，胚的萌发率为100％；6-ba为0.2mg/l，iaa为3.0mg/l时，ga3为0或1.0mg/l、kt为1.0或2.0mg/l时，胚的萌发率也为100％；
46.表1胚珠发育培养时的培养基激素浓度及萌发率
47.培养基序号6-ba(mg/l)kt(mg/l)iaa(mg/l)ga3(mg/l)萌发率(％)1000077.8200.53.02.088.9 301.000.555.6 402.01.0033.3 5005.01.055.6 60.101.02.088.9 70.10.51.00.5100 80.11.05.00.5100 90.12.001.066.7 100.10.53.0055.6 110.205.00.588.9 120.20.501.055.6 130.21.03.01.0100 140.22.03.00100 150.21.01.02.088.9 161.003.02.066.7 171.00.55.01.055.6 181.01.01.0055.6 191.02.05.02.055.6 201.02.000.588.9 212.001.01.066.7 222.00.55.0088.9 232.01.002.077.8 242.02.03.00.577.8 252.02.05.02.088.9
48.(10)胚的二次萌发培养：将(9)中没有萌发的胚顶端切个斜口后转入胚的二次萌发培养基(b)中，光照强度为80μmol
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，光周期12h/d，温度25
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2℃，培养10-15d，子叶长出并转绿，此时统计胚的萌发率(见表2)，胚的二次萌发率为50％-80.58％，通过比较我们认为添加0.2mg/lnaa、0.5mg/lzt、1.0mg/lga3更适合胚的二次萌发培养。
49.表2胚的二次萌发培养基及萌发率
[0050][0051]
(11)幼苗培养：将(9)和(10)中长出子叶的胚转移至幼苗生长培养基(c)中，光照强度为80μmol
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，光周期12h/d，温度25
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2℃，20-25d，获得幼苗(图4)；
[0052]
(12)幼苗移栽：当步骤(11)得到的幼苗长至2-3对复叶时，从培养基中取出，清洗根部后移栽到育苗盘中，移栽基质为草炭土：蛭石：沙子＝2：1：1，装入育苗盘中，浇透水，温室中培养，设置温度25～28℃、光周期12h/d、湿度60％、光照强度80μmol
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，每天透气30min，2周后将盖子完全打开，3d浇一次水。
[0053]
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。

技术特征：
6.0。

技术总结
本发明公开了一种通过胚挽救获得水曲柳与白蜡种间杂交F1代的方法，选择赤峰地区的白蜡树作为父本，选择哈尔滨地区本土优良水曲柳作为母本，在5月初，对雌花进行套袋、人工授粉、摘袋，授粉后35d开始取样，果实表面消毒后扒掉果皮获得无菌胚珠，将胚珠接种在发育培养基中，置于25


技术研发人员：齐凤慧 孔繁秋 张开放 曹源 郭欣悦 詹亚光 曾凡锁 王文明 张永存 呼和木仁 贾树龙 李艳秋 纪玉存 于英杰
受保护的技术使用者：东北林业大学
技术研发日：2023.04.20
技术公布日：2023/7/18